干血點技術在反興奮劑領域的應用研究與前景展望

荊京，單圓鴻，陳佩杰，徐昕

（上海體育學院國家興奮劑檢測上海實驗室（籌），上海200438）

世界反興奮劑機構（WADA）公布的禁用清單一直在不斷更新，每年都會增加新的禁用物質，興奮劑檢測工作時刻面臨著新的挑戰(zhàn)。新型興奮劑往往使用劑量較低，或結構與內源性代謝物極其相似，檢測難度較大。液相色譜和質譜聯(lián)用技術具有去干擾能力強、分析結果準確、檢測靈敏度高、可實現(xiàn)高通量檢測等優(yōu)點，適用于大部分禁用物質的檢測，已成為興奮劑檢測的主要方法之一。

在傳統(tǒng)的興奮劑監(jiān)控程序中，運動員的血液或尿液樣本均以液體的形式進行運輸和儲存，面對液體樣本的采集與運輸成本居高不下，長期保存的穩(wěn)定性又難以控制等問題，干血點（dried blood spot，DBS）技術作為一種更具優(yōu)勢的樣本采集與保存方法受到了越來越多的關注。DBS技術可將微量血樣保存在濾紙上，干燥后用于疾病篩查和檢測研究［1］。早在1963年就報道了DBS采樣方法的首次應用，從腳跟采集微量血樣用于診斷新生兒苯丙酮尿癥［2］。之后，該方法得到了進一步應用，尤其是在新生兒代謝異常篩查中［3-4］。在過去的幾十年里，液相色譜和質譜聯(lián)用的DBS分析方法逐步建立并發(fā)展，廣泛應用于疾病（如癌癥、糖尿病等）監(jiān)測、臨床前藥物開發(fā)、毒理學和藥代動力學研究、治療藥物監(jiān)測和代謝組學分析等各個領域［5-7］。

近年來，DBS與液相色譜和質譜技術的聯(lián)用在興奮劑檢測領域引起了廣泛的關注和研究。在2019年世界反興奮劑大會上，國際奧委會主席巴赫提出，反興奮劑實踐不斷對檢測技術提出更高要求，要大力支持創(chuàng)新型興奮劑檢查和檢測方法的研究與開發(fā)，并著重指出“DBS技術將有機會使反興奮劑工作產(chǎn)生革命性的劇變”［8］。WADA與世界各地的反興奮劑組織合作，積極推進DBS技術的開展和實施，以期應用于即將到來的2020年東京奧運會和2022年北京冬奧會的興奮劑檢測［9］。筆者簡述了DBS采樣技術及其在樣本采集、運輸、保存、樣本穩(wěn)定性等方面的優(yōu)勢，探討了DBS采樣技術在興奮劑檢測領域的現(xiàn)狀和應用前景，為DBS采樣技術在反興奮劑檢測領域的進一步研究和應用提供參考。

1 DBS采樣技術及其優(yōu)勢

DBS采樣技術是一種將全血樣品收集在卡紙上的采樣技術。全血滴加在濾紙片上，經(jīng)干燥后得到干血斑塊，再經(jīng)過溶劑萃取后，通過串聯(lián)質譜等方法對干血斑中的待檢測組分進行檢測分析［1］。采樣卡通過適宜的化學試劑處理后，具備溶解細胞、使蛋白變性、抑制細菌等其他微生物生長的功能。DBS樣本只需經(jīng)過室溫干燥，不需要任何其他處理，從化學原理上講，即分析物與血液成分吸附在固體纖維素基質上［1］。與傳統(tǒng)靜脈采血相比，DBS采樣簡便、量少且具有微創(chuàng)性［10］，其他的優(yōu)勢還包括樣本的保存和運輸簡易化、室溫下樣本較高的穩(wěn)定性、樣本采集過程中的可控性以及實現(xiàn)樣本處理自動化的可能性等［11-12］。

