油茶粕中茶皂素連續(xù)多級(jí)逆流水提工藝的建立

王佳佳，李國(guó)琰,，張 雁,*，廖 娜，魏振承，李巧玲

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；2.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

油茶作為我國(guó)四大木本油料樹種之一，其種植面積呈現(xiàn)逐年遞增態(tài)勢(shì)[1]。而油茶粕作為油茶籽提取茶油之后的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量達(dá)176萬(wàn)t。油茶粕的主要成分有蛋白質(zhì)、多糖和茶皂素[2]等，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；但由于茶皂素味苦且辛辣，對(duì)冷血?jiǎng)游镉卸綶3]，限制了油茶粕的高效利用。而茶皂素作為天然優(yōu)良的表面活性劑，具有較強(qiáng)的發(fā)泡[4]、乳化、分散、濕潤(rùn)[5]等作用，以及抑菌[6]、消炎[7]、鎮(zhèn)痛[8]、抗癌[9]等生理活性，其中，尤以抑菌作用最為顯著，可用于開發(fā)綠色天然食品防腐劑，也可應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等行業(yè)，而且提取茶皂素后的茶餅還可以利用其優(yōu)質(zhì)蛋白。因此，從油茶粕中提取茶皂素對(duì)于提高油茶粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、充分利用油茶粕資源，有著重大的現(xiàn)實(shí)意義，應(yīng)用前景廣闊。

茶皂素的提取方法主要有有機(jī)溶劑浸提法[10]和水提法[11]。有機(jī)溶劑浸提法成本較高，工藝復(fù)雜，設(shè)備要求高，對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染[10-12]。熱水浸提法相對(duì)簡(jiǎn)單[13]，成本較低，綠色環(huán)保；但熱水浸提法產(chǎn)量低，耗時(shí)長(zhǎng)[14]，不宜實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。而提高提取效率的方法有攪拌、多級(jí)多次提取、微波或超聲輔助[15]。其中微波或超聲輔助提取目前僅限于少量提取實(shí)驗(yàn)，而連續(xù)多級(jí)逆流提取工藝結(jié)合了攪拌和多級(jí)多次提取，在有效成分提取及保健食品行業(yè)已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用[16]。該方法采用正向進(jìn)料，逆向進(jìn)溶劑的方式，用新鮮的溶劑提取待提取物質(zhì)殘留最低的物料，低濃度料液浸泡待提取物質(zhì)含量低的物料，高濃度料液浸泡待提取物質(zhì)含量高的物料及未浸提的新鮮物料[17-18]，從而提高了提取液中目標(biāo)提取物的含量。本研究采用連續(xù)多級(jí)逆流水提取技術(shù)從油茶粕中提取茶皂素，以增加提取液中茶皂素的含量，提高提取效率，以期為工業(yè)化提取茶皂素工藝的改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶粕，廣東星匯生物科技有限公司；茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物有限公司；香草醛、濃硫酸、無(wú)水乙醇，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)藥劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，上海善可精密儀器有限公司；多功能粉碎機(jī)，德清拜潔電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1茶皂素含量的測(cè)定及得率計(jì)算

采用香草醛-濃硫酸法[19-21]，將1 mL樣品溶液、1 mL香草醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%)分別加入具塞試管中，然后將具塞試管置于冰水混合物中，向試管中加入8 mL硫酸溶液(體積分?jǐn)?shù)77%)搖勻，隨即移至60 ℃恒溫水浴中保持25 min，之后在室溫中冷卻，以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液為空白，測(cè)定其在540 nm時(shí)的吸光度。分別加入質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用同樣的步驟，將測(cè)得的樣品溶液吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比求出茶皂素的含量，并根據(jù)式(1)計(jì)算茶皂素得率(%)：

(1)

式(1)中，ρ，提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V，提取液體積，mL；m，油茶粕的質(zhì)量，mg。

