葛根護(hù)肝膠囊對(duì)酒精性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究

吉林吉春制藥股份有限公司技術(shù)研發(fā)中心 吉林四平 136504

1 材料與方法

1.1 受試樣品

葛根護(hù)肝膠囊，由吉林某保健食品公司生產(chǎn)，以葛根450g、黃芪300g、枳椇子200g、五味子150g、蜂膠粉50g、綠茶提取物50g，經(jīng)提取、混合后，制成1000 粒膠囊，每粒重0.4g。推薦劑量為成人（體重以60kg 計(jì)）每次3 粒，每日2 次。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF 級(jí)ICR 種雄性小鼠50 只，體重18g～22g，于屏障動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)并開展實(shí)驗(yàn)，溫度22°C～23°C，濕度54%～58%。

1.3 劑量選擇與受試物給予方式

按照人體推薦劑量的5、10、30 倍計(jì)算，預(yù)設(shè)置葛根護(hù)肝膠囊內(nèi)容物低中高三個(gè)劑量組，分別為0.20、0.40、1.20g/kg.BW，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和單純肝損傷模型對(duì)照組，灌胃給藥；低中高劑量組的受試物溶液配制方法為：分別取葛根護(hù)肝膠囊內(nèi)容物2.00g、4.00g、12.00g 加1%羧甲基纖維素至200ml。

1.4 主要儀器與試劑

BECKMAN COULTER AU680 全自動(dòng)生化分析儀、722 可見光分光光度計(jì)、加樣器、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、組織勻漿器、混懸器、載玻片、蓋玻片、尼康YS100 顯微鏡；丙二醛（MDA）測(cè)試盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)試盒，甘油三酯（TG）測(cè)試盒、蘇丹Ⅲ染色劑。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

受試物低中高劑量組按照上述劑量灌胃受試物，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等體積1%羧甲基纖維素溶液，灌胃體積均為0.2ml/10g·bw，每日1 次，連續(xù)30 天。第30 天灌胃結(jié)束后，各劑量組和模型對(duì)照組灌胃給予50%乙醇（12ml/kg.bw），造成急性酒精性肝損傷模型，空白對(duì)照組灌胃給予1%羧甲基纖維素，禁食16 小時(shí)后，處死動(dòng)物，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查。

取部分肝臟組織，生理鹽水制成10%的肝勻漿，分別檢測(cè)GSH、MDA 和TG 的含量。

從肝左葉中部選取合適的橫切面進(jìn)行取材，冰凍切片，以蘇丹Ⅲ染色。鏡檢時(shí)從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化，用40 倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片，觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積，并按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：0分，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在、稀少；1分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/4；2 分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/2；3 分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過3/4；4 分，肝組織幾乎被脂滴代替。

1.6 結(jié)果判定

肝組織中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）三項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果陽性，或肝組織中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）三項(xiàng)指標(biāo)中任兩項(xiàng)指標(biāo)陽性和病理檢測(cè)結(jié)果陽性，可判定受試樣品對(duì)化學(xué)性肝損傷具有輔助保護(hù)功能。

2 結(jié)果

2.1 葛根護(hù)肝膠囊對(duì)肝組織中MDA、GSH，TG 含量的影響

由表1 可見，與空白組相比，模型對(duì)照組的MDA、TG 含量均升高，GSH 含量降低，差異均有顯著性（P＜0.01）。而與模型組相比，高劑量組的TG 和MDA 含量明顯降低，GSH 含量明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05）。

表1：葛根護(hù)肝膠囊內(nèi)容物對(duì)小鼠肝勻漿中MDA、GSH、TG 含量的影響

2.2 葛根護(hù)肝膠囊對(duì)肝組織病理的影響

由表2 可見，與空白組相比，模型對(duì)照組肝臟脂肪變性的程度升高，差異有顯著性（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比，高劑量組肝臟脂肪變性的程度明顯降低，差異有顯著性（P＜0.05）。

表2：黃芪枳椇子膠囊內(nèi)容物對(duì)小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

3 討論

谷胱甘肽（GSH）是肝細(xì)胞內(nèi)存在的內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)物質(zhì)，具有清除異常自由基的作用，從而使肝細(xì)胞免于受到損害。研究表明，GSH 能根據(jù)機(jī)體的需要，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，且具有解毒功能。長期飲酒者肝細(xì)胞內(nèi)GSH 含量明顯降低，線粒體嚴(yán)重受損，氧自由基增多，由于抗氧化物質(zhì)活性和含量降低，來不及消耗多余的氧自由基，從而加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)。肝組織中GSH含量和活性，能一定程度上反映肝臟健康情況。丙二醛（MDA）是自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一。肝臟MDA 的含量可以反映肝臟脂質(zhì)過氧化的程度，也是常用的了解肝臟健康的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中GSH 活性和含量明顯降低，MDA 明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期查詢到的文獻(xiàn)論述相符，說明本次實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組相比，葛根護(hù)肝膠囊高劑量組能顯著提高小鼠肝組織GSH 含量和活性、顯著降低肝組織中MDA 含量。說明葛根護(hù)肝膠囊可以緩解氧化應(yīng)激對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟的損傷。