1.1 樣本的采集

全血采樣通常通過靜脈穿刺獲得樣本，采集方法較復雜，且需要大量血液以獲取分析檢測所需的足量血漿，并要求專門的醫(yī)學技術人員進行采樣，對采樣環(huán)境和采樣人員的要求較高。尿液樣本的收集也較為復雜，較容易被污染，可能出現(xiàn)尿樣偽造、操縱等情況［13］，并且尿液樣本檢測結果易受樣本采集時間的影響，受尿液pH值的影響，同時運動員個體間的代謝差異也比較大［14］；而DBS采樣技術通?？刹捎弥讣獯┐痰姆绞将@得全血樣本，采血量小，通常為20μL［15］，可直接將指尖血液滴到采樣卡上制備DBS樣本。因此，DBS的樣本采集，不易受采樣地點、時間以及采樣人員的限制。DBS采樣不必要求專業(yè)的醫(yī)學技術人員，非醫(yī)學專業(yè)的培訓人員也可進行有效采樣，也適用于其他非專業(yè)人員的自我取樣等，為大規(guī)模樣本的采集提供了可能［16-17］。另外，相對于傳統(tǒng)的血液樣本采集，DBS采樣雖仍有刺痛，但采血量少且整個過程具有微創(chuàng)性，特別是對于需要多次采集血樣的運動員，該采樣方式有更好的耐受性，可減輕血液采集帶給運動員的痛苦，并減少因多次采血造成的心理壓力。

在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)了幾種不同于傳統(tǒng)DBS采樣 技 術的設備 和方法，如HemaXis?（DBS System SA，Gland，Switzerland）、hemaPEN?（Trajan Scientific and Medical，Australia）采血裝置、VAMS?（volumetric absorptive microsampling，Neoteryx，USA）技術等，見圖1（a）、（b）、（c）。這些裝置通過手指采血后可自動形成DBS，而不需要手動點樣制備DBS，并且hemaPEN、VAMS采樣技術可形成4個體積相同的DBS樣本［18］。此外，也有可以從上臂采血的微創(chuàng)微采樣裝置，如TAPTM（Seventh Sense Biosystems，USA）采血設備，見圖1（d），緊貼上臂，一次性微型針頭以無痛的方式收集100μL的血液，之后可使用移液槍將20μL血液直接滴到采樣卡的圓圈內制備DBS［19］。TASSO?Sport On?Demand?（TASSO，USA）采血和樣本收集設備見圖1（e），在上臂無痛采血后可自動形成4個20μL（20μL±5%）的DBS樣本，與傳統(tǒng)的手指刺血針和DBS卡相比，此過程能通過完全集成的設備，實現(xiàn)更加一致、安全和快速的DBS樣品采集過程［13，20］。Fluispotter?采血裝置見圖1（f），通過上臂采血，可連續(xù)形成多個DBS樣本［21］。這些新型的DBS采血設備的出現(xiàn)更加有利于DBS技術在反興奮劑領域中的廣泛應用。

圖1新型DBS采血設備與技術Figure 1 Novel blood collection equipment and technology of DBS

1.2 樣品的保存與運輸

在目前的興奮劑檢查程序中，運動員的血液或尿液樣本均以液體的形式進行運輸和儲存，采集的全血樣本和尿液樣本需在低溫環(huán)境下進行儲存與運輸，對物流的要求較高（如冰箱、冷凍柜和干冰專用包裝等）。部分樣本還需長期低溫保存以備再次檢查。然而，即使保存在-80℃冰箱中，尿液和血液中的部分代謝物濃度仍會緩慢發(fā)生變化，影響測定結果的準確性。DBS樣本易于保存與運輸，樣品保存于帶干燥劑的密封袋中，可在室溫下儲存數(shù)周至數(shù)年，如果樣品含有不穩(wěn)定的化合物，則應根據(jù)實際情況儲存在低溫（2～8℃或≤-60℃）環(huán)境中。并且，按照上述方法包裝的DBS樣本可通過郵寄方式運輸，不僅降低了樣本的保存和運輸成本，而且還大大減少了因血樣暴露而導致的感染等問題［7，26］。此外，DBS樣本中的分析物通常表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的樣本基質（尿液、全血、血清、血漿）相比，DBS的基質性質以及分析物的吸附作用使得DBS中的分析物有較低的反應性［1］。DBS樣本穩(wěn)定性的提高可能是由于脫水干燥和酶解失活導致，樣品中存留的水分是化合物發(fā)生酶解或水解的關鍵因素［4，7］。

