急性Pb2+脅迫對(duì)大口黑鱸(Micropterus salmoides)幼魚Hippo 信號(hào)通路基因表達(dá)的影響*

錢寶英 盧明敏 錢鴻基 潘宇奇 林樂(lè)琪 徐芳英 施港歸 齊 鑫

(臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 臺(tái)州 318000)

鉛為生物非必需的蓄積性重金屬元素, 可通過(guò)食物鏈的生物級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)在生物體內(nèi)富集, 損害生物各組織器官, 已成為土壤及水域中的三種主要重金屬污染物之一(Rajamanickam et al, 2008; 潘天揚(yáng)等, 2016)。鉛污染在水域表層沉積物中高于相應(yīng)水相,當(dāng)環(huán)境條件變化時(shí)可緩慢釋放至上層水相, 魚類通過(guò)鰓呼吸及攝食底層水生動(dòng)植物進(jìn)入魚體后引起其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖異常、器官畸變或死亡, 且底棲或處于食物鏈頂端的水生生物體內(nèi)鉛蓄積程度高于非底棲生物(劉芳芳, 2013; 龍昱等, 2016)。進(jìn)入魚體內(nèi)的鉛離子不僅與蛋白質(zhì)、酶等功能基團(tuán)巰基結(jié)合而干擾其生理生化活動(dòng), 而且還在基因水平上誘導(dǎo)染色體失常(Ferraro et al, 2004), 引起DNA 鏈損傷斷裂及片段丟失(Hong et al, 2007; Sokolova et al, 2008; Zhang et al, 2008), 關(guān)鍵基因G6PDH、GST、鐵蛋白基因以及β-球蛋白基因表達(dá)延時(shí)、mRNA 表達(dá)量改變(Mager et al, 2008)。此外, 鉛離子在一定程度上可造成魚類細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)凝集、周邊化、細(xì)胞質(zhì)密度增加進(jìn)而出現(xiàn)空泡后形成凋亡小體(項(xiàng)黎新等, 2001)。

Hippo 信號(hào)通路由進(jìn)化上高度保守的一系列激酶組成, 包括 YAP/TAZ、Salvador、Lats1/2、MOB1, 調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡、組織器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生等(Song et al, 2019; 麻明彪等, 2020)。Hippo 信號(hào)通路的激活/抑制與細(xì)胞生長(zhǎng)密度緊密相關(guān), 在高密度生長(zhǎng)的細(xì)胞中, Hippo 通路中激活的 Lats1/2 (large tumor suppressor kinases1/2, 大型腫瘤抑制因子1/2)磷酸化轉(zhuǎn)錄共激活因子 YAP/TAZ (Yes-associated protein/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, Yes 相關(guān)蛋白/結(jié)合 PDZ 的轉(zhuǎn)錄共激活因子),促使YAP/TAZ 與14-3-3 蛋白結(jié)合后定位于細(xì)胞質(zhì)中,被抑制轉(zhuǎn)錄共激活作用的 YAP/TAZ 進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解及細(xì)胞凋亡從而限制組織器官的過(guò)度生長(zhǎng)(Zhao et al, 2007, 2010; Badouel et al, 2011); 而在低密度生長(zhǎng)的細(xì)胞中, Hippo 通路則呈抑制狀態(tài), YAP/TAZ 易位進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子 TEAD (TEA domain,TEA 結(jié)構(gòu)域)家族結(jié)合調(diào)控細(xì)胞增殖抑制凋亡的基因轉(zhuǎn)錄, 從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(Zhao et al, 2011;Agarwala et al, 2015; Gibaul et al, 2016)。有研究表明,Lats1/2 還可被抑癌蛋白 MOB1 (Mps One Binder kinase activator-like1, 多磺酸粘多糖激酶激活劑 1)磷酸化, 致使 Lats1/2 滯留于細(xì)胞質(zhì)(Di Benedetto et al,2016)。通路中KIBRA 蛋白(kidney and brain expressed protein, 腎腦表達(dá)蛋白)又稱為WWC1, 屬WWC 蛋白家族, 與FRMD 蛋白(FERM domain-containing protein 1, FERM 結(jié)構(gòu)域蛋白)上游調(diào)節(jié)蛋白相互作用, 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡(Tepass, 2009; 宋林, 2019)。PP2A (protein phosphatase 2A, 蛋白磷酸酶2A)是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族中其中一個(gè)蛋白磷酸酶, 廣泛參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移等(孫奕等, 2018), 在Hippo 通路中, PP2A在α-catenin 的負(fù)調(diào)節(jié)下, 通過(guò)與14-3-3 蛋白相互作用控制YAP1 的磷酸化(Schlegelmilch et al, 2011)。

