驢骨膠原肽制備方法的初步建立及分子量檢測

付改玲，劉厚霞，王 娟，劉永清，李小波，夏 敏

（內(nèi)蒙古元本生物醫(yī)藥科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

我國是世界上驢存欄量最多的國家， 年存欄量約為1 000 萬頭。 驢的性情溫順、耐受力強(qiáng)、壽命長、采食量小，集藥、補(bǔ)、食三大功能于一體。 驢皮自古以來就有很高的藥用價(jià)值，是制作“國藥瑰寶”阿膠的主要原料。驢骨與驢皮含有同樣的骨膠原蛋白肽類物質(zhì)，具有與阿膠相同的補(bǔ)血養(yǎng)顏、調(diào)節(jié)腸胃功能、增強(qiáng)免疫力的功效［1-2］。 驢骨還具有強(qiáng)筋健骨、防治骨質(zhì)疏松癥等功效［3］。

目前， 動(dòng)物骨膠原蛋白提取方面的研究主要集中在牛、羊、雞、豬等動(dòng)物［4-5］，而驢骨膠原蛋白多肽的研究與產(chǎn)品開發(fā)尚處于空白階段。 隨著驢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展越來越受到人們的關(guān)注， 驢骨膠原肽產(chǎn)品的開發(fā)也成為提高驢產(chǎn)業(yè)附加值的一個(gè)重要方向。該研究旨在通過模擬人工胃腸環(huán)境，采用二級生物酶解技術(shù)提取驢骨膠原蛋白多肽， 并對其分子量進(jìn)行檢測， 以期為開發(fā)適合人體吸收分子量的驢骨膠原肽原料以及后續(xù)產(chǎn)品的研發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

驢骨，呼和浩特市蒙驢食品有限公司提供；胃蛋白酶（10 萬U/g）（貨號：9001-75-6）、胰蛋白酶（4 000 U/g）（貨號：T8151）、Tricine（貨號：T8190），購自北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白（貨號：PB10056），購自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；福林酚（貨號：73104861），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 丙烯酰胺（貨號：A108465-500 g）、N，N-亞甲基丙烯酰胺（貨號：M104026-25 g），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇（貨號：R049953-25 mL），羅恩試劑產(chǎn)品；Tris堿（貨號：Amresco 0497），BIOSHARP 產(chǎn)品；小分子蛋白預(yù)染Marker（貨號：26628），購自Thermo Scientific 公司；五水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉、酒石酸鉀、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R250、過硫酸銨、硫酸銨、無水乙醇、冰乙酸、尿素。

1.2 主要儀器設(shè)備

破骨機(jī)，膠體磨，骨泥磨，高壓滅菌鍋，培養(yǎng)箱，搖床，數(shù)顯恒溫水浴鍋，離心機(jī)，雙光束紫外分光光度計(jì)，TVE-1100 濃縮干燥機(jī)，BYGENE 電泳儀，超純水機(jī)，移液槍。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 驢骨的預(yù)處理 將新鮮的驢骨去除骨膜，剝?nèi)埩舻募∪狻⒅竞徒钅ぃ?jīng)過破骨機(jī)破碎為5 cm 左右的小骨渣后送清洗機(jī)清洗。 將清洗后的驢骨渣瀝干、稱重，于膠體磨和骨泥磨中制成驢骨泥（骨泥細(xì)度90～100 目），含水量60%～70%。 脫脂［6-7］：取一定量的骨泥，加入2 倍純化水，于高壓滅菌鍋內(nèi)高溫高壓熬煮（121 ℃、45 min），去除上油層。 脫鈣［8］：將脫脂后的骨泥加入0.5%EDTA 溶液，浸泡24 h，100 r/min 攪拌，每8 h 更換1 次溶液，進(jìn)行脫鈣處理。

1.3.2 驢骨膠原肽的提取

1.3.2.1 一級酶解 將脫脂、脫鈣后的骨泥按1∶3（W∶V）的比例加入純化水，模擬人工胃液，用2.0 mol/L 的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至2.5～3.0，加入不同比例（1.0%、2.0%、3.0%）的胃蛋白酶（占驢骨的百分比）， 按胃蛋白酶最適酶活性進(jìn)行酶解處理，時(shí)間為1.5、2.0、2.5 h。升溫至100 ℃，作用15 min，使酶滅活，得到一級酶解液。 取樣，用0.45 μm 的濾膜過濾，過濾液用于測定驢骨膠原肽含量。

