新型佐劑-細(xì)菌樣顆粒對百日咳抗原體液免疫的效果研究

孔祥忍，毛雙雙，劉欣宇，馬勝男，孟令杰，陳家琦，李雅林

（山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東 泰安 271000）

百日咳是由百日咳鮑特桿菌（bordetella pertussis）感染引起的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，病程長且危害嚴(yán)重[1]?，F(xiàn)行疫苗使用的鋁佐劑及肌肉接種方法是影響疫苗效果的要素，開發(fā)更有效新型百日咳疫苗勢在必行。佐劑因具有增強(qiáng)疫苗免疫應(yīng)答的作用而廣泛用作疫苗的重要成分。細(xì)菌樣顆粒（bacterium-likeparticles，BLP）是近年來新被發(fā)現(xiàn)的新型佐劑，其成分是滅活的乳酸乳球菌，該細(xì)菌是一種常見的非致病細(xì)菌，被廣泛應(yīng)用在益生菌飲料和奶產(chǎn)品的生產(chǎn)，同其他常見的黏膜免疫佐劑相比，BLP 在安全性方面具有良好的優(yōu)勢[2-4]。近年來有報(bào)道BLP 用作佐劑可增強(qiáng)流感疫苗、肺炎鏈球菌疫苗的效果，但BLP 能否用作百日咳疫苗佐劑尚不十分清楚。此外，接種途徑也是影響疫苗效果的重要因素之一，百日咳是呼吸系統(tǒng)傳染病，通過鼻黏膜途徑進(jìn)行疫苗接種是非常理想的選擇，既能協(xié)調(diào)系統(tǒng)免疫反應(yīng)和局部黏膜免疫，又能兼顧體液和細(xì)胞免疫?，F(xiàn)行疫苗主要為肌肉接種，這也可能是導(dǎo)致現(xiàn)行百日咳疫苗免疫效果不理想的原因之一。為此，本研究擬制備BLP 作為百日咳疫苗的佐劑，探討其用于百日咳疫苗后對小鼠的體液免疫作用及保護(hù)效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 健康8 周齡雌性NIH 小鼠50 只，鼠齡8 周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物均在山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級環(huán)境飼養(yǎng)。乳酸乳球菌購自上海丹曦化工科技有限公司，百日咳攻擊菌和百日咳類毒素購自蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，氫氧化鋁佐劑購自美國賽默飛世爾公司。百日咳毒素（pertussistoxin，PT）IgG ELISA 試劑盒和百日咳PT sIgA ELISA 試劑盒購自德國IBL 公司。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。主要儀器：生物安全柜（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，HFSafe1200LC）、分光光度計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司，RE-6000A）、酶標(biāo)儀（賽默飛世爾，Multiskan FC）、顯微鏡（日本奧林巴斯，CX43）、冷凍切片機(jī)（德國萊卡，Leica CM1850）。

1.2 方法

1.2.1 制備細(xì)菌樣顆粒（BLP）佐劑 將乳酸菌菌種接種于含葡萄糖的M17 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)三氯乙酸處理并加熱以裂解菌體，經(jīng)離心、沉淀及洗滌可獲得BLP。經(jīng)染色及油鏡觀察BLP 形態(tài)。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)法測定BLP 干重。經(jīng)分光光度計(jì)檢測法檢測BLP 濃度。通過各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化、制備形態(tài)大小合適、安全的細(xì)菌樣顆粒用作佐劑。

1.2.2 制備百日咳類毒素疫苗 以0.3 mg BLP 為佐劑，以百日咳類毒素為抗原，將百日咳類毒素抗原以一定比例和用量混合，乳化混勻后保存于2 ℃～8 ℃中或直接用于免疫接種；以氫氧化鋁為佐劑的疫苗，參照人用劑量進(jìn)行換算，將類毒素抗原和鋁佐劑吸附后再合并在一起，在2 ℃～8 ℃中保存或直接進(jìn)行免疫。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及免疫方案 選取8 周齡雌性NIH小鼠，將50 只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、百日咳抗原+BLP 佐劑黏膜免疫組（BLP 佐劑黏膜組）、百日咳抗原+鋁佐劑黏膜免疫組（鋁佐劑黏膜組）、百日咳抗原+BLP 佐劑腹腔免疫組（BLP 佐劑腹腔組）和百日咳抗原+鋁佐劑腹腔免疫組（鋁佐劑腹腔組）。各組中BLP 劑量均為0.25 mg；黏膜組鋁佐劑用量為0.1 mg，腹腔組劑量為0.5 mg；鼻黏膜組百日咳抗原劑量為5 μg，腹腔組百日咳抗原劑量為25 μg。黏膜免疫組進(jìn)行常規(guī)滴鼻免疫，每只小鼠每個(gè)鼻孔滴加25 μl 疫苗，腹腔注射組進(jìn)行腹腔注射0.5 ml 疫苗，空白組滴鼻并腹腔注射等量0.01 mol/L PBS（pH 為7.2～7.4），于第0 天和28 天免疫2 次。