大口黑鱸(Micropterus salmoides)又名加州鱸, 為太陽(yáng)魚科(Ceutrarchidac)、黑鱸屬(Micropterus), 以肉食為主的廣溫雜食性魚類, 是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一(石瓊等, 2014), 在食物鏈中處于較高位置。又因大口黑鱸為底棲魚類, 在鉛污染水體中極易生物富集。水體中的鉛離子通過(guò)大口黑鱸鰓呼吸進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng), 因此在鰓中的蓄積量較高(阮曉等, 2001;Rogers et al, 2003)。此外, 魚類在攝取魚食同時(shí)吞咽鉛離子, 小腸作為消化和吸收的主要部位, 鉛離子極可能在小腸部位被吸收。肝臟是魚類重要的消化代謝器官, 也是魚類重要的生理指示器, 進(jìn)入魚體內(nèi)的鉛離子可引起肝細(xì)胞損傷或畸變。Ribeiro 等(2014)發(fā)現(xiàn)鉛可在Prochilodus lineatus 的肝臟、鰓和肌肉組織中檢測(cè)到鉛離子。已有研究表明大口黑鱸幼魚肝臟組織YAP/TAZ 表達(dá)量在 Pb2+濃度 17.8 mg/L 下急性脅迫96 h 時(shí)顯著上升(Qian et al, 2020), YAP/TAZ 為Hippo信號(hào)通路核心基因, 目前對(duì) Pb2+脅迫后大口黑鱸Hippo 信號(hào)通路中的其他關(guān)鍵基因表達(dá)變化的研究未見報(bào)道。本文在前期研究的基礎(chǔ)上分析了 96 h Pb2+不同濃度脅迫后的Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD 和 PP2A 在肝臟、肌肉、鰓和小腸組織, 以及YAP/TAZ 在肌肉、鰓和小腸組織中的表達(dá)變化。研究結(jié)果可為大口黑鱸幼魚對(duì)Pb2+脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制研究提供一定的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與取樣

大口黑鱸幼魚[平均體重(3.0±0.2) g]購(gòu)買自湖州淡水魚苗種場(chǎng), 隨機(jī)分成18 組養(yǎng)于120 L 白色養(yǎng)殖箱,每箱30 尾。經(jīng)停食適應(yīng)2 d 后, 每天早晚投喂大口黑鱸幼魚專用飼料, 正常養(yǎng)殖 7 d 后開始進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)。以Pb(NO3)2(CAS: 10099 74-8, AR: 99%)制備的50 mg/L Pb2+溶液為母液, 稀釋至不同的脅迫處理濃度 10、17.8、31.6、56.2 和 100 mg/L, 其中以 Pb2+0 mg/L 為對(duì)照組, 每個(gè)濃度梯度三個(gè)平行, 每個(gè)濃度梯度共90 尾, 脅迫期間正常投喂。脅迫處理96 h 后,從對(duì)照組和各濃度梯度脅迫組各取 9 尾大口黑鱸幼魚(每個(gè)養(yǎng)殖箱取 3 尾, 一個(gè)濃度梯度共 9 尾), 經(jīng)麻醉后取肝臟、肌肉、鰓和小腸組織, 樣品保存于RNA組織保存液中, 存于-80°C 冰箱備用。