使用DBS技術為微量樣品的采集提供了簡便易行且具有優(yōu)勢的程序。DBS采樣可以采用自采樣的方法在家中或遠程進行樣本采集，運輸方式簡便，無復雜的運輸要求，降低了運輸和存儲成本，并在一定程度上改善了目標分析物在樣本基質中的穩(wěn)定性，在整個程序中顯著降低了接觸人員受感染的概率?；贒BS技術的這些優(yōu)勢，在某些不確定和特殊的情況下，也可能會實現(xiàn)通過遠程監(jiān)督的方式采集并獲得樣本，以維護興奮劑檢查程序和體育運動的完整性。

2 DBS采樣技術在興奮劑檢測中的應用研究

WADA公布的禁用清單包括對所有運動項目都禁用的蛋白同化制劑、肽類激素、利尿劑、糖皮質激素等10大類禁用物質和3類禁用方法，另外，還包括一類在某些特殊運動項目中禁用的β?阻斷劑。禁用清單中列出的物質數(shù)量每年都在增加，并且許多物質并不是只有單一的分析目標，必須通過不同的代謝物、降解產(chǎn)物或生物標記物等進行監(jiān)測。目前，已有研究［27］開發(fā)建立了450種興奮劑類物質的篩查方法。興奮劑檢測采集的樣本大部分是尿液樣本。使用尿液樣本進行興奮劑檢測仍存在一些不足之處。利尿劑的使用使尿液稀釋，降低了尿液中目標分析物的濃度。碳酸氫鈉等堿性物質的使用，減少了某些禁用物質的尿排泄［28-29］，這些都增加了對尿液樣本中禁用物質的檢測難度。DBS作為一種補充基質，將在興奮劑檢測中發(fā)揮其潛在應用價值。對于DBS采樣技術在各類禁用物質檢測方面的應用已有較多研究，并且在國際上也已有部分實驗室嘗試使用DBS技術進行興奮劑檢測。在PubMed［30］上以“dried blood spot and doping”“dried blood spot and LC?MS”為檢索關鍵詞對近10年的文獻進行檢索，分別檢索到34篇文獻和348篇文獻，筆者在檢索到的文獻中對當前DBS技術在各類禁用物質和禁用方法檢測研究中所占的比例進行統(tǒng)計，綜述DBS技術在蛋白同化制劑、肽類激素、血液興奮劑以及賽內禁用物質檢測中的研究進展（圖2）。

圖2 2010—2020年DBS技術在各類禁用物質和禁用方法檢測中的文獻統(tǒng)計結果Figure 2 The literature statistics of DBS technology in the detection of various prohibited substances and methods from 2010 to 2020