1.3.2.2 二級酶解 選取驢骨膠原肽含量較高的一級酶解液，模擬人工腸液，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至7.5～8.0， 加入不同比例 （1.0%、2.0%、3.0%）的胰蛋白酶（占驢骨的百分比），（50±0.5）℃條件下酶解處理， 時(shí)間為1.5、2.0、2.5 h。 升溫至100 ℃，作用15 min，使酶滅活，得到二級酶解液。

二級酶解后獲得的酶解液10 000 r/min 離心20 min，取上清液，用0.45、1.0、3.0 μm 的濾膜分級過濾，得到驢骨膠原肽溶液。

1.3.3 驢骨膠原肽含量的測定

應(yīng)用福林酚法測定驢骨膠原肽溶液的多肽含量。

1.3.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取牛血清白蛋白對照品0.03 g，加水至100 mL，制成1.0 mL 含牛血清白蛋白0.3 mg 的溶液。

1.3.3.2 堿性銅溶液的配制 取氫氧化鈉10 g、碳酸鈉50 g，加水400 mL 使其溶解，作為甲液。 取酒石酸鉀0.5 g 加水50 mL 使其溶解， 另取硫酸銅0.25 g 加水30 mL 使其溶解， 二者的混合液作為乙液。

臨用前，合并兩液，得到堿性銅溶液，加水至500 mL。

1.3.3.3 待檢樣品的制備 取制備的驢骨膠原肽溶液1.0 mL 加入50 mL 量瓶，加水定容至50 mL，作為待檢樣品，做3 個(gè)平行。

1.3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取 “1.3.3.1”項(xiàng)下制備的對照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，分別置于具塞刻度試管中，各加水至1.0 mL，再分別加入堿性銅溶液1.0 mL，搖勻，各加入福林酚試液4.0 mL，立即混勻，55 ℃水浴10 min，在650 nm波長處測定吸光度；以0 號管作為空白對照，以吸光度作為縱坐標(biāo)、 對照品溶液濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.5 待檢樣品多肽含量的測定 精密量取“1.3.3.3” 項(xiàng)下的驢骨膠原肽待檢樣品1.0 mL，測定在650 nm 波長處的吸光度，自標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待檢樣品溶液的多肽濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即為所制備驢骨膠原肽溶液的多肽含量。

1.3.4 驢骨膠原肽分子量的測定［9-11］驢骨膠原肽分子量的測定采用SDS-PAGE法，步驟如下。

1.3.4.1 溶液的配制 30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺29.0 g、 甲叉雙丙烯酰胺1.0 g， 加蒸餾水定容至100 mL。 陽極緩沖液：取Tris 12.11 g，加蒸餾水至500 mL，用鹽酸調(diào)整pH 值至8.9，定容至500 mL。陰極緩沖液： 取Tris 6.06 g，Tricine 8.96 g，SDS 0.5 g，加蒸餾水定容至500 mL。 分離膠緩沖液：取Trisbase 180 g，加蒸餾水800 mL 溶解，用鹽酸調(diào)整pH值至8.8， 定容至1 000 mL。 濃縮膠緩沖液：取Tris-base 60 g，加蒸餾水800 mL 溶解，用鹽酸調(diào)整pH 值至6.8，定容至1 000 mL。 樣品緩沖液：取SDS 0.8 g， 甘油4.0 g，β-巰基乙醇0.2 g， 溴酚藍(lán)0.01 g，加0.5 mol/L 的Tris-HCl（pH 值=6.8）溶解，并定容至10 mL。 25%過硫酸銨溶液：取過硫酸銨2.5 g， 加蒸餾水定容至10 mL。 10%SDS 溶液：取SDS 10 g，加蒸餾水定容至100 mL。 染色液：取考馬斯亮藍(lán)R250 2.5 g， 無水乙醇400 mL， 冰乙酸100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL。 脫色液：取無水乙醇300 mL，冰乙酸100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3.4.2 制膠 采用BYGENE 垂直電泳儀附件模具， 制成0.75 mm 厚的凝膠， 分別制成20%分離膠、10%夾層膠、5%濃縮膠的梯度膠， 各梯度凝膠配方見表1。3 種膠的制膠體積比為4.0∶1.5∶1.0，分離膠與夾層膠制成后，小心注入純化水封膠，待膠聚合完全后，傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。

