培氟沙星均三唑硫醚類化合物抗增殖活性的3D-QSAR研究與分子設(shè)計(jì)

馮 惠，王曉輝，王 菊，馮長君

(徐州工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

氟喹諾酮藥物以喹啉-4-酮-3-羧酸為優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)的基本骨架，因其抗菌作用靶標(biāo)—拓?fù)洚悩?gòu)酶也是抗腫瘤藥物的重要作用靶點(diǎn)，由此可通過結(jié)構(gòu)修飾將其抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性. 胡國強(qiáng)等[1-2]課題組成功將氟喹諾酮C-3羧基被等排體如酰腙、唑雜環(huán)等所替代，可提高其抗腫瘤活性. 謝玉鎖等[3]利用藥效團(tuán)拼合原理，用均三唑雜環(huán)作為抗菌培氟沙星(Pefloxacin)C-3羧基的等排體，縮氨基硫脲作為等排體的優(yōu)化修飾基，成功合成12種培氟沙星C-3均三唑硫醚酮衍生物和12種培氟沙星C-3均三唑硫醚酮縮氨基硫脲衍生物，這24個(gè)化合物簡稱為“培氟沙星均三唑硫醚衍生物”. 他們采用MTT法測(cè)定了上述化合物對(duì)人白血病細(xì)胞(HL60)的體外抗增殖活性.

定量結(jié)構(gòu)?活性相關(guān) (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR)[4-10]是基于分子結(jié)構(gòu)，運(yùn)用數(shù)理及統(tǒng)計(jì)方法研究結(jié)構(gòu)與性能之間數(shù)量關(guān)系的學(xué)科. 徐光憲院士因其涉及化學(xué)的根本問題，曾稱其為21世紀(jì)化學(xué)的4個(gè)“世紀(jì)難題”之一. QSAR在預(yù)測(cè)化合物生物活性方面已成為化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境等學(xué)科的熱門領(lǐng)域. 在3D-QSAR中最為常用的是1988年Crameretal提出的比較分子力場分析(Comparative Molecular Field Analysis， CoMFA)方法[11-18]，由于引入分子結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)象信息，通常能夠獲得質(zhì)量更佳的QSAR模型. 本文基于CoMFA程序建立培氟沙星C-3均三唑硫醚衍生物對(duì)人白血病細(xì)胞(HL60)體外抗增殖活性(pM)[3]的3DQSAR模型，以揭示影響抗增殖活性的微觀結(jié)構(gòu)因素，探討抑制人白血病細(xì)胞(HL60)作用的分子機(jī)理.

1 研究對(duì)象

謝玉鎖等[3]合成的24種培氟沙星均三唑硫醚衍生物的分子基本結(jié)構(gòu)，見圖1. 其中取代基R、X見表1. 他們測(cè)定了上述化合物對(duì)人白血病細(xì)胞(HL60)的半數(shù)抑制濃度，以“IC50”表示，單位為μmol·L?1，其數(shù)值見表 1.

根據(jù)物理化學(xué)原理，化學(xué)反應(yīng)自由能變與體系平衡濃度為對(duì)數(shù)關(guān)系，故令：

24種合成化合物的pM數(shù)據(jù)見表1.

圖 1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子的基本結(jié)構(gòu)Fig. 1 Basic structure of pefloxacin isotriazole sulfide derivative molecules

2 建模方法

使用Tripos公司Sybylx2.1.1分子模擬軟件建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)人白血病細(xì)胞(HL60)體外抗增殖活性的3D-QSAR模型，使用的模塊包括 SYBYL、Sketch、Minimize、Databasealignment以及CoMFA的QSAR方法等.

2.1 化合物分子藥效構(gòu)象的確定及分子疊合一般采用分子能量最低的構(gòu)象代替藥效活性構(gòu)象. 使用 Sybylx2.1.1軟件中的 Sketch molecule模塊，先構(gòu)建24個(gè)培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子[3]和新設(shè)計(jì)5個(gè)分子的初始三維結(jié)構(gòu)；再通過Minimize模塊及Tripos力場，加Gasteiger-Huckel電荷以及把最大迭代次數(shù) (Max. Iterations)定為 1 000 等設(shè)置，對(duì)所有分子進(jìn)行分子力學(xué)能量最低優(yōu)化. 通過全構(gòu)象搜索得到能量最低構(gòu)象，并以此最低能量構(gòu)象作為分子疊合的生物活性構(gòu)象.