2.1 DBS與蛋白同化制劑檢測

據(jù)WADA統(tǒng)計，興奮劑違規(guī)事件中近半數(shù)是合成類固醇類興奮劑違規(guī)，因此，合成類固醇類興奮劑的準確篩查一直是研究人員關注的重點。目前實驗室常規(guī)檢測的類固醇類興奮劑及其代謝物種類近100種，其中存在大量同分異構體，還包含部分種類的內源性類固醇。該類物質特有的化學結構使其質譜檢測靈敏度較差，目前多采用衍生后進行氣相色譜串聯(lián)質譜（GC-MS/MS）的方法進行檢測［31］，內源性類固醇興奮劑的外部攝入還需要同位素比質譜（IRMS）進行確證［32］。而在進行IRMS檢測前，需要對樣本進行精細純化，并且分析通量低，檢測成本也相對較高。因此，基于液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）技術的類固醇類興奮劑的檢測方法開發(fā)，以及外源攝入的內源性類固醇特異性標志物的發(fā)現(xiàn)與檢測工作一直備受關注［33-34］。在世界體育運動中，睪酮是類固醇類興奮劑的主要濫用物質［35］，睪酮有多種形式和劑量，最廣泛的使用形式是肌內注射睪酮酯，十一酸睪酮酯也可以口服給藥。睪酮進入血液循環(huán)后吸收會減慢，從而產(chǎn)生長效作用［36-37］。當口服或注射睪酮酯制劑后，該酯會緩慢擴散到血液中。盡管酯酶的酶解過程立即開始，但在血液中仍可檢測到一定比例的睪酮酯原型［38-42］。在尿液中不存在睪酮酯原型形式，而是完全以少量游離睪酮及其代謝物的形式存在，因此，尿液樣本中內源性睪酮和外源攝入的睪酮混合存在，常規(guī)檢測難以區(qū)分。但如果在血液樣本中檢測到痕量睪酮酯的存在，即可確認其興奮劑違規(guī)。對6位志愿者分別單次注射不同睪酮酯制劑后，通過液相色譜質譜（LC?MS）檢測技術，在給藥后血樣中可直接檢測到睪酮酯。檢測時間在4 d到2個月以上，具體取決于所用酯的類型。通過血液樣本檢測睪酮酯可作為IRMS睪酮確證分析的補充［41］。Tretzel等［42］通過LC-MS/MS分析方法檢測了DBS樣本中8種類固醇興奮劑的酯化合物。該方法顯著提高了檢測類固醇類禁用物質的準確度以及靈敏度，在定性檢測分析合成類固醇類禁用物質方面具有一定優(yōu)勢［40］。

對于其他蛋白同化制劑，應用DBS也可能會提高檢測靈敏度以及檢出率。6個受試者一次給藥80μg的克倫特羅（比受污染肉中的劑量高），給藥后24 h的2個尿液樣本以及給藥后3～10 d收集的所有尿液樣本中克倫特羅濃度均低于5 ng/mL，個體間的尿液濃度差異很大［43］。根據(jù)《世界反興奮劑條例》第7.4條的修訂，尿液中克倫特羅濃度低于5 ng/mL的情況應報告為“ATF”（atypical finding），而不是“AAF”（adverse analytical finding）［44］，這是因為尿液中克倫特羅水平低可能是由于攝入了受污染的肉所致［45-46］。而DBS樣本在給藥24 h后均可檢測到克倫特羅（濃度均高于5 ng/mL），給藥后3 d的檢出率為50%［43］。

2.2 DBS與肽類激素檢測

近10年來，低分子質量（＜2 kDa）肽類和非肽類模擬物違禁物質的使用一直是預防性興奮劑研究的重點。藥 代 動力學研究表 明，血液中GHRP?2［47］和GHRP?6［48］有較高的清除率。在尿液基質中，肽類藥物與其代謝物同時存在，并且有研究［49-50］發(fā)現(xiàn)生長激素釋放的肽GHRP?1和alexamorelin在尿液中會迅速分解，檢測靈敏度也低于其代謝物。Lange等［51］開發(fā)了DBS樣本中肽類激素及其釋放因子的檢測方法，該方法采用LC?HRMS（液相?高分辨質譜）檢測技術以及全自動DBS樣本提取和在線固相萃取技術。目標分析物包括46種分子量小于2kDa的低分子量肽或非肽（模擬物），如促性腺激素釋放激素、生長激素釋放肽和抗利尿激素（血管升壓素）等。此外，還檢測了9種GHRP的甘氨酸衍生物，這些衍生物被認為可能是潛在的新型興奮劑。經(jīng)過人體試驗后，該方法也能成功檢測到GHRP?2和GHRP?6。Cox等［52］開發(fā)了基于運動員DBS樣本的胰島素樣生長因子?1（IGF?1）LC?MS檢測方法。IGF?1是生長激素（hGH）作用的主要中介物，可作為檢測重組人生長激素（rhGH）濫用的生物標志物。DBS也可用于直接檢測rhGH［53］，以及應用于蛋白標志物如纖維連接蛋白1（fibronectin 1）等間接檢測方法［54］。