1.3.4.3 樣品處理 取2 mL 樣品原液加入濃縮管，于試管濃縮儀中55 ℃、-80～-70 kPa 濃縮干燥成粉，得到濃縮樣品。 樣品濃縮物中加入1 mL 上樣緩沖液，熱水煮沸5 min。

1.3.4.4 點(diǎn)樣 小分子預(yù)染蛋白Marker 與樣品各點(diǎn)入15 μL，含小分子肽15 μg 左右。

1.3.4.5 跑膠 前3 h 電壓50 V、 電流20 mA，后2 h 電壓90 V、電流30 mA。

1.3.4.6 固定 取膠加入固定液固定20 min，用純化水反復(fù)清洗干凈。

1.3.4.7 染色 加入染色液染色30 min。

1.3.4.8 脫色 棄去染色液，加入脫色液，在搖床上60 r/min 脫色40 min，用純化水反復(fù)清洗干凈。

1.3.4.9 結(jié)果觀察 用肉眼觀察蛋白條帶。

1.4 數(shù)據(jù)處理

人工胃液和腸液模擬條件下， 不同加酶量和酶解時(shí)間作用后的一級、 二級酶解驢骨膠原肽含量數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）表示。 利用SPSS 17.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析， 采用LSD 法進(jìn)行多重比較。 P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

利用福林酚法測得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白的吸光度。根據(jù)所測結(jié)果，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.163 9x-0.149 6，R2=0.998 9。

圖1 不同濃度牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 一級酶解驢骨膠原肽含量測定結(jié)果

由于一級酶解模擬的是人工胃液環(huán)境（pH 值在2.5～3.0）， 酶解反應(yīng)條件以加酶量和酶解時(shí)間作為變量， 酶解后驢骨膠原肽含量作為酶解率評價(jià)指標(biāo)的因變量。 應(yīng)用福林酚法測得一級酶解驢骨膠原肽吸光度。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.163 9x-0.149 6（R2=0.998 9）及稀釋倍數(shù)，得出一級酶解驢骨膠原肽含量。應(yīng)用SPSS 17.0 軟件，對不同加酶量和酶解時(shí)間處理的一級酶解驢骨膠原肽含量進(jìn)行方差分析和組間多重比較，結(jié)果見表2。 由表2 可知，在相同酶解時(shí)間下，加酶量為2.0%和3.0%時(shí)，所得的一級酶解驢骨膠原肽含量均極顯著（P＜0.01）高于加酶量為1.0%時(shí)的一級酶解驢骨膠原肽含量，而加酶量為2.0%和3.0%時(shí)所得的一級酶解驢骨膠原肽含量差異均不顯著（P＞0.05），提示加酶量為2.0%和3.0%時(shí)獲得的一級酶解驢骨膠原肽含量較高。 當(dāng)加酶量為2%和3%時(shí)，酶解2.0 h 和2.5 h 時(shí)所得的一級酶解驢骨膠原肽含量均極顯著（P＜0.01）高于酶解時(shí)間為1.5 h 時(shí)的一級酶解驢骨膠原肽含量， 而酶解2.0 h 和2.5 h 時(shí)所得的一級酶解驢骨膠原肽含量差異均不顯著 （P＞0.05），提示酶解時(shí)間為2.0 h 和2.5 h 時(shí)獲得的一級酶解驢骨膠原肽含量較高。 結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，從保證酶解產(chǎn)物獲得量、降低胃蛋白酶使用成本和縮短酶解時(shí)間的角度考慮， 胃蛋白酶的最適添加比例為2.0%，最適酶解時(shí)間為2.0 h。 由此可以得出，模擬人工胃液環(huán)境，應(yīng)用胃蛋白酶進(jìn)行一級酶解驢骨膠原肽的最適反應(yīng)條件為：pH 值在2.5～3.0，加酶量2.0%、酶解時(shí)間2.0 h。

