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    基于氨基酸的古代食譜重建

    2021-02-03 08:03:38董瑞瑞BenjaminFuller魏書亞
    光譜學(xué)與光譜分析 2021年2期
    關(guān)鍵詞:骨膠原同位素氨基酸

    馬 穎,董瑞瑞,Benjamin T.Fuller,魏書亞

    1.北京科技大學(xué),北京 100083 2.Department of Archaeology and Heritage Studies,School of Culture and Society,Aarhus University, Moesg?rd Allé 20,DK-8270,H?jbjerg,Denmark

    引 言

    近年來,考古遺址出土的人和動物骨骼逐漸得到了越來越多考古學(xué)家的重視。除了傳統(tǒng)體質(zhì)人類學(xué)、形態(tài)學(xué)等工作的開展,更多自然學(xué)科,包括古DNA、古蛋白學(xué)、地球化學(xué)等方法的介入,極大的豐富了考古學(xué)相關(guān)研究。這其中,針對人和動物骨骼提取的骨膠原進行的穩(wěn)定同位素分析是重建古代先民食譜,古營養(yǎng)以及古環(huán)境的重要手段[1]。

    在考古學(xué)中,一般以人骨膠原的δ15N值高于同一個考古學(xué)地點的草食性動物骨膠原的δ15N值的程度,來估算人類營養(yǎng)位置或動物蛋白在人類飲食中的比例[2]。這些基于骨膠原的穩(wěn)定同位素分析,整合了樣品中所有含氮實體,盡管可以提供很多信息,但也存在一定的問題。這些大分子的δ15N值常受到多種因素的影響。例如,當(dāng)研究個體受到疾病、創(chuàng)傷、生長過快、饑餓、懷孕等各種生理壓力的影響時,其氮的代謝會出現(xiàn)異常,因此會導(dǎo)致我們做出錯誤的判斷[3]。

    在一些特殊的環(huán)境下,如干旱地區(qū),動植物的δ15N含量異常豐富,這就使得基于氮同位素的營養(yǎng)位置解釋變得模棱兩可[4]。同時,農(nóng)作物的施肥也會對動植物的δ15N值產(chǎn)生極大影響[5]。這種對農(nóng)作物δ15N值的影響會導(dǎo)致食用施肥作物的人的骨膠原δ15N值遠高于食用未經(jīng)施肥農(nóng)作物的草食動物的骨膠原δ15N值,從而導(dǎo)致對飲食中動物蛋白攝入的高估。

    鑒于此,對考古學(xué)而言,目前急需一種更有力的手段精細對古代食譜的研究。而基于單分子氨基酸的同位素分析技術(shù)可在分子水平上對膠原蛋白進行分析,并能克服大分子同位素固有的不確定性,對古代先民營養(yǎng)級位置進行準(zhǔn)確評估,展現(xiàn)了極大的潛力可用于古代食譜的重建研究。

    本研究對考古遺址出土的人和動物骨骼開展基于單分子氨基酸氮同位素分析的嘗試性研究,以期能獲取古代先民精確的營養(yǎng)級信息,了解古代先民食物結(jié)構(gòu)差異,從而為進一步討論人類等級分化,社會階層出現(xiàn)等考古學(xué)問題提供新的見解。

    1 實驗部分

    1.1 樣品及考古遺址背景

    選取突尼斯迦太基城凡達里奇墓地出土的人和動物骨骼,共計14例樣品,其中人骨骨骼10具,動物樣品4具,詳細取樣信息見表1。該遺址位于北非突尼斯迦太基城北城墻外向西200 m處,根據(jù)墓葬出土陶器和錢幣特征,推測該墓地的使用年代在5世紀(jì)中期至6世紀(jì)早期,為迦太基汪達爾時期的墓葬群[6]。

    表1 突尼斯迦太基城凡達里奇墓地出土人和動物樣品信息Table 1 Sampling information of human and faunal skeletons excavated from Vandalic cemetery in Carthage,Tunisia

    樣品的年齡估計和性別判定由體質(zhì)人類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法確定[7]。實驗選擇肋骨和長骨碎片進行膠原蛋白提取和同位素分析。動物遺骸,包括牛,豬,羊等種屬,用作同位素基線,便于與人類結(jié)果進行比較。

    1.2 樣品處理

    每個個體稱取300~500 mg骨樣,噴砂槍去除骨樣表面污染后,5 ℃下置于0.5 mol·L-1HCl溶液浸泡,每隔2~3 d換新鮮酸液,直至骨樣松軟、無明顯氣泡為止。再用去離子水洗至中性,在0.01 mol·L-1的HCl溶液下70 ℃明膠化48 h,熱濾,經(jīng)過Millipore Amicon Ultra filter超濾后收集分子量>30 K的溶液,冷凍干燥,收集明膠化的骨膠原。最后稱重,計算膠原蛋白提取率。

