奶牛TLR4基因編碼區(qū)生物信息學(xué)分析

高成宏，文亮，馬博妍，任穩(wěn)穩(wěn)，李宏旭，彭帥，劉麗霞，張麗

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，銀川 750001）

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）在哺乳動(dòng)物及人類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TLR1～TLR11等11個(gè)家族成員，其可通過區(qū)別不同病原體(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)而激活免疫細(xì)胞，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫防御中發(fā)揮著重要作用。其中TLR4不但可以結(jié)合革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖以及革蘭氏陽性菌的磷壁酸的受體，誘導(dǎo)促炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8等基因的表達(dá)，還能夠結(jié)合白色念珠菌、煙曲霉菌、結(jié)核分枝桿菌及新生隱球菌等相關(guān)的調(diào)控受體，在宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。此外，TLR4還可以識(shí)別如纖連蛋白、熱應(yīng)激蛋白、透明質(zhì)酸及纖維蛋白原的低聚糖等宿主的致炎因子。當(dāng)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌感染泌乳期奶牛乳房時(shí)，會(huì)使牛乳中的TLR4介導(dǎo)因子濃度增加。因金黃色葡萄球菌感染而引起的奶牛乳房炎中，TLR4基因的表達(dá)量也較高。由此發(fā)現(xiàn)，TLR4在宿主乳房內(nèi)感染免疫應(yīng)答中有著非常重要的作用。

TLR4基因位于牛的8號(hào)染色體上，遺傳多態(tài)性較豐富[1]。Goldammer等采用RT-PCR的方法分離出TLR4基因mRNA，利用熒光PCR及原位雜交的技術(shù)，得出乳房炎患牛乳中TLR4基因表達(dá)的豐度超過正常奶牛3倍以上[2]。鑒于此，本試驗(yàn)擬采用DNA池PCR和直接測(cè)序法對(duì)奶牛TLR4基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，旨在為中國荷斯坦?？共∮N提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在寧夏賀蘭山乳業(yè)有限公司第三奶牛場(chǎng)，使用醫(yī)用采血管采奶牛血10mL，低溫保存。采用苯酚-氯仿抽提法從血樣中提取總基因組DNA，用去離子水溶解稀釋后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為F-AGCCGATGGTATCTTCGAG；R-TTCTGAGTCTTCTCCAGAAGACAGG。擴(kuò)增體系為20μL：去離子水7.4μL，Taq PCR Master 11μL；上下游引物各0.4μL；DNA模板0.8μL。PCR擴(kuò)增體系為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物純化后送蘇州金唯智生物有限公司測(cè)序。

1.2 方法

運(yùn)用在線軟件對(duì)奶牛TLR4基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究中所用的各種工具軟件與網(wǎng)址見表1。

表1 蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)方法及相關(guān)網(wǎng)址

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成和編碼氨基酸組成

表2 編碼氨基酸組成

奶牛TLR4基因編碼區(qū)長3 738bp，共編碼1 246個(gè)氨基酸殘基（如表2）。A堿基有1 016個(gè)（27.18%），G堿基有795個(gè)（21.27%），T堿基有1 035個(gè)（27.69%），C堿基有889個(gè)（23.78%），其中A+T含量高于G+C含量；Ser（S）最多，為131個(gè)（11.49%），Asp（D）含量最少，為15個(gè)（1.31%）。

2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure)一般是指蛋白質(zhì)多肽鏈沿主鏈骨架方向的空間走向、規(guī)則性循環(huán)式排列，或某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)[3]，如圖1結(jié)果顯示α-螺旋(Hh)為329bp，延伸鏈(Ee)為30bp，無規(guī)卷曲(Cc)為378bp。

2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

圖1 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖2 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指基于二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)型，借助各種不同的二級(jí)鍵將其卷曲成特定空間分子結(jié)構(gòu)。構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)立體表現(xiàn)蛋白結(jié)果顯示（圖2），該蛋白的覆蓋率為0.72。無規(guī)卷曲較多，β-折疊較少。在細(xì)胞內(nèi)、跨膜區(qū)、細(xì)胞外都有分布。