隨機(jī)選取分子3、9、16、22、23為測(cè)試集(Test set；含 22 號(hào)模板分子. 見表 1 中帶“*”的分子)，余下20個(gè)分子作為訓(xùn)練集(Training set，亦含22號(hào)分子). 所謂模板分子是指樣本中生物活性最強(qiáng)的分子. 以對(duì)HL60細(xì)胞體外抗增殖活性最強(qiáng)的22號(hào)為模板分子，基于原子契合的公共骨架疊合方式(即盡量保證所有疊合分子取向相同，使分子間相互重疊誤差最小)予以疊合. 即以22號(hào)分子中的公共骨架，運(yùn)用Align database模塊對(duì)訓(xùn)練集、測(cè)試集分別進(jìn)行疊合. 此二集的疊合圖見圖2，分子間密切重合，疊合效果良好.

2.2 CoMFA 模型的建立采用 Tripos標(biāo)準(zhǔn)力場，對(duì)訓(xùn)練集的疊合分子周圍每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)上的立體場(Steric，St)及靜電場 (Electrostatic，El)予以計(jì)算場能值. 以體外抗增殖活性為因變量，場能值為自變量，用偏最小二乘法 (Partial Least Squares，PLS)進(jìn)行建模. 首先采用逐一剔除法 (Leave-One-Out，LOO)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以獲交叉驗(yàn)證系數(shù)和最佳主成分?jǐn)?shù)N. 一是以衡量模型的預(yù)測(cè)能力，要求的模型，其可信度優(yōu)于95%，或然性小于5%；的模型，統(tǒng)計(jì)意義十分顯著[19].二是以最佳主成分?jǐn)?shù)N建立非交叉QSAR模型，獲得判定系數(shù)R2、估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差SD、統(tǒng)計(jì)方差比F. 最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢(shì)圖直觀反映立體場和靜電場對(duì)培氟沙星均三唑硫醚衍生物pM的貢獻(xiàn).

表 1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子結(jié)構(gòu)與抗增殖活性(pM)Tab. 1 The molecular structures and anti-liver cancer activity(pM) of pefloxacin isotriazole sulfide derivatives

圖 2 訓(xùn)練集與測(cè)試集的疊合圖Fig. 2 The plots of all the aligned molecules in training set(a)and test set(b)

3 結(jié)果與討論

3.1 訓(xùn)練集 pM的 CoMFA模型培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)HL60細(xì)胞體外抗增殖活性pM的3D-QSAR模型見表2，St.、Ele.分別代表立體場及靜電場對(duì)pM的貢獻(xiàn)率.

表 2 訓(xùn)練集 pM的 CoMFA 模型Tab. 2 The CoMFA model of training set for pM

模型質(zhì)量檢驗(yàn)如下：

(2) 非交叉驗(yàn)證部分：①判定系數(shù)檢驗(yàn). 根據(jù)一般的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn), 若要建立一個(gè)具有良好擬合性的QSAR 模型，其R2≥0.80[20]. 本研究R2=0.903＞0.80，顯示良好的相關(guān)性. 由于R2又稱為削減誤差比例，即該模型包含了影響pM的90.3%以上因素，尚有不足9.7%歸于隨機(jī)因素，故可用于pM的估算與預(yù)測(cè). ②顯著性檢驗(yàn). 在95%顯著水平下，訓(xùn)練集CoMFA模型的F臨界值為F0.05(4,15)=3.06. 所建模型的F是其11倍之多，表明模型規(guī)定的因果關(guān)系顯著.

(3)外部預(yù)測(cè)能力：利用訓(xùn)練集的3D-QSAR模型對(duì)測(cè)試集中分子的pM進(jìn)行預(yù)測(cè)，以檢驗(yàn)其外部預(yù)測(cè)能力. 對(duì)pM的預(yù)測(cè)值見表1，平均絕對(duì)預(yù)測(cè)誤差僅為0.152，與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)值非常吻合，呈現(xiàn)模型很好的外部預(yù)測(cè)能力.