2.3 DBS與血液興奮劑檢測

在血液興奮劑檢測方面，目前對于運動員自體輸血等血液興奮劑的檢測方式，通常使用運動員生物護照（ABP）的血液學模塊進行檢測，主要是通過監(jiān)測血紅蛋白濃度［Hb］和網(wǎng)織紅細胞百分比（Ret%）等指標隨時間的變化情況進行間接檢測［55-57］。該方法也有一定的局限性，并且對血液樣本的采集、運輸、檢測以及穩(wěn)定性都具有較高的要求。DBS采樣技術在采集、運輸以及保證樣本的穩(wěn)定性方面具有一定優(yōu)勢。DBS作為樣本基質進行血液興奮劑檢測已有多項研究，DBS既可應用于重組人促紅細胞生成素（rhEPO）的直接檢測［58］，也可應用于通過轉錄組標記物或蛋白標記物來檢測血液興奮劑的間接檢測方法。DBS樣本中RNA生物標志物可以有效地檢測血液興奮劑，紅細胞生成相關的ALAS2L、ALAS2LC、CA1和SLC4A1等基因表達水平隨興奮劑的使用而變化［19，59-60］。

通過LC?MS檢測DBS中的膜蛋白CD45、CD41、Band3、CD71等可間接檢測血液興奮劑的使用。該方法可對目前監(jiān)測的血液參數(shù)進行穩(wěn)定的縱向測量，以檢測血液興奮劑的使用［61］。其中CD71在未成熟網(wǎng)織紅細胞（IRC）中高度表達，負責將鐵轉運到細胞中以進行血紅蛋白合成［62］，在網(wǎng)織紅細胞成熟過程中表達降低，而在成熟網(wǎng)織紅細胞和紅細胞（RBC）中不存在［63-64］。與Ret%相比，CD71對紅細胞生成的變化更敏感，可以提高檢測靈敏度［54］。但是，缺鐵性貧血也會使血液中的CD71增加［65］，尤其是在女子馬拉松運動員、徑賽運動員和鐵人三項運動員中較常見［66-67］。因此，同時測量DBS中的血紅蛋白濃度將有助于檢測貧血運動員［61］，并進一步進行受試者給藥試驗研究，以確定DBS方法檢測血液興奮劑的有效性。另外，還有研究［68］發(fā)現(xiàn)通過LC-MS/MS檢測DBS樣本中的CD71/Band3比例能夠提高自體輸血的檢出率。CD71/Band3比例反映了血液中的未成熟網(wǎng)織紅細胞占紅細胞的百分比，它對紅細胞生成的變化比Ret%更為敏感［68］。但是還需要進一步檢測以確定CD71/Band3比例的縱向穩(wěn)定性，以及對海拔高度、高強度運動和rhEPO微劑量方法的反應。WADA在關于DBS應用于血液興奮劑檢測的研究中指出，無論是直接檢測還是通過縱向檢測方式（CD71+細胞），從干血點中檢測紅細胞生成刺激劑（ESA）濫用的能力對于未來的興奮劑檢測至關重要［69］。同時，WADA也積極鼓勵在DBS中探索研究ABP血液學模塊的新型鑒別標記物或干擾因子的標記物［70］。

2.4 DBS與賽內禁用物質檢測

在目前執(zhí)行的WADA禁用清單中，有4類禁用物質僅在比賽期間禁止使用，包括刺激劑、麻醉劑、大麻（酚）類和糖皮質激素類。DBS被認為是一種檢測禁用藥物的補充基質，特別是對于僅在比賽中禁止使用的物質，賽前或賽后的DBS檢測可以監(jiān)測運動員在比賽期間的血藥濃度水平，是對尿液樣本檢測的一種補充方法［71］。有研究通過液相色譜質譜檢測法對比了使用尿液樣本與DBS樣本檢測麻黃堿和甲基麻黃堿的有效性，結果表明，麻黃堿和甲基麻黃堿在尿液中的排泄量較易受到尿液pH值和尿量的影響，并且麻黃堿在尿液中的濃度不能反映循環(huán)中神經(jīng)刺激水平，而血藥濃度之間的個體差異較小，DBS樣本檢測方法可能更適用于比賽期間對刺激劑的檢測［14，72］。DBS與常規(guī)興奮劑檢測的尿液樣本共同采集檢測，能產(chǎn)生更大的優(yōu)勢和應用價值。