1.3.2茶皂素提取的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取一定質(zhì)量(2 g)的油茶粕置于離心管中，分別在不同溫度、料液比、提取時(shí)間、pH值的條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。將提取液在5 000 r/min的條件下離心分離，測(cè)定上清液中茶皂素質(zhì)量濃度，并計(jì)算茶皂素得率，以確定最佳的單因素實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、提取時(shí)間、料液比為自變量，以茶皂素得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化茶皂素提取工藝，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平

1.3.4茶皂素提取粒度的選擇

將油茶粕粉碎后，分別過(guò)200、140、100、60、30目篩，將不同粒度的油茶粕在響應(yīng)面優(yōu)化的提取條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后離心取上清液測(cè)定茶皂素質(zhì)量濃度，計(jì)算得率，確定最佳提取粒度。

1.3.5連續(xù)多級(jí)逆流提取茶皂素條件優(yōu)化

連續(xù)多級(jí)逆流提取的整個(gè)過(guò)程一般分為啟動(dòng)和逆流提取2個(gè)階段[22-23]。以蒸餾水為溶劑，稱取油茶粕2 g/份，利用一組50 mL離心管模擬罐組式多級(jí)逆流水提取過(guò)程。以3級(jí)逆流提取為例，向油茶粕中按照料液比加入蒸餾水，提取完全后固液分離，收集油茶粕并記其為一級(jí)油茶粕Y1；向一級(jí)油茶粕Y1中按照同樣體積比加入蒸餾水，待固液分離后，收集油茶粕并記其為二級(jí)油茶粕Y2。此時(shí)一級(jí)油茶粕Y1和二級(jí)油茶粕Y2的制備及收集過(guò)程即逆流提取的建立，為啟動(dòng)階段。然后可進(jìn)入逆流提取的循環(huán)過(guò)程。在循環(huán)提取工序中，對(duì)提取3次的提取液進(jìn)行固液分離后收集提取液；蒸餾水在最后一次提取茶皂素時(shí)加入，之后隔一個(gè)級(jí)數(shù)進(jìn)行遷移，進(jìn)行3次提取后收集各級(jí)提取的提取液和油茶粕。經(jīng)過(guò)一次完整的循環(huán)后，將所有的提取液合并混勻。具體流程如圖1。

圖1 連續(xù)多級(jí)逆流提取流程

根據(jù)單級(jí)提取得到的優(yōu)化工藝，設(shè)定每一級(jí)提取時(shí)間為30 min，分別進(jìn)行1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)、4級(jí)、5級(jí)提取實(shí)驗(yàn)，考察連續(xù)多級(jí)逆流效果及確定最佳提取級(jí)數(shù)。再改變每一級(jí)的提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)，確定最佳的每級(jí)提取時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析采用Excel 2010、Design-Expert 8.0、SPSS Statistics 22及Origin Pro 9.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單級(jí)提取茶皂素優(yōu)化條件的確定

2.1.1茶皂素提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1 提取溫度的影響

提取溫度對(duì)得率的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著提取溫度的不斷升高，茶皂素的得率不斷提高。因?yàn)殡S著提取液溫度的升高，提取液的溶解度增大，并且可以提高傳質(zhì)速率，有利于茶皂素溶出；而在溫度升高到80～90 ℃時(shí)，茶皂素得率稍微降低，而且與70 ℃時(shí)無(wú)顯著性差異(P<0.05)，這可能是因?yàn)椴柙硭卦诟邷貤l件下不穩(wěn)定，容易分解[24]。綜合考慮設(shè)備要求與經(jīng)濟(jì)效益，初步選擇70 ℃為較佳的提取溫度。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.1.2 提取時(shí)間的影響

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，茶皂素得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中提取時(shí)間為90 min和120 min無(wú)顯著性差異(P<0.05)，但是與30、60、150 min時(shí)有顯著性差異(P<0.05)，見圖3。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間熱水浸提茶皂素分解所致，因此初步選擇提取時(shí)間為120 min。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.1.3 料液比的影響