    骨膠原水解根據(jù)文獻中描述的方法進行改進[8]。稱取約1.0 mg膠原蛋白并加入0.5 mL 6N HCl,110 ℃加熱20 h,將膠原蛋白水解成單個氨基酸。水解后,將溶液在60 ℃氮氣下吹干,加入200 μL 0.1 N HCl,-60 ℃下保存。我們在Corr等提出的N-乙?;惐?NAIP)衍生化方法上進行了較小的修改[9]。用1.8 mL乙酸乙酯將樣品提取到GC樣品瓶中,并在冰箱(4 ℃)中放置過夜。室溫下吹干后,將NAIP重新溶解在二氯甲烷中并調(diào)節(jié)至所需體積。每個樣品中加入正亮氨酸(500 μL,0.2 mg·mL-1)作為內(nèi)標(biāo)。

    1.3 方法

    樣品骨膠原C和N元素含量及穩(wěn)定同位素的測試儀器為Flash EA 2112元素分析儀串聯(lián)Thermo-Finnigan Delta XP穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀。

    單分子氨基酸氮同位素比值在通過GC Combustion Ⅲ接口與Delta V Plus同位素比質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)(GC-C-IRMS)連接的Agilent 6890N氣相色譜儀上進行[10]。

    測樣采用序列樣品,由一個標(biāo)準(zhǔn)樣品,兩個質(zhì)量控制樣品和四至五個樣品組成。每個樣品的報告值是一式三份測定的平均δ15N值。與這些三次重復(fù)分析相關(guān)的平均誤差為0.6σ。衍生氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的平均誤差為±0.9‰。

    2 結(jié)果與討論

    所有樣品的骨膠原蛋白提取率均>1%,原子C∶N在2.9~3.6之間,保存質(zhì)量良好。樣品骨膠原穩(wěn)定碳、氮同位素與單分子氨基酸氮同位素分析結(jié)果詳見表2。對樣品骨膠原δ13C和δ15N繪制散點圖,如圖1所示。

    圖1 狄奧多西墓地出土人和動物樣品骨膠原碳、氮同位素值散點圖Fig.1 Bulk collagen δ13C and δ15N results from the Carthage Vandalic cemetery,Tunisia

    表2 骨膠原穩(wěn)定同位素及單分子氨基酸同位素測試結(jié)果Table 2 Bulk isotopic information and amino acids nitrogen isotopic results of human and faunal samples

    四個陸生動物的δ13C值在-20.7‰~-21.9‰之間,δ15N值在6.1‰~8.3‰,相差不大。牛和羊的δ15N值較為接近,體現(xiàn)了較為明顯的食草類動物特性。豬的δ15N值較牛和羊高近2‰,豬是雜食性動物,其可能攝入了一定量動物蛋白而導(dǎo)致其氮同位素值有所富集。10個人的δ13C值均值為-19.6‰±0.5‰,分布在-18.8‰~-20.9‰之間,這說明該遺址居民主要以C3類食物為主。人的δ15N值平均值為11.1‰±1.3‰,較高的δ15N值表明該遺址先民飲食攝入有大量的動物蛋白。δ15N值在8.7‰~13‰之間,表明不同個體存在較大差異,最高的個體與最低的個體δ15N值相差3.3‰,顯示先民在肉食資源的獲取方式上顯著不同。個體Aus01具有明顯最高δ15N值13‰,有可能攝取了一定比例的水生/海洋蛋白,但也無法排除是否由其他高N背景值的地區(qū)遷徙而來的可能。

    在骨膠原的20種氨基酸中,我們獲得了4種必要氨基酸(苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴氨酸)(Phe,Val,Leu,Lys)和7種非必要氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸,羥脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)(Ala,Gly,Ser,Pro,Hyp,Asx,Glx)。圖2所示具有代表性的樣品(Aus105:羊)的色譜保留時間圖。所有氨基酸均通過氣相色譜進行基線分離,由于本研究主要考察兩種氨基酸(苯丙氨酸和谷氨酸)的氮同位素值,所以僅在此報道δ15Nphe和δ15NGlu值。

    圖2 代表性(Aus105:羊)樣品的色譜分離及保留時間圖Fig.2 Representative GC-C-IRMS chromatogram showing the individual bone collagen amino acids separated and retention times (Sample:Aus 105,sheep)TPAA=((δ15NGlu-δ15NPhe+8.4)/7.6)+1[13]

    人和動物的δ15Nphe在9.4‰~10.7‰之間,平均值為10.5‰±0.7‰,并不存在明顯不同。這表明,人和陸生動物的食物源相似,因為苯丙氨酸的δ15N值在食物和消費者間的富集非常小,僅0.4‰。而δ15NGlu值差異顯著,在8.8‰~16.7‰間,均值為14‰±2.5‰。根據(jù)實驗室飼喂實驗和田間生態(tài)研究的結(jié)果,δ15NGlu值隨著營養(yǎng)級升高而遞增[11]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中,C3類植物和C4類植物Δ15NGlu-Phe值具有顯著差異,一般C3類植物在-8.4‰左右,而C4類植物在0.4‰左右。不同生態(tài)系統(tǒng)中有機體的營養(yǎng)級位置可基于特定的方程而進行量化[12]。其中,陸地C3類生態(tài)系統(tǒng)的計算方程式可表達為