3 DBS采樣技術應用前景展望

目前，用于興奮劑檢測的樣本主要是全血、血清和尿液樣本。這些樣本基質要在嚴格控制的條件下從采樣點收集并轉移到獲得認證的反興奮劑實驗室進行檢測分析。基于當前整個程序的時間和成本效益、采樣方式的侵入性、分析物的穩(wěn)定性，以及后續(xù)的檢測分析乃至興奮劑結果管理等多方面，發(fā)現(xiàn)和應用一種有潛在價值的補充基質或替代基質是必要的［73］。DBS技術在反興奮領域中有較好的應用前景。如上文中所闡述的，無論是在樣本的采集、運輸、儲存、分析物穩(wěn)定性等方面，還是在興奮劑檢測方面，DBS技術都具有一定的優(yōu)勢。

當前用于興奮劑檢測的血液樣本通常采用靜脈采血的方式獲得。靜脈采血必須由持證的醫(yī)師采集。在大多數(shù)情況下，血液無法在采集地點加工成血清，必須在嚴格控溫的條件下96 h內運送到檢測實驗室［74］。這不僅大大增加了整個檢查程序的成本，而且可能還限制了樣本采集、檢測的時間和地點。DBS技術為微量樣本采集提供了簡捷可行的方法。DBS樣本的采集不僅具有微創(chuàng)性，而且采集樣本量少、采集方式簡單，能滿足自我取樣、非醫(yī)學技術專業(yè)人員取樣等，因此，DBS樣本的采集不會受到采樣地點和采樣人員等方面的限制，這也體現(xiàn)了DBS采樣技術的優(yōu)勢。并且，與傳統(tǒng)的尿液和血液樣本相比，DBS樣本減少了繁雜的運輸和存儲要求，降低了樣本運輸和樣本制備的成本。基于在采集、運輸和存儲上的優(yōu)勢，DBS樣本能提高分析物和生物標記物的穩(wěn)定性，同時也大大降低了接觸感染的發(fā)生率。在生物樣本的采樣、運輸和儲存方面，使用DBS技術進行的微采樣分析是一種更具優(yōu)勢的替代方法。

除了微創(chuàng)樣本采集程序及其經(jīng)濟優(yōu)勢外，DBS在興奮劑檢測方面同樣表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。DBS雖然樣本量少，但通常與LC?MS聯(lián)用，因此，具有較高的檢測靈敏度、精密度與準確度。目前研究表明，DBS能夠檢測出WADA公布的禁用清單中不同種類的違禁物質和方法，包括蛋白同化制劑，肽類激素、生長因子相關物質和模擬物，β2?激動劑，激素及代謝調節(jié)劑，利尿劑和掩蔽劑，刺激劑，麻醉劑，大麻（酚）類，糖皮質激素類以及β?阻斷劑等［13］，DBS作為一種新的樣本基質在興奮劑檢測中具有較好的應用前景。應用DBS可能會提高某些禁用物質（如合成類固醇類物質）的檢測靈敏度以及檢出率。其特有的化學結構使該類物質檢測靈敏度較低，并且該類物質存在大量同分異構體，還包含部分種類的內源性類固醇，使其檢測程序更復雜，分析通量低并且成本高。此外，當前采用的尿液基質中不存在其酯類形式，而血液基質中則存在，因此，DBS樣本提供了一種更具優(yōu)勢的補充基質。