甘油三脂(TG)是存在于血液和肝臟中重要的內(nèi)源性脂類物質(zhì)，其合成、分解、代謝都依賴于肝臟，分解產(chǎn)物能提供維持生理運(yùn)轉(zhuǎn)的能量，研究表明，攝入大量酒精可導(dǎo)致TG 的代謝途徑遭到破壞，使得過多的TG 堆積于肝臟中，造成脂質(zhì)代謝異常，引起肝臟中TG 含量的顯著上升。本研究結(jié)果顯示，模型組肝組織中TG 含量與空白組相比顯著升高，說明乙醇灌胃對(duì)肝臟造成了損害，導(dǎo)致TG 在肝臟內(nèi)沉積，符合文獻(xiàn)報(bào)道，造模成功。與模型組比較，葛根護(hù)肝膠囊高劑量組肝組織中TG 含量顯著降低，表明本品對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟具有保護(hù)作用。其原因可能是該方減少肝臟攝取游離脂肪酸、促進(jìn)線粒體氧化、加速TG 轉(zhuǎn)運(yùn)效率等。

生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)代謝保持一種穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，當(dāng)脂質(zhì)代謝的重要器官受到損害時(shí)，平衡狀態(tài)被打破，就會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)異常代謝。當(dāng)長期大劑量飲酒時(shí)，肝臟不斷受到酒精的刺激，可造成肝細(xì)胞線粒體功能受損，肝組織內(nèi)脂肪大量堆積，最終引起肝脂肪變性。本實(shí)驗(yàn)采用50%乙醇灌胃，染色結(jié)果顯示模型組出現(xiàn)脂肪沉積，表明成功建立模型。與模型組相比，葛根護(hù)肝膠囊高劑量組小鼠肝組織脂肪變性評(píng)分降低，葛根護(hù)肝膠囊具有減輕酒精性肝損傷脂肪變程度的作用。

本配方是以葛根、黃芪、枳椇子、五味子、蜂膠、綠茶提取物為原料制成的保健食品，中醫(yī)理論認(rèn)為，酒為濕邪，配方中，枳椇子、葛根為中醫(yī)常用的解酒毒藥物，枳椇子利尿，葛根升陽；黃芪則兼具升陽利尿的作用，且能補(bǔ)氣扶正，緩解了酒邪對(duì)人體正氣的損耗，三原料聯(lián)合使用，在解酒毒的同時(shí)，兼顧了濕易困脾的特點(diǎn)，升發(fā)脾之清氣，促使?jié)駸嵯滦?，兼可扶正，酒毒可解，此外，酒為陽邪，飲酒過量傷陰津，五味子在配方中的作用有二：1、五味子的生津作用，可有效緩解酒對(duì)陰津的傷耗，2、五味子的收斂作用，防止因黃芪、枳椇子利水太過對(duì)機(jī)體津液的傷耗，配伍增強(qiáng)功效的同時(shí)，在配方中對(duì)其他原料也起到制衡的作用。葛根、黃芪、枳椇子、五味子配伍使用，符合中醫(yī)對(duì)酒邪的處理原則即“從脾論治”為主，扶正、解毒、化濕為輔。

現(xiàn)代研究表明，蜂膠可通過增強(qiáng)肝組織清除氧自由基的能力，降低肝組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而對(duì)慢性酒精性肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，綠茶對(duì)CYP450 酶家族中誘導(dǎo)酒精性肝損傷發(fā)生的酶CYP2E1具有明顯抑制作用，其主要成分多酚類物質(zhì)具有較好的清除自由基的作用，故能緩解酒精性肝損傷?？梢妰稍蠈?duì)酒精性肝損傷均具有保護(hù)作用，作用相對(duì)緩和，并富含多糖、多酚等對(duì)人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)，適用于保健食品，可長期服用。

本品組方前進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)查閱，組方綜合考慮傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)代科學(xué)對(duì)酒精性肝損傷的認(rèn)識(shí)，并結(jié)合保健食品注冊(cè)申報(bào)相關(guān)法律法規(guī)，最終確定了本品配方和用量，組方無配伍禁忌，前期配方論證工作和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均支持葛根護(hù)肝膠囊各原料配伍及其日用量具有輔助保護(hù)化學(xué)性肝損傷的作用。