1.2 基因表達(dá)分析

采用組織總RNA 抽提試劑盒6688-1(OMEGA, 廣州)并根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行樣品總RNA 的提取, 1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)總RNA 完整性, 并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 OD260和 OD280, 分析總RNA 濃度和純度, 檢測(cè)合格的總 RNA 保存于-80°C 超低溫冰箱備用。用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa, 大連)并根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行 cDNA 第一鏈合成, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20°C 冰箱備用。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的大口黑鱸Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A和 YAP/TAZ 基因部分 cDNA 序列, 以 β-actin(β 列肌動(dòng)蛋白)為內(nèi)參基因, 用Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)引物并送北京六合華大合成。具體引物名稱和序列見表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)體系共20 μL, 包括 SYBR Green (FastStart Universal SYBR Green Master, Roche) 9 μL, 10 μmol/L 的正向和反向引物各0.6 μL, cDNA 模板 1 μL, DNase/RNase free 的無(wú)菌H2O 8.8 μL。qPCR 反應(yīng)條件包括: 50°C 2 min, 95°C預(yù)變性 10 min, (95°C 變性 10 s, 58°C 退火 30 s, 72°C延伸20 s, 共40 個(gè)循環(huán)), 最后進(jìn)行熔解曲線分析。目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率模板采用不同稀釋倍數(shù) cDNA(1、10、100 和 1000 倍)。采用 2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因 mRNA 表達(dá)倍數(shù)變化(Schmittgen et al,2008)。采用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件(版本21.0)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 當(dāng) P＜0.05 時(shí)差異顯著。最后用OriginPro 作圖軟件(版本9.1)作圖。

表 1 qPCR 引物Tab.1 The primer sequence of qPCR

2 結(jié)果

2.1 大口黑鱸急性 Pb2+脅迫處理后肝臟組織的表達(dá)分析

以對(duì)照組(0 mg/L)各目的基因在大口黑鱸肝臟組織中的表達(dá)量作為參照, 96 h 不同濃度 Pb2+脅迫后,肝臟組織中各基因表達(dá)量出現(xiàn)了不同的變化(圖 1a,1b)。Lats1/2 表達(dá)量在脅迫濃度100 mg/L 時(shí)相對(duì)對(duì)照組上調(diào)極顯著, 在其他脅迫濃度下表達(dá)量變化不顯著; MOB1、PP2A 和TEAD 表達(dá)量在不同濃度鉛脅迫下總體上調(diào), 在17.8 和31.6 mg/L 時(shí)表達(dá)量上升顯著;14-3-3 表達(dá)量相比對(duì)照組總體呈上升, 并在 17.8、31.6 和 56.2 mg/L 時(shí)顯著上調(diào); KIBRA 在 17.8 mg/L 時(shí)表達(dá)量上調(diào)極顯著, 其他脅迫濃度下雖有升高但不顯著; 基因 FRMD mRNA 表達(dá)量呈先下降后升高又下降的趨勢(shì), 在 17.8 mg/L 時(shí)顯著上調(diào), 在其他濃度雖有下調(diào)和上調(diào)趨勢(shì), 但與對(duì)照組相比變化不顯著。

2.2 大口黑鱸急性 Pb2+脅迫處理后肌肉組織的表達(dá)分析

96 h 不同濃度Pb2+脅迫后, 肌肉組織中除TEAD外其余各目的基因表達(dá)量與對(duì)照組(0 mg/L)變化明顯(圖2a, 2b)。YAP/TAZ mRNA 表達(dá)量隨著Pb2+脅迫濃度的提高, 在17.8 mg/L 時(shí)與對(duì)照組相比上調(diào)極顯著,在恢復(fù)至對(duì)照組水平(數(shù)據(jù)來(lái)源于參考文獻(xiàn)Qian et al,2020); Lats1/2 在 10 和 17.8 mg/L 時(shí)上調(diào)極顯著, 隨著濃度的升高, 表達(dá)量變化不顯著; 與對(duì)照組相比, 基因 MOB1 mRNA 表達(dá)量在不同脅迫濃度下都呈顯著上升, 在17.8 mg/L 時(shí)達(dá)到最高值(表達(dá)倍數(shù)為5.18);14-3-3 表達(dá)量隨著Pb2+脅迫濃度的升高, 先顯著下調(diào),在31.6 mg/L 時(shí)上調(diào)極顯著, 56.2 mg/L 時(shí)下調(diào)極顯著,在 100 mg/L 時(shí)又極顯著上升; PP2A 表達(dá)量 10 和56.2 mg/L 時(shí)上升極顯著, 在31.6 和100 mg/L 時(shí)雖較對(duì)照組下調(diào), 但變化不顯著; KIBRA mRNA 表達(dá)量在Pb2+脅迫濃度10 mg/L 時(shí)顯著上調(diào), 隨著脅迫濃度的升高, 表達(dá)量較對(duì)照組都無(wú)顯著變化; 基因FRMD 在Pb2+脅迫濃度 10、56.2 和 100 mg/L 時(shí)顯著上調(diào); 而TEAD 表達(dá)量在所有Pb2+脅迫濃度處理下較對(duì)照組變化不顯著。