對于半衰期較短的物質（如rhGH），直接檢測方式在一定程度上存在局限性，檢測窗口期較短；而rhGH注射后會導致體內多種生物指標發(fā)生變化，這些指標在人體內有更長的半衰期，同時受運動、禁食等狀態(tài)的影響較?。?4］，因此，對rhGH相關的生物學指標進行間接檢測具有重要的實用價值。與直接檢測法相比，間接檢測法增加了rhGH使用后的可檢出時間。并且，此類物質是賽內、賽外均被禁用的物質，因此要經(jīng)常進行檢測。使用DBS技術檢測IGF?1以間接監(jiān)測體育運動中的生長激素濫用［52］。這就提供了一種更容易實現(xiàn)的方法，在沒有持證醫(yī)師的情況下，可以經(jīng)常、不定期地在賽外通過指尖采血或其他DBS采樣裝置收集樣本，采樣量少，具有微創(chuàng)性，同時運輸和存儲成本較低。這種頻繁持續(xù)的檢測方法還可以為運動員個人提供更多的數(shù)據(jù)點，建立一個可以用于生長激素等其他禁用物質生物標志物的生物護照，類似于目前用于檢測血液興奮劑的生物護照?；贒BS?LC?MS的間接檢測方法可提高檢測靈敏度以及檢出率，該方法可能是興奮劑檢測中具有潛在優(yōu)勢的補充或替代方法。

然而，目前DBS樣本分析的前處理方法可能是影響該技術發(fā)展和應用的主要因素之一。由于樣本容量有限以及高度復雜的樣本基質（包括溶血的血細胞和高含量的可溶性和不溶性蛋白質等），這些都可能影響對目標物的分析檢測。自動DBS樣品制備工作系統(tǒng)與LC?MS的結合使用，有助于克服這一局限。傳統(tǒng)的DBS樣本處理是離線脫機進行的，通常需要進行液液萃取（liquid?liquid extraction，LLE）或固相萃取（solid?phase extraction，SPE），以達到樣本凈化和分析物富集的效果［75］，見圖3（a）。盡管用于離線DBS提取的過程相對簡單，但手動打孔的步驟非常繁瑣且耗時，尤其是在需要處理大量樣品的情況下，這大大降低了樣品通量。這可能是阻礙DBS采樣技術廣泛應用的一個因素。在線DBS提取和分析的全自動系統(tǒng)可能是解決這種障礙的有效方式。該系統(tǒng)通過一定量的溶劑流穿干血點的限定區(qū)域以解吸分析物，并通過在線SPE系統(tǒng)實現(xiàn)凈化和富集，然后進入LC?MS系統(tǒng)進行分離和檢測［74］，見圖3（b）。該技術避免了復雜耗時的手動打孔以及樣本離線處理過程，從而提高萃取效率，減少分析物損失，并因此提高分析的靈敏度。同時，DBS全自動前處理儀器可直接與MS連接，能夠實現(xiàn)樣本高通量。

圖3 DBS樣本處理和分析流程Figure 3 Sample processing and analysis process

DBS分析中要考慮的另一個方面是“血細胞比容（Hct）效應”［51，76］。血液在DBS濾紙上的擴散程度會影響DBS的定量分析，引起Hct依賴性偏差［51］。這種基于Hct的偏差來自以下3個方面：①由于血液的黏度與Hct呈正相關，因此與低Hct的血液相比，高Hct的血液在濾紙上的擴散程度較小。當將相同體積的血液加到濾紙上時，與低Hct的血液相比，較高的Hct的血液會產(chǎn)生較小直徑的斑點。因此，當對高Hct的DBS進行打孔分析時，可能導致測量值偏高。②Hct效應可能影響萃取效率并因此影響分析物的回收率。在一般情況下，高Hct的DBS可能使分析物的萃取效率和回收率降低，導致測量值偏低。③具有不同Hct的樣本也可以被認為是不同的基質，可能引起Hct依賴性基質效應［18］。