    基于上述公式對個體營養(yǎng)級的判斷相比于全組分骨膠原氮同位素比值具有更大的優(yōu)勢,因為他們無需利用初級生產(chǎn)者,即食物網(wǎng)基底的植物的δ15N進行表征,而是利用了單個生物體內(nèi)兩個氨基酸之間的同位素間距。因此,通過關(guān)注這些特殊的氨基酸,即可更精確的估算每種生物營養(yǎng)級位置并重建食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)。根據(jù)陸地C3類生態(tài)系統(tǒng)的計算方程式,對本遺址樣品進行營養(yǎng)級位置估算,并對每個樣本繪制δ15Nphe和δ15NGlu交叉參數(shù)分布圖。詳見圖3。

    圖3 人和動物樣品苯丙氨酸和谷氨酸的氮同位素值散點圖Fig.3 Scatter plot of δ15NGlu and δ15NGlu values for the human and fauna samples

    可以看出,食草類動物牛和羊的營養(yǎng)級位置在2左右(牛為2.0,羊稍低為1.8),符合生物學(xué)預(yù)期的營養(yǎng)級位置。豬的營養(yǎng)級位置在2.1,僅微高于食草類動物,表明豬的飲食中蛋白的成分應(yīng)該非常少。人的營養(yǎng)級位置從2.0到3.0,個體間差異較大。1個個體(Aus 16)具有最低的數(shù)值2.1,落于食草動物和豬的數(shù)值間,表明該個體應(yīng)處于營養(yǎng)級的最低端,基本沒有動物性蛋白的攝入。絕大多數(shù)個體營養(yǎng)級位于2.9左右,表明這群個體攝入了相當(dāng)高的肉食資源,位于陸生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的頂端。有2~3個個體在2.6~2.7間,表明這些個體攝入的肉食蛋白比例相對低于其他個體(除Aus16)。

    將利用δ15NPhe和δ15NGlu值計算出的營養(yǎng)級位置與應(yīng)到個體骨膠原穩(wěn)定氮同位素值進行對比(見圖4)。以個體Aus1和Aus36為例,其δ15N值分別為13‰和10.6‰,相差近2.4‰。若僅用骨膠原δ15N值對其蛋白攝入情況進行判斷,會認為這兩個個體對肉食資源的攝取可能存在一定的差異。然而其苯丙氨酸和谷氨酸的氮同位素值表明其在營養(yǎng)級中都處于相同的位置2.9。而Aus16和Aus23兩個個體則存在正好相反的情況。這兩個個體具有非常接近的骨膠原δ15N值,分別為8.7‰和8.9‰,暗示其應(yīng)該有著相似的蛋白攝入。然而單分子氨基酸氮同位素δ15NPhe和δ15NGlu值表明,其處于營養(yǎng)級的不同位置,2.0和2.6,即對肉食蛋白的攝入存在顯著差異。Aus16個體為單純的素食者,而Aus23個體攝入了相當(dāng)量的動物性蛋白。

    圖4 人和動物樣品營養(yǎng)級位置與骨膠原氮同位素值散點圖Fig.4 Bulk δ15N values vs.trophic position for the human and fauna samples

    根據(jù)骨膠原δ15N值對營養(yǎng)級情況進行的判斷與由單分子氨基酸δ15NPhe和δ15NGlu值得出的結(jié)果存在一定程度的差異。前文所講,骨膠原δ15N值是個體組成所有氨基酸δ15N值的整合,而個體間由于生理代謝或其他原因造成的差異往往被抵消,得不到應(yīng)有的體現(xiàn)[14]。因此,僅利用骨膠原δ15N值分析個體蛋白攝入情況及判斷其營養(yǎng)級位置可能會與個體真實的情況有較大的出入。以往的研究中,很多不同社會等級或不同性別、貧富差距的人群間,其骨膠原δ15N值并沒有發(fā)現(xiàn)顯著不同[15]。而本研究結(jié)果表明,僅利用骨膠原δ15N值可能在一定程度上忽略了個體食譜結(jié)構(gòu)的差異,從而導(dǎo)致先民食譜的均一性。本研究結(jié)果對探尋人群食譜差異的研究提供了新的思路和證據(jù),利用基于單分子氨基酸的同位素分析將提供個體更為準(zhǔn)確的營養(yǎng)級位置信息,進一步提高對不同人群食譜結(jié)構(gòu)差異研究的分辨率。

    3 結(jié) 論

    通過對突尼斯迦太基凡達里奇墓地出土人和動物骨骼進行骨膠原穩(wěn)定碳氮同位素和單分子氨基酸同位素分析。研究表明,利用單分子氨基酸氮同位素比值對古代先民所處營養(yǎng)級位置能做出更為準(zhǔn)確的判斷,在揭示古代人類食譜差異上具有不可比擬的優(yōu)勢。對考古遺址出土人和動物骨骼開展該分析將極大提高古代食譜重建工作的分辨率,為精細化研究古代人群及社會提供重要依據(jù)。

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