1.2.4 疫苗安全性檢測 接種后連續(xù)3 d 觀察小鼠有無明顯異常，如體質(zhì)量減輕，重點(diǎn)觀察鼻孔及口腔處是否有炎癥、潰瘍及脫毛現(xiàn)象，并抽檢接種部位有無潰瘍。

1.2.5 抗百日咳特異性抗體檢測 在初次免疫后的第7、21 及35 天取血，分別采小鼠尾部靜脈血100 μl左右，37 ℃靜置1 h，然后4 ℃靜置4 h，吸取上層血清備用。ELISA 檢測抗百日咳毒素特異性IgG。免疫后第35 天，采集小鼠鼻洗液樣本。將小鼠處死后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剖開頸部皮膚，剪開小鼠氣管，使用注射器將400 μl 灌洗液由氣管注入，由鼻腔流出，收集灌洗液。對制備的鼻灌洗液行ELISA 檢測抗百日咳毒素特異性sIgA。ELISA 操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 百日咳疫苗保護(hù)力檢測 在初次免疫后42 d，于生物安全柜中進(jìn)行菌液鼻腔攻擊實(shí)驗(yàn)，攻擊后第2 及14 天，取肺行HE 染色，進(jìn)行肺損傷程度的病理評分。評分規(guī)則如下：損傷非常溫和（+/-），溫和（+），損傷中等（++），損傷嚴(yán)重（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疫苗安全性檢測 接種后連續(xù)3 天，各組小鼠均未出現(xiàn)明顯異常，無體重減輕，鼻孔及口腔處均無明顯炎癥、潰瘍及脫毛現(xiàn)象，抽檢的接種部位未見潰瘍，疫苗具有良好的安全性。

2.2 各組小鼠血清抗百日咳毒素IgG 水平檢測 各組小鼠接受百日咳疫苗免疫接種后，血清抗百日咳毒素IgG 抗體水平逐漸升高，對照組無抗體產(chǎn)生。接種7、21、35 天，BLP 黏膜組、鋁佐劑黏膜組、BLP佐劑腹腔組和鋁佐劑腹腔組抗百日咳毒素IgG 均高于空白對照組，且BLP 佐劑腹腔組和鋁佐劑腹腔組均高于BLP 黏膜組和鋁佐劑黏膜組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中鋁佐劑腹腔組抗體水平最高，見表1。

2.3 各組小鼠鼻洗液sIgA 水平比較 與空白對照組比較，各組sIgA 水平均升高，BLP 佐劑黏膜組sIgA水平最高，高于鋁佐劑黏膜組、BLP 佐劑腹腔組及鋁佐劑腹腔組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 百日咳桿菌鼻腔攻擊后各組組織病理學(xué)損傷評估 攻擊后14 天，取小鼠肺組織，經(jīng)固定、HE 染色后進(jìn)行顯微鏡觀察，空白對照組小鼠肺組織表現(xiàn)為顯著的病理組織損傷，而接受疫苗免疫各組小鼠肺內(nèi)只出現(xiàn)輕微的炎性細(xì)胞浸潤；與其他各組比較，BLP 佐劑黏膜組小鼠肺組織損傷較小，見表3。

表1 各組小鼠血清抗百日咳IgG 抗體水平比較（±s）

表1 各組小鼠血清抗百日咳IgG 抗體水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與鋁佐劑黏膜組比較，bP＜0.05；與鋁佐劑腹腔比較，cP＜0.05

表2 各組小鼠血清抗日咳sIgA 抗體水平比較（±s）

表2 各組小鼠血清抗日咳sIgA 抗體水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與鋁佐劑黏膜組比較，bP＜0.05；與鋁佐劑腹腔比較，cP＜0.05

