董樺，杜書浩，榮兵

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193

滑膜炎是滑膜組織因急性創(chuàng)傷或慢性勞損等刺激導(dǎo)致的一種非感染性炎癥，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)局部疼痛、腫脹，活動(dòng)能力受限，嚴(yán)重影響患者的生活［1］?；ぱ椎陌l(fā)生與關(guān)節(jié)炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān)，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）作為促炎因子，能促使炎癥發(fā)生，加重患者關(guān)節(jié)功能障礙［2］。同時(shí)炎癥使體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）活化，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥，是各種炎癥性疾病治療的靶點(diǎn)。在膝骨關(guān)節(jié)炎組織中，NLRP3、Caspase-1 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低［3］。另外，阻斷NLRP3/Caspase-1 通路可下調(diào)Caspase-1、IL-1、IL-18蛋白表達(dá)，減輕呼吸道炎癥［4］。仙方活命飲出自《校注婦人良方》，具有清熱解毒、消腫潰堅(jiān)、活血止痛的功效，常用于膿皰瘡、癤腫、蜂窩組織炎、乳腺炎、化膿性扁桃體炎等屬熱毒實(shí)證者。研究顯示，仙方活命飲口服結(jié)合關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)可明顯縮短化膿性膝關(guān)節(jié)炎的治療療程［3］。但其對(duì)NLRP3/Caspase-1 通路及關(guān)節(jié)炎癥因子表達(dá)影響的研究未見報(bào)道。我們于2020年6月—2020年8月通過皮下注射脂多糖（LPS）法建立大鼠背部氣囊滑膜炎模型，觀察仙方活命飲對(duì)滑膜炎大鼠炎癥和氧化應(yīng)激水平的影響，并探討其與NLRP3/Caspase-1 通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD 大鼠95 只，雄雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定，按照3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。飼養(yǎng)條件：溫度22 ℃，濕度55%，12 h/12 h 光暗循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 仙方活命飲藥液 藥材飲片來自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。取白芷3 g、貝母6 g、防風(fēng)6 g、當(dāng)歸尾6 g、甘草節(jié)6 g、皂角刺（炒）6 g、穿山甲（炙）6 g、天花粉6 g、乳香6 g、沒藥6 g、金銀花9 g、陳皮9 g混合，常規(guī)方法煎煮，于恒溫水浴鍋中濃縮至含生藥2 g/mL。按照人和大鼠體表面積換算給藥劑量，則其低、中、高劑量分別對(duì)應(yīng)生藥含量4.6、9.2、18.4 g/kg。將藥液置于-20 ℃保存，給藥前復(fù)溫。

1.1.3 試劑與儀器 吲哚美辛片（每片25 mg）購(gòu)自臨汾奇林藥業(yè)有限公司，使用蒸餾水配置，現(xiàn)配現(xiàn)用。LPS 購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，使用無菌平衡鹽溶液配制成10 mg/mL 溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、TNF-α、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木精—伊紅（HE）染液購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）和β-actin鼠抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BCA 蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京中山金橋生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 鼠抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；Fax-20100型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)INStat 公司；尼康SMZ745 型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海普赫生物科技有限公司；ChemiDoc-MP 全能型凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 滑膜炎動(dòng)物模型制備 80 只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉，背部朝上固定于手術(shù)臺(tái)，用8%硫化鈉溶液脫去背部被毛備用。用鑷子挑起背部肩胛正中區(qū)皮膚，皮下注射20 mL 無菌空氣（0.22 μm 微孔濾膜過濾針筒內(nèi)空氣）形成氣囊；第3 天再次注射10 mL 無菌空氣，以維持氣囊，第6 天注射10 mL 無菌空氣后，接著向氣囊中注射LPS 20 μg/kg，待背部氣囊皮膚出現(xiàn)紅腫且大鼠出現(xiàn)瘙癢不安、撓耳舔足癥狀，證明造模成功［6］。另取15只大鼠作為對(duì)照組，按上述方法制備氣囊，于實(shí)驗(yàn)第6天向氣囊中注射等體積無菌平衡鹽溶液。

1.3 動(dòng)物分組與干預(yù) 將造模成功的75 只大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、吲哚美辛組、低、中、高劑量仙方活命飲組，每組各15 只，另取15 只正常大鼠作為對(duì)照組。吲哚美辛組給予5 mg/kg 吲哚美辛10 mL/kg 灌胃，低、中、高劑量仙方活命飲組分別給予含生藥4.6、9.2、18.4 g/kg 的仙方活命飲藥液10 mL/kg 灌胃，對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，于造模完成后，每天給藥1次，連續(xù)7 d。

1.4 標(biāo)本采集 各組最后一次給藥24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉處死，股動(dòng)脈取血，-80 ℃冰箱保存待用。將大鼠背部朝上固定于手術(shù)臺(tái)上，切開背部氣囊皮膚，用4 mL 無鈣鎂Hank"s 液灌洗氣囊，收集灌洗液，4 ℃冰箱保存待用。切取背部滑膜組織，每組取5 份滑膜組織放入4%多聚甲醛固定，用于HE 染色；其余滑膜組織放入凍存管中-80 ℃保存，用于Western blotting檢測(cè)。

1.5 氣囊滲出液量測(cè)算和灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 收集氣囊灌洗液于10 mL 帶刻度的試管中，準(zhǔn)確記錄灌洗液量，滲出液量=灌洗液量-4 mL。然后用移液器吸取0.02 mL 灌洗液，加入3%冰醋酸0.38 mL，生物顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞。

1.6 氣囊灌洗液中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、CAT、SOD、GSH檢測(cè) 采用ELISA法。取氣囊灌洗液，3 000 r/min離心15 min（離心半徑15 cm），取上清。使用ELISA試劑盒檢測(cè)MDA、CAT、SOD、GSH含量，按照試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自含量。