3.2 訓(xùn)練集 CoMFA 等勢(shì)圖CoMFA 模型的三維等勢(shì)圖分為立體作用分布圖和靜電作用分布圖.

以化合物22為模板分子的pM的三維立體場等勢(shì)圖見圖3(a). 在縮氨基硫脲部位有2個(gè)綠色區(qū)域，該區(qū)域引入體積較大的取代基有助于提高化合物的抗增殖活性. 因此，1～12號(hào)化合物沒有縮氨基硫脲部分，其抗增殖活性都弱于相應(yīng)13～24化合物. 另外，在苯環(huán)的3,4-位之間有個(gè)黃色區(qū)域，該區(qū)域引入體積小的基團(tuán)會(huì)使化合物的抗增殖活性增強(qiáng). 例如 6、18 的 3,4-位為 OCH2，7、19 的 3,4-位為CH3O，其抗增殖活性均比2～5、14～17弱.

以化合物22為模板分子的pM的三維靜電場等勢(shì)圖見圖3(b). 在縮氨基硫脲部位有個(gè)靠近氨基中氫原子較大的藍(lán)色區(qū)域，以及靠近硫原子較小的藍(lán)色區(qū)域. 在此區(qū)域引入正電性基團(tuán)利于生物活性最強(qiáng). 因此，后12個(gè)化合物的抗增殖活性都強(qiáng)于(相應(yīng))前12個(gè)化合物. 在苯環(huán)的3,4-位之間有個(gè)紅色區(qū)域，此區(qū)域處引入負(fù)電性取代基有助于增強(qiáng)化合物的生物活性. 例如4-位上氟原子是最強(qiáng)的負(fù)電性基團(tuán)，故10號(hào)在前12個(gè)化合物中、22號(hào)在后12個(gè)化合物均有最強(qiáng)的抗增殖活性.

圖 3 CoMFA 模型的立體場與靜電場等勢(shì)圖Fig. 3 CoMFA contour maps. (a) steric field; (b) electrostatic field

此模型顯示立體場和靜電場對(duì)pM的貢獻(xiàn)分別為71.8%和28.2%，可見取代基的立體作用強(qiáng)于靜電作用2倍多. 即pM主要取決于取代基的立體場，即3,4-位引入小體積基團(tuán)的分子，與靶標(biāo)生物大分子提供的空穴很好契合，空間位阻小而利于提高對(duì)HL60細(xì)胞體外抗增殖活性. 其靜電作用一般包含庫侖力、氫鍵及配位. 3,4-位上體積較小的負(fù)電性基團(tuán)F具備與靶標(biāo)形成庫侖力、氫鍵及配位的必備條件，因此，10號(hào)分子在前12個(gè)分子、22號(hào)在后12個(gè)分子中均是最強(qiáng)的抗增殖活性.

3.3 分子設(shè)計(jì) QSAR研究目的之一是根據(jù)所建模型中隱含的影響生物活性的主要結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分子設(shè)計(jì). 由3.2節(jié)分析可知，在苯環(huán)的3,4-位上引入小體積的負(fù)電性基團(tuán)，有利于增強(qiáng)培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)HL60細(xì)胞體外抗增殖活性. 據(jù)此設(shè)計(jì)5個(gè)化合物(見表1中第25～29號(hào)化合物)，3D-QSAR模型給出的pM預(yù)測(cè)值在5.322～5.519之間，均優(yōu)于22號(hào)分子預(yù)測(cè)值(5.149).

4 結(jié)論

(1) 基于比較分子力場方法(CoMFA)建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)人白血病細(xì)胞(HL60)體外抗增殖活性的 3D-QSAR 模型：= 0.436，R2= 0.903，F(xiàn)=34.89，顯示優(yōu)良的魯棒性、擬合性和預(yù)測(cè)能力.

(2) CoMFA模型三維等勢(shì)圖顯示在苯環(huán)的3,4-位上引入小體積的負(fù)電性基團(tuán)，有利于增強(qiáng)培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)HL60細(xì)胞的抗增殖活性.據(jù)此設(shè)計(jì)的5個(gè)化合物，顯示較大的pM預(yù)測(cè)值，有待生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)確認(rèn).