2.3 大口黑鱸急性Pb2+脅迫處理后鰓組織的表達(dá)分析

大口黑鱸幼魚在96 h 不同濃度Pb2+脅迫后, 鰓組織中各目的基因表達(dá)量與對(duì)照組(0 mg/L)有不同的變化(圖3a, 3b)?；験AP/TAZ 表達(dá)量隨著脅迫濃度的上升呈先上調(diào)后下調(diào), 在10 mg/L 表達(dá)量上調(diào)極顯著,在17.8、56.2 和100 mg/L 時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào); Lats1/2 mRNA 表達(dá)量在100 mg/L 時(shí)下調(diào)極顯著, 其他脅迫處理濃度下表達(dá)量與對(duì)照組相比都無(wú)顯著變化; 基因 MOB1 在脅迫濃度 10 和 31.6 mg/L 時(shí)表達(dá)量上調(diào)極顯著, 其他濃度下與對(duì)照組相比變化不顯著;14-3-3 mRNA 表達(dá)量在所有脅迫處理濃度下都下降,在17.8 mg/L 時(shí)下調(diào)極顯著, 在10 和56.2 mg/L 呈顯著下調(diào); PP2A mRNA 表達(dá)量隨著脅迫濃度的升高先上調(diào)極顯著, 后恢復(fù)至對(duì)照組水平; KIBRA 在 10 mg/L時(shí)表達(dá)量先顯著上升, 隨著脅迫濃度的升高, 與對(duì)照組相比, 表達(dá)量有下降趨勢(shì), 但無(wú)顯著性; FRMD mRNA 表達(dá)量在10 mg/L 時(shí)與對(duì)照組相比上升極顯著,隨著脅迫濃度的升高表達(dá)量回復(fù)到對(duì)照組水平且無(wú)顯著性差異; TEAD 表達(dá)量隨著Pb2+脅迫濃度的升高先上調(diào)后下降, 在 10 mg/L 上調(diào)極顯著, 17.8 和100 mg/L 時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)。

2.4 大口黑鱸急性 Pb2+脅迫處理后小腸組織的表達(dá)分析

圖1 基因Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 和YAP/TAZ 在96h 急性Pb2+脅迫后大口黑鱸幼魚肝臟組織中的qPCR 分析Fig.1 qPCR analysis of Lats1/2, MOB1, KIBRA, FRMD, 14-3-3, TEAD, PP2A, and YAP/TAZ in the liver of largemouth bass under acute Pb2+ stress for 96h

除 Lats1/2 外, 其余目的基因在 96 h 不同濃度Pb2+脅迫處理后的大口黑鱸幼魚小腸組織中表達(dá)量變化明顯(圖4a, 4b)。與其他組織不同, YAP/TAZ 基因表達(dá)量在不同脅迫濃度下表達(dá)量均下降, 17.8、56.2和 100 mg/L 時(shí)相比對(duì)照組表達(dá)量顯著下調(diào); Lats1/2基因在所有 Pb2+脅迫濃度下表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化; MOB1 mRNA 表達(dá)量除31.6 mg/L 時(shí)與對(duì)照組沒有顯著性差異外, 其余脅迫處理濃度下均顯著下調(diào); 14-3-3 mRNA 表達(dá)量在所有脅迫濃度下與對(duì)照組相比都顯著下調(diào), 并且在 10、17.8、56.2 和100 mg/L 時(shí)表達(dá)量下調(diào)極顯著; 隨著 Pb2+脅迫濃度的升高, PP2A mRNA 表達(dá)量都下調(diào)極顯著; KIBRA 表達(dá)量變化與PP2A 類似, 在所有脅迫濃度下表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著下調(diào); FRMD 基因表達(dá)量隨著脅迫濃度的增加, 先上升, 后恢復(fù)至對(duì)照組水平, 在10 mg/L 是相比對(duì)照組上升極顯著, 在 17.8 mg/L 時(shí)上升顯著; TEAD mRNA 表達(dá)量在10、17.8 和31.6 時(shí)相比對(duì)照組無(wú)顯著變化, 隨著脅迫濃度的升高, 在56.2 和100 mg/L 時(shí)表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低。