表3 各組小鼠肺組織病理損傷評分結(jié)果

3 討論

百日咳是由百日咳鮑特桿菌感染引起的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，接種疫苗是防治百日咳的最有效方法。目前所有市售的無細(xì)胞百日咳疫苗因其良好的安全性成為目前的主流疫苗，雖然在全球覆蓋率達(dá)到85%以上，但該疫苗的保護(hù)力并不理想，近年來百日咳發(fā)病率不斷攀升，因此開發(fā)更有效新型百日咳疫苗勢在必行。

佐劑因具有增強(qiáng)疫苗免疫應(yīng)答的作用而廣泛用作疫苗的重要成分。研究顯示，佐劑不同，疫苗的免疫效果差別很大。鋁佐劑是應(yīng)用最早、范圍最廣的佐劑，被用于制備白喉破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗[5]。雖然鋁佐劑仍然是目前應(yīng)用最廣泛的佐劑，但人們也逐漸開始發(fā)現(xiàn)它的局限性，如黏膜免疫效果不理想。BLP 是近年來新被發(fā)現(xiàn)的新型佐劑，其成分是滅活的乳酸乳球菌，乳酸乳球菌經(jīng)熱酸處理后球菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)的核酸、胞質(zhì)等內(nèi)容物被破壞，而構(gòu)成細(xì)菌外殼的肽聚糖復(fù)合物被保留下來，而且也保留了細(xì)菌原有的形狀和大?。ㄖ睆酱蠹s1 μm），即成為BLP。BLP 不僅可作為疫苗佐劑使用，也可作為抗原成分的載體。BLP 模擬了微生物感染的天然途徑進(jìn)行抗原提呈，有細(xì)菌一樣的大小與外形因此很容易被機(jī)體所吞噬，特別是在黏膜組織中。同其他常見的黏膜免疫佐劑相比，BLP 在安全性方面具有良好的優(yōu)勢[6，7]。近年研究報(bào)道BLP 用作佐劑可增強(qiáng)流感疫苗、肺炎鏈球菌疫苗的效果，但BLP 能否用作百日咳疫苗佐劑尚不清楚[8-10]。

除了佐劑對疫苗免疫效果的影響之外，接種途徑亦對疫苗的免疫效果有較大影響。百日咳是呼吸系統(tǒng)傳染病，通過鼻黏膜途徑進(jìn)行疫苗接種是非常理想的選擇，這樣既能協(xié)調(diào)系統(tǒng)免疫反應(yīng)又能激發(fā)局部黏膜免疫。然而，目前應(yīng)用的百日咳疫苗均采用肌肉注射，此類疫苗能夠促使機(jī)體產(chǎn)生足夠的體液免疫應(yīng)答，但并不能充分誘導(dǎo)以sIgA 分泌為標(biāo)志的局部黏膜免疫，現(xiàn)有疫苗在這方便的缺陷很可能是導(dǎo)致百日咳死灰復(fù)燃的另一重要原因。通過鼻腔進(jìn)行百日咳疫苗免疫接種是激活和強(qiáng)化局部黏膜免疫防御的有效方法，與肌肉注射和皮下注射相比，鼻腔免疫與百日咳的自然感染更加相似，預(yù)計(jì)能夠有效的誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答和局部免疫應(yīng)答。

本研究比較了百日咳疫苗通過鼻黏膜和腹腔兩種途徑免疫的差異，在兩種途徑中分別比較了BLP 和氫氧化鋁佐劑作用的效果。結(jié)果顯示，盡管以BLP 為黏膜佐劑的百日咳疫苗在誘導(dǎo)系統(tǒng)性IgG 水平方面略低于傳統(tǒng)鋁佐劑疫苗，但其經(jīng)鼻黏膜免疫效果優(yōu)于傳統(tǒng)鋁佐劑疫苗，可獲得較好的免疫效果，能夠提高小鼠鼻黏膜sIgA 抗體水平，提高小鼠抵御活菌攻擊的能力，降低小鼠肺組織病理損傷。本研究也存在一定的不足，由于實(shí)驗(yàn)條件限制，未研究疫苗對細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)作用，在以后的工作中，將深入研究以BLP 為佐劑的百日咳抗原疫苗對細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)作用。

總之，新型佐劑-細(xì)菌樣顆粒通過黏膜免疫保護(hù)作用最佳，其主要通過誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的sIgA 發(fā)揮作用。