2.4 編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)

表3 編碼蛋白質(zhì)的功能

在線預(yù)測(cè)奶牛編碼蛋白質(zhì)的功能結(jié)果（表3）表明，奶牛TLR4編碼蛋白原子數(shù)為13 521個(gè)，其中H原子較多，分?jǐn)?shù)正殘數(shù)為0.09，等電點(diǎn)為6.74，說明該蛋白顯酸性。分子體積為115 841.00V/M，脂肪族指數(shù)為105.75，其疏水性殘基只有0.02，所以該蛋白可能為親水性蛋白。

3 討論

TLRs已經(jīng)被證明是調(diào)控天然免疫反應(yīng)與后天免疫調(diào)控的關(guān)鍵因子。TLR4可以依據(jù)細(xì)胞激活不同的信號(hào)通路，在病原體識(shí)別受體中有著重要作用[4]。生物信息學(xué)分析在分子生物學(xué)中的重要性不言而喻，可用計(jì)算機(jī)手段和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法等識(shí)別DNA序列中的生物學(xué)特征?；蜃R(shí)別的主要對(duì)象是能夠編碼蛋白質(zhì)的基因，也能識(shí)別擁有其他生物學(xué)功能的因子。研究表明，TLR4基因的表達(dá)與呼吸道炎癥、呼吸系感染反應(yīng)、肺炎等的產(chǎn)生、發(fā)展都有很大關(guān)系[5,6]。王興平等[7]發(fā)現(xiàn)TLR4基因外顯子由從C突變到T產(chǎn)生3種不同的基因型，其中AA型基因在抗乳房炎中表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)基因。劉文嬌等研究表明CC型比TT型體細(xì)胞評(píng)分的均值要高出0.82[8]。在本課題組研究中也發(fā)現(xiàn)T基因型比C基因型略高。林寶山等[9]對(duì)牦牛TLR4編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行描繪發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白的α-螺旋占總量的38.29%；無規(guī)卷曲占總量的46.01%；延伸鏈占總量的15.70%。而本研究卻發(fā)現(xiàn)序列長度為329bp的延伸鏈(Ee)為30（5.53%）。以上結(jié)果不同可能是由于所測(cè)群體不同所致。牛乳中的體細(xì)胞數(shù)(SCC)可以反映乳房炎的發(fā)病程度[10]，Shook等[11]也發(fā)現(xiàn)乳房炎遺傳力為0.02～0.04。

Wu等[12]發(fā)現(xiàn)通過微小RNA-146a（miR-146a）的TLR4炎癥信號(hào)通路能夠降低血管中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)而被調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，通過降低TLR4的表達(dá)可以有效減少心肌組織釋放活性氧、產(chǎn)生炎性因子和發(fā)生炎癥反應(yīng)[13]。Awemu等[14]研究證明，牛乳腺、上皮細(xì)胞系（MAC-Tcells）和濃度不同的LPS共培養(yǎng)，TLR4與TLR2mRNA可以顯著上調(diào)，而且MAC-T細(xì)胞內(nèi)由TLR4信號(hào)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的MyD88依賴與非依賴途徑被一起激活。Shi等[15]發(fā)現(xiàn)，游離的脂肪酸變多時(shí)巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中TLR4的編碼蛋白也會(huì)增多，Lien等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳房被金黃色葡萄球菌與大腸桿菌感染時(shí)，牛乳中由TLR4所介導(dǎo)的可溶性CD14與脂多糖結(jié)合而編導(dǎo)蛋白的濃度會(huì)顯著增加，TLR4的變異會(huì)引起宿主對(duì)與某些病原體特異性免疫發(fā)生變化，而TLR4基因在奶牛中的多態(tài)性一直具有高度性，TLR4基因的表達(dá)與乳房感染則具有較高的關(guān)聯(lián)性。因此，TLR4基因可能成為輔助標(biāo)記，選擇作用于奶牛乳房炎抗性研究的候選基因，從而提高奶牛整體對(duì)乳房炎的抗病能力，降低奶牛乳房炎發(fā)病率。