因此，對DBS樣本進行Hct測定可能是克服這一局限性的方法之一。DBS樣本中鉀離子（K+）濃度是Hct的有效標記物，可通過測定DBS萃取液中K+濃度來間接檢測DBS，并且K+濃度測定法可以校正咖啡因及其代謝物定量檢測中的Hct依賴性偏差［77］。近來，有研究發(fā)現(xiàn)，在DBS樣本進行前處理和分析之前，可通過近紅外（near infrared，NIR）光譜法實現(xiàn)對DBS樣本Hct的非破壞性檢測［51］，可在DBS全自動處理分析系統(tǒng)前聯(lián)用在線近紅外光譜儀，實現(xiàn)一體化自動化測定。Hct檢測方法的引入對興奮劑檢測有一定的價值，它可以通過Hct校正對分析物進行有效的定量檢測。此外，近來一些新興的微量采樣裝置和技術的出現(xiàn)可實現(xiàn)干血點體積和容量的固定，從而減少Hct效應。如VAMS技術采用指尖采血后，通過VAMS裝置可獲得容量體積一致的DBS樣本。hemaPEN技術可直接進行指尖采血，并可一次收集4個體積固定的樣品，將血液定量地收集到預先打孔的濾紙圓片上。Deprez等［18］的研究對hemaPEN制備的DBS與傳統(tǒng)點樣制備的DBS進行了對比分析，通過LC?MS/MS定量測定不同方式制備的DBS中的咖啡因及其代謝物副黃嘌呤，結果表明，hemaPEN生成的DBS，其定量結果受Hct的影響更小，hemaPEN裝置對Hct有更低的依賴性。通過LC?MS分析Fluispotter連續(xù)點樣的DBS樣本中的皮質醇濃度，與血漿樣本的皮質醇濃度具有良好的一致性，DBS樣本有較小的Hct效應。Fluispotter具有克服DBS定量分析中與Hct相關的樣品血容量變化的潛力［21］。因此，使用DBS進行定量測定時，可采用相應的方式減少Hct對結果的影響。但是，使用DBS進行定性分析時，不同的Hct對定性物質的檢測無顯著影響［51］。

DBS采樣技術在結果管理程序中也有重要的實用價值［71］。對于賽內禁用物質，同時檢測其血液濃度水平，將有利于改進常規(guī)的興奮劑檢測方法。DBS采樣技術是一種簡單且實用的補充方法，可提供目標分析物的血液濃度數(shù)據(jù)，從而為結果管理程序提供了更多、更準確的結果判定材料支持。DBS采樣技術將有很大的潛力來補充和改善常規(guī)興奮劑檢查程序。

由于禁用物質檢測方法的不斷改進，WADA允許對樣本進行長達10 a的再分析，因此，DBS樣本便捷、可長期存儲的儲存方式以及樣本中分析物的化學穩(wěn)定性是其優(yōu)勢所在。此外，DBS樣本的制備和分析是可自動化的，有望實現(xiàn)有效的高通量檢測。并且，與傳統(tǒng)的基質相比較，DBS樣本在興奮劑檢測中也具有一定的優(yōu)勢，DBS樣本在大多數(shù)類型禁用物質的檢測中均有研究，是一種良好的替代或補充基質。雖然DBS采樣技術在反興奮劑領域中處于起步階段，但這種實用而有效的微量采樣程序有望獲得更加廣泛的應用。

4 結束語

隨著實驗室檢測程序自動化程度的不斷提高，樣本檢測分析前步驟的簡化和加速顯得越來越重要。在不影響所需樣本質量的前提下，DBS樣本的采集在時間消耗、工作量和成本等各方面均表現(xiàn)出優(yōu)勢，簡便快捷的特性使其在整個分析檢測流程中易于實施與應用，從而提高檢測的效率和有效性。DBS采樣技術作為一種新型的采樣方式，將會使樣本采集、運輸、儲存乃至興奮劑結果管理產(chǎn)生較大的改進。同時，也應不斷完善DBS采樣技術，積極開發(fā)全自動DBS樣本處理分析方法，不斷擴大DBS中禁用物質的檢測范圍，研究開發(fā)新的DBS檢測方法，如開發(fā)和確認一種新的分析方法，用于檢測和定量DBS中的人絨毛膜促性腺激素（HCG）等［70］。由此，液相色譜和質譜聯(lián)用的DBS分析方法將在興奮劑檢測領域中得到更加廣泛的應用。此外，也應積極探討發(fā)現(xiàn)其他樣本基質和樣本采集方法，如干血漿采樣技術（dried plasma spot，DPS）在興奮劑檢測領域中的潛在優(yōu)勢［71］，從而為加強反興奮劑工作作出更大的貢獻。