1.7 氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。取股動(dòng)脈血和氣囊灌洗液，以13 000 r/min 離心15 min，取上清。使用ELISA 試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6水平，按照試劑盒說明書操作。

1.8 滑膜組織病理檢查 采用HE 染色。取滑膜組織，加入梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)作約5 μm厚切片。HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取滑膜組織，加入蛋白提取液提取總蛋白，使用BCA 試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉。分別加入一抗（稀釋比例為1∶2 000），4 ℃孵育過夜。加入含辣根過氧化物酶的二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育2 h。使用ECL顯色試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析灰度值。以β-actin 為參照，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩間比較行SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組氣囊滲出液量和灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量比較 見表1。

表1 各組氣囊滲出液量和白細(xì)胞數(shù)量比較（±s）

表1 各組氣囊滲出液量和白細(xì)胞數(shù)量比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與仙方活命飲低劑量組相比，cP＜0.05；與仙方活命飲中劑量組相比，dP＜0.05。

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2.2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH 含量比較 見表2。

2.3 各組氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平比較 見表3。

2.4 各組滑膜組織病理特征情況 對(duì)照組滑膜組織規(guī)則，幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組滑膜細(xì)胞大量增生，滑膜組織紊亂并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)聚集，組織周邊可見缺損；吲哚美辛組滑膜組織細(xì)胞排列相對(duì)整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少；仙方活命飲低、中、高劑量組滑膜組織細(xì)胞排列逐漸整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)椎間減少，且高劑量組與吲哚美辛組相近。

2.5 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)比較 見表4。

表2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

表2 各組氣囊灌洗液中MDA、CAT、SOD、GSH含量比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與仙方活命飲低劑量組相比，cP＜0.05；與仙方活命飲中劑量組相比，dP＜0.05。

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表3 各組氣囊灌洗液和血清中TNF-α、IL-6水平比較（ng/L，-x±s））

表4 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組滑膜組織中TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與仙方活命飲低劑量組相比，cP＜0.05；與仙方活命飲中劑量組相比，dP＜0.05。

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3 討論

滑膜炎不僅導(dǎo)致滑膜組織受損，引起分泌液失調(diào)形成積液，加大關(guān)節(jié)承受壓力；同時(shí)炎癥因子刺激軟骨，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的正常功能，給患者帶來痛苦。本研究結(jié)果顯示，滑膜炎大鼠滑膜組織嚴(yán)重增生、結(jié)構(gòu)紊亂并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)聚集，表明滑膜炎大鼠的滑膜組織存在嚴(yán)重?fù)p傷；氣囊灌洗液中SOD、GSH 含量顯著降低，滲出液量顯著升高，灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 水平顯著升高，表明滑膜炎大鼠體內(nèi)炎癥因子水平嚴(yán)重增加，導(dǎo)致上述病理改變。

中醫(yī)認(rèn)為，滑膜炎的主要病機(jī)是氣血痹阻不通，筋脈關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)所致。抑制炎癥因子產(chǎn)生能夠改善動(dòng)物模型中滑膜炎大鼠關(guān)節(jié)疼痛及炎癥反應(yīng)［7］。目前，采用中醫(yī)辨證治療滑膜炎已取得顯著成果。趙澤軍等［8］報(bào)道，板藍(lán)根可降低氣囊滑膜炎滲出液中MDA 含量，提高血清SOD 水平，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，降低TNF-α等促炎介質(zhì)水平，具有明顯的抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。YANG 等［9］報(bào)道，白藜蘆醇可降低滑膜炎大鼠血清MDA 含量，提高SOD 活性，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛和抗炎、抗氧化活性。方婷婷［10］報(bào)道，仙方活命飲加減輔助布洛芬口服液治療能提高小兒髖關(guān)節(jié)滑膜炎的臨床療效，降低髖關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，仙方活命飲低、中、高劑量組背部灌洗液中SOD 和GSH 含量依次升高，滑膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸緩解；大鼠氣囊滲出液量、灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量、MDA、CAT 含量以及灌洗液和血清中TNF-α、IL-6 含量依次降低，提示仙方活命飲對(duì)滑膜炎大鼠有積極的治療作用。

NLRP3/Caspase-1通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路，NLRP3 抑制劑和Caspase-1 抑制劑均可降低促炎因子含量［11］。研究顯示，抑制NLRP3/Caspase-1 信號(hào)通路能夠抑制小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善缺血再灌注引起的心肌功能障礙［12］；下調(diào)NLRP3 表達(dá)可顯著減弱異氟醚對(duì)NLRP3 炎癥小體的激活，減少細(xì)胞中IL-18、IL-1 分泌［13］。SUN 等［14］報(bào)道，異丙酚可通過NLRP3 炎癥小體直接誘導(dǎo)Caspase-1 依賴的巨噬細(xì)胞焦亡。WANG 等［15］報(bào)道，豆蔻素可通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活，下調(diào)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、Caspase-1 水平，改善小鼠結(jié)腸炎。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，仙方活命飲低、中、高劑量組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-6、NLRP3 和Caspase-1 蛋白表達(dá)量依次降低，呈劑量依賴性，提示仙方活命飲可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路，降低炎癥因子TNF-α 和IL-6 表達(dá)，緩解滑膜炎大鼠滑膜組織損傷，減少背部滲出液。

綜上所述，仙方活命飲可降低炎癥因子表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解滑膜炎大鼠滑膜組織損傷，減少背部滲出液；其機(jī)制可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路相關(guān)，為臨床上使用仙方活命飲治療滑膜炎提供了理論依據(jù)。