圖2 基因Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 和YAP/TAZ 在96h 急性Pb2+脅迫后大口黑鱸幼魚肌肉組織中的qPCR 分析Fig.2 qPCR analysis of Lats1/2, MOB1, KIBRA, FRMD, 14-3-3, TEAD, PP2A and YAP/TAZ in the muscle of largemouth bass under acute Pb2+ stress for 96h

3 討論

鉛是水體中常見的可持續(xù)釋放的生物非必需重金屬污染物, 具生物蓄積性和生物放大作用(Qian et al, 2020)。鉛離子在水體中對(duì)魚類有較強(qiáng)的毒性, 損傷魚體組織, 甚至可致其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生阻滯。Hippo信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、分化和抑制增殖來(lái)達(dá)到控制生物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中器官組織的大小(Agarwala et al, 2015)。在本實(shí)驗(yàn)中, 不同鉛離子濃度脅迫后大口黑鱸幼魚 Hippo 信號(hào)通路中 Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 和YAP/TAZ 基因表達(dá)量在不同組織中出現(xiàn)了不同程度的變化, 這一結(jié)果預(yù)示著鉛脅迫后大口黑鱸幼魚生長(zhǎng)發(fā)育很有可能通過(guò) Hippo 信號(hào)通路中這些主要調(diào)節(jié)因子來(lái)發(fā)揮作用。此外, 通路中的基因表達(dá)量變化不僅與鉛離子脅迫濃度相關(guān), 在不同的組織中表達(dá)量也不一致。

圖3 基因Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 和YAP/TAZ 在96h 急性Pb2+脅迫后大口黑鱸幼魚鰓組織中的qPCR 分析Fig.3 qPCR analysis of Lats1/2, MOB1, KIBRA, FRMD, 14-3-3, TEAD, PP2A and YAP/TAZ in the gill of largemouth bass under acute Pb2+ stress for 96h

前期對(duì)濃度為17.8 mg/L 鉛離子脅迫大口黑鱸幼魚后發(fā)現(xiàn)肝臟組織中YAP/TAZ mRNA 表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著上升等(Qian et al, 2020)。在Hippo 信號(hào)通路中, YAP/TAZ 蛋白可被 Lats1/2 磷酸化, 磷酸化的YAP/TAZ 蛋白繼而與胞質(zhì)中的 14-3-3 特異性結(jié)合,使得 YAP/TAZ 定位于胞質(zhì)中, 并被胞質(zhì)中的蛋白酶體泛素化后降解(Zhao et al, 2007; Lei et al, 2008), 進(jìn)而阻滯細(xì)胞核內(nèi)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而在Hippo 通路異常情況下, 未磷酸化的YAP/TAZ 進(jìn)入細(xì)胞核, 與TEAD 轉(zhuǎn)錄因子共激活和調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞增殖的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)(胡立橋等,2017), 且通路的異常激活極可能誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖,并發(fā)生組織病變甚至癌變(齊海霞等, 2020)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同鉛離子濃度脅迫處理后的大口黑鱸幼魚肝臟組織其他基因表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn), 10 mg/L 時(shí)表達(dá)量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化, 而在 17.8 mg/L 鉛離子水體中 96 h 后, MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 表達(dá)量較對(duì)照組均顯著升高, 其他濃度如31.6 mg/L 時(shí) MOB1、PP2A、14-3-3、TEAD 表達(dá)量顯著升高, 隨著鉛離子濃度的進(jìn)一步升高, 所研究的大部分基因表達(dá)量均無(wú)顯著變化, 從結(jié)果中可看出, 水體中17.8 mg/L 鉛離子濃度對(duì)大口黑鱸幼魚肝臟組織Hippo 信號(hào)通路的影響最大, 這可能的原因是在此濃度下, 鉛離子極大地促進(jìn)了KIBRA、FRMD 和MOB1的表達(dá), 并升高了 KIBRA、FRMD 和 MOB1 蛋白質(zhì)合成, 且在一定程度上提高了 LATS1/2 的表達(dá)量(與對(duì)照組相比表達(dá)量升高, 但未達(dá)到顯著水平), 我們猜測(cè)少量合成的 LATS1/2 在 MOB1 的協(xié)同作用下磷酸化部分YAP/TAZ, 但由于PP2A 表達(dá)量的顯著上升,可能導(dǎo)致PP2A 蛋白合成增加, 使得YAP/TAZ 去磷酸化, 因此這少量的 YAP/TAZ 可能在細(xì)胞質(zhì)中與表達(dá)量顯著升高的 14-3-3 特異性結(jié)合, 但可能不足以引起細(xì)胞凋亡, 而未被磷酸化或被 PP2A 去磷酸化的YAP/TAZ 則進(jìn)入細(xì)胞核作為共激活轉(zhuǎn)錄因子與表達(dá)量顯著升高的 TEAD 調(diào)節(jié)抑制細(xì)胞凋亡因子的基因轉(zhuǎn)錄, 可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖甚至異常增殖。此外, 在鉛離子濃度為31.6 mg/L 時(shí), 14-3-3 和TEAD 雖都顯著上升, 但YAP/TAZ 表達(dá)量上升不顯著, 可能的原因是高濃度的鉛離子脅迫已經(jīng)損傷肝細(xì)胞。