表1 不同濃度凝膠配方

2.3 驢骨膠原肽含量測定結(jié)果

選取最適一級酶解條件所得酶解液， 模擬人工腸液環(huán)境（pH 值在7.5～8.0）進(jìn)行二級驢骨膠原肽酶解， 酶解反應(yīng)條件及酶解評價(jià)指標(biāo)與一級酶解相同。二級酶解液即為驢骨膠原肽溶液，應(yīng)用福林酚法測得二級酶解驢骨膠原肽吸光度。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.163 9x-0.149 6（R2=0.998 9）及稀釋倍數(shù)， 得出二級酶解驢骨膠原肽含量。 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和組間多重比較，結(jié)果見表3。 由表3 可知，在相同酶解時(shí)間下，加酶量為2.0%和3.0%時(shí)，所得的驢骨膠原肽含量均極顯著（P＜0.01）高于加酶量為1.0%時(shí)的驢骨膠原肽含量，而加酶量為2.0%和3.0%時(shí)所得的驢骨膠原肽含量差異均不顯著 （P＞0.05），提示加酶量為2.0%和3.0%時(shí)獲得的驢骨膠原肽含量較高。當(dāng)加酶量為2.0%和3.0%時(shí)，酶解2.5 h 所得的驢骨膠原肽含量均顯著 （P＜0.05） 高于酶解2.0 h 所得的驢骨膠原肽含量， 且均極顯著 （P＜0.01） 高于酶解1.0 h 所得的驢骨膠原肽含量，提示酶解2.5 h 時(shí)獲得的驢骨膠原肽含量最高。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，從保證酶解產(chǎn)物獲得量、降低胰蛋白酶使用成本和縮短酶解時(shí)間的角度考慮，胰蛋白酶的最適添加比例為2.0%， 最適酶解時(shí)間為2.5 h。 由此可以得出，模擬人工腸液環(huán)境，應(yīng)用胰蛋白酶進(jìn)行二級酶解驢骨膠原肽的最適反應(yīng)條件為：pH 值在7.5～8.0，加酶量2.0%、酶解時(shí)間2.5 h。

2.4 驢骨膠原肽分子量測定結(jié)果

由圖2 可知， 通過二級生物酶解技術(shù)獲得的驢骨膠原肽分子量在10 kDa 左右。

3 討論

該研究針對內(nèi)蒙古自治區(qū)牲畜骨骼資源利用不足，營養(yǎng)物質(zhì)提取率低，且多在加工過程中使用酸性裂解等工藝，易造成環(huán)境污染等問題，探索了驢骨膠原肽的新型制備工藝。 通過模擬人工胃腸液消化環(huán)境， 建立了驢骨膠原肽二級生物酶解制備工藝及條件。 首先將新鮮驢骨制成骨泥，脫脂、脫鈣處理后，加水加酶，進(jìn)行一級酶解。 酶解條件為：添加2.0%胃蛋白酶（10 萬U/g），pH 值在2.5～3.0，酶解時(shí)間2.0 h。 一級酶解完成后，調(diào)節(jié)pH 值在7.5～8.0，添加2.0%胰蛋白酶（4 000 U/g），酶解時(shí)間2.5 h， 即完成二級酶解。 之后， 利用SDSPAGE 法分析了二級生物酶解所得驢骨膠原肽的分子量，產(chǎn)物大小集中于10 kDa。 綜上表明，該研究在模擬人體胃、腸生理環(huán)境條件下，采用二級生物酶解制備方法可生產(chǎn)符合人體吸收和生物學(xué)作用的驢骨膠原肽。

表2 不同加酶量與酶解時(shí)間所得一級酶解驢骨膠原肽含量測定結(jié)果（Mean±SD，n=5） 單位：mg/mL

表3 不同加酶量與酶解時(shí)間所得驢骨膠原肽含量測定結(jié)果（Mean±SD，n=5） 單位：mg/mL

圖2 SDS-PAGE 法分析驢骨膠原肽分子量結(jié)果

新鮮驢骨骨骼密度大，骨質(zhì)優(yōu)良，骨骼中蘊(yùn)藏的膠原蛋白含量大， 是小分子骨膠原肽提取的理想原料， 為活性小分子肽的提取提供了一個(gè)天然的寶庫。 驢骨膠原蛋白的開發(fā)正成為提高驢產(chǎn)業(yè)附加值的一個(gè)方向。 該研究結(jié)果可為驢骨膠原肽的開發(fā)和利用提供技術(shù)參考。