圖4 基因Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 和YAP/TAZ 在96h 急性Pb2+脅迫后大口黑鱸幼魚小腸組織中的qPCR 分析Fig.4 qPCR analysis of Lats1/2, MOB1, KIBRA, FRMD, 14-3-3, TEAD, PP2A and YAP/TAZ in the intestine of largemouth bass under acute Pb2+ stress for 96h

在本實(shí)驗(yàn)中, 肌肉組織中 YAP/TAZ 表達(dá)量只在17.8 mg/L 時(shí)顯著上升, 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 96 h 的鉛脅迫提高了 Lats1/2 和 MOB1 的表達(dá)量, 可能提高了Lats1/2 蛋白質(zhì)的合成, 而在此濃度下, PP2A 表達(dá)量變化不顯著, 合成的YAP/TAZ 在Lats1/2 的參與下磷酸化。但奇怪的是, 在此鉛離子濃度下, 14-3-3 基因表達(dá)量顯著下降, 我們推測(cè), 17.8 mg/L 鉛離子濃度脅迫下可能不會(huì)導(dǎo)致大口黑鱸幼魚肌肉細(xì)胞凋亡。在其他脅迫濃度下, 雖然基因表達(dá)量變化與17.8 mg/L 時(shí)不一致, 但總體上來(lái)看, 鉛離子脅迫對(duì)肌肉細(xì)胞的凋亡或增殖可能都沒有影響, 如鉛脅迫濃度 31.6 和100 mg/L 時(shí), 雖然 14-3-3 表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著上升, 但YAP/TAZ 表達(dá)量卻變化不顯著, 此外, TEAD變化也不顯著, 這使得14-3-3 不能與YAP/TAZ 結(jié)合,而即使 YAP/TAZ 進(jìn)入細(xì)胞核, 由于 TEAD 表達(dá)量變化不顯著, YAP/TAZ 也不能發(fā)揮共激活因子的作用。這些分子水平上的基因表達(dá)量變化的結(jié)果可能與肌肉組織對(duì)鉛離子的親和力較差有關(guān), 大量研究表明,鉛離子在魚體肌肉組織中的蓄積量小于肝臟組織(阮曉等, 2001; Rogers et al, 2003; Patel et al, 2006)。這說(shuō)明鉛離子對(duì) 96 h 脅迫后的大口黑鱸幼魚肌肉組織中Hippo 信號(hào)通路的影響較小。

鰓是魚類呼吸的主要器官, 是水體中鉛離子殘留和蓄積的主要部位(阮曉等, 2001; Rogers et al,2003)。在大口黑鱸幼魚鰓組織中, 10 mg/L 鉛離子脅迫96 h 對(duì)Hippo 信號(hào)通路影響較大, PP2A 表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著上升, 可致使 YAP/TAZ 去磷酸化增加, 從而導(dǎo)致進(jìn)入鰓細(xì)胞核的 YAP/TAZ 增加, 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看, 鰓細(xì)胞核中YAP/TAZ 和TEAD 表達(dá)量都顯著上升, 這可能導(dǎo)致鰓細(xì)胞的大量增殖甚至異常增殖。隨著鉛脅迫濃度的提高, 所研究基因大部分都相較于對(duì)照組顯著下降, 如在鉛離子脅迫濃度17.8 mg/L 時(shí), YAP/TAZ、14-3-3 和 TEAD 表達(dá)量都顯著下降, 在其他脅迫濃度如 56.2 和 100 mg/L 時(shí)YAP/TAZ 也都顯著下降。類似的結(jié)果還出現(xiàn)在不同濃度鉛離子脅迫 96 h 的大口黑鱸幼魚小腸組織中, 如在 56.2 和 100 mg/L 時(shí), KIBRA、MOB1、PP2A、YAP/TAZ、14-3-3 和 TEAD 基因 mRNA 表達(dá)量相較于對(duì)照組都顯著下降。目前還不清楚不同濃度鉛脅迫后為什么在鰓(除10 mg/L 鉛離子脅迫外)和小腸組織中會(huì)出現(xiàn)這樣的結(jié)果, 且與肝臟和肌肉組織的表達(dá)量變化相差很大, 一種可能的原因是鉛離子在大口黑鱸幼魚肝臟組織中的蓄積大于其他組織, 而腮組織在較低濃度10 mg/L 鉛離子脅迫處理96 h 時(shí)蓄積量較大, 從而導(dǎo)致入核的 YAP/TAZ 量增加, 而在其他脅迫濃度下, 可能在不到 96 h 時(shí)就已經(jīng)導(dǎo)致鰓組織損傷, 小腸組織亦同理。這應(yīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)充分了解鰓組織和小腸組織 Hippo 信號(hào)通路在鉛脅迫后出現(xiàn)的這種分子機(jī)理。

大口黑鱸為底棲性魚類, 重金屬鉛對(duì)其器官、組織的生長(zhǎng)發(fā)育影響較大, 嚴(yán)重時(shí)會(huì)不同程度損傷魚體組織, 在分子水平上, 則表現(xiàn)為不同組織中相關(guān)基因表達(dá)量的變化。Hippo 信號(hào)通路中的相關(guān)基因不僅與細(xì)胞凋亡相關(guān), 還與促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因表達(dá)有關(guān)。其中, Lats1/2、MOB1 是正向調(diào)節(jié)因子,Lats1/2 磷酸化 YAP/TAZ 后, 可間接促進(jìn) YAP/TAZ的降解, 最終結(jié)果致使細(xì)胞凋亡。而 PP2A 則與Lats1/2 作用相反, 使YAP/TAZ 去磷酸化, 致使進(jìn)入細(xì)胞核的YAP/TAZ 增加, 最終結(jié)果致使細(xì)胞大量增殖或異常增殖甚至癌變。本實(shí)驗(yàn)中, 不同濃度鉛離子96 h 脅迫處理大口黑鱸幼魚后, 肝臟組織(脅迫濃度 17.8 mg/L)和鰓組織(脅迫濃度 10 mg/L)是都出現(xiàn)了 YAP/TAZ 與 TEAD 表達(dá)量顯著上升, 這預(yù)示著此時(shí)肝臟組織和鰓組織有可能在鉛離子的作用下出現(xiàn)了細(xì)胞的異常增殖。

4 結(jié)論

鉛脅迫處理顯著影響了大口黑鱸幼魚Hippo 信號(hào)通路中的部分基因在肝臟、肌肉、鰓和小腸組織中mRNA 表達(dá)量。通過(guò)對(duì) Lats1/2、MOB1、KIBRA、FRMD、14-3-3、TEAD、PP2A 和YAP/TAZ 基因在肝臟、肌肉、鰓和小腸組織中的mRNA 表達(dá)量變化進(jìn)分析, 發(fā)現(xiàn)所研究基因的mRNA 表達(dá)量具有組織和濃度特異性, 且在肝臟組織中表達(dá)量變化顯著的基因都呈上調(diào), 而在肌肉、鰓和小腸組織中, 部分基因在某些鉛離子脅迫濃度下呈顯著下降。結(jié)果顯示不同濃度的鉛脅迫對(duì)大口黑鱸幼魚肝臟、肌肉、鰓和小腸組織中Hippo 信號(hào)通路有較大的影響。研究結(jié)果可為大口黑鱸對(duì)鉛離子脅迫后的 Hippo 信號(hào)通路研究提供理論依據(jù), 并可為其他魚類對(duì)鉛離子的分子響應(yīng)機(jī)制研究提供一定參考。此外, 結(jié)果顯示在鰓和小腸組織中KIBRA、MOB1等部分基因mRNA表達(dá)量在某些鉛離子脅迫濃度下相較于對(duì)照組呈顯著下降, 與肝臟組織中的表達(dá)量變化相反, 可能在不同組織中的表達(dá)存在不同的調(diào)控機(jī)制,在不同組織中鉛離子是如何影響Hippo 信號(hào)通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。