料液比對(duì)得率的影響見圖4。由圖4可知，隨著提取液體積不斷增大，茶皂素得率有極顯著的提升(P<0.01)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶12 g/mL時(shí)，茶皂素得率增加速度趨于平緩，沒(méi)有極顯著性差異(P>0.01)。因?yàn)樘崛∫后w積的增大，可以增加茶皂素在提取液中的溶解量，同時(shí)降低溶液中茶皂素含量，增大傳質(zhì)動(dòng)力，有利于茶皂素的溶出。綜合考慮后續(xù)的濃縮和純化，初步選擇料液比1∶12 g/mL。

不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.1.1.4 pH值的影響

在不同的pH條件下，茶皂素得率沒(méi)有顯著性變化(P<0.05)，見圖5。因此在后續(xù)的提取實(shí)驗(yàn)中，選擇水-油茶粕體系原始pH值(6.5～7.5)進(jìn)行提取。

相同字母表示差異不顯著(P<0.05)。

2.1.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=17.71-0.33A-0.11B+1.62C-3.19AB+

2.10AC+2.60BC-3.92A2+0.062B2-0.13C2。

表3 回歸方程方差分析

2.1.2.2 響應(yīng)面分析

在響應(yīng)面圖中，通過(guò)觀察曲面的傾斜度確定兩者對(duì)響應(yīng)值的影響程度，曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著，曲線走勢(shì)平滑，其影響越?。欢雀呔€的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖觀察，發(fā)現(xiàn)料液比對(duì)茶皂素得率的影響最大，其次是提取時(shí)間和提取溫度(見圖6)。3個(gè)因素兩兩之間的交互作用顯著。

圖6 各因素交互作用對(duì)茶皂素得率的影響

2.1.2.3 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到預(yù)測(cè)的茶皂素提取的優(yōu)化工藝條件：提取時(shí)間84.53 min，提取溫度80 ℃，料液比1∶16 g/mL，在此條件下茶皂素得率預(yù)測(cè)為21.87%?？紤]到操作的便利性，將此條件修正為提取時(shí)間85 min，提取溫度80 ℃，料液比1∶16 g/mL，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得茶皂素得率為22.78%，與預(yù)測(cè)值總體吻合，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)茶皂素得率，優(yōu)化工藝條件較可靠。

2.2 油茶粕粒度對(duì)茶皂素得率的影響

100目以下，油茶粕粒度越小，茶皂素得率越高；油茶粕的粒度為60～100目(60≤粒度<100)時(shí)，得率最高，并與其他組有極顯著性差異(P<0.01)，見圖7。這是因?yàn)椴柙硭亓６刃。梢栽黾佑筒杵膳c提取液的接觸面積，從而提高得率；而隨著油茶粕粒度的進(jìn)一步縮小，油茶粕中的蛋白質(zhì)和多糖也進(jìn)一步溶出，增加了溶液的黏稠度，從而降低了茶皂素的傳質(zhì)效率，影響了茶皂素的提取。雜質(zhì)的溶出也為后續(xù)的分離純化增加了難度，因此選擇60～100目為較優(yōu)的油茶粕粒度。

不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 連續(xù)多級(jí)逆流提取工藝優(yōu)化結(jié)果

2.3.1逆流提取級(jí)數(shù)的確定

在響應(yīng)面優(yōu)化提取條件下，分別進(jìn)行1～5級(jí)逆流提取，結(jié)果見圖8。隨著提取級(jí)數(shù)的增加，提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度有極顯著性的提高(P<0.01)，當(dāng)提取級(jí)數(shù)為3級(jí)時(shí)，茶皂素的質(zhì)量濃度達(dá)到最大，并且與4級(jí)或5級(jí)提取時(shí)無(wú)顯著性差異(P>0.01)。因?yàn)槟媪魈崛≈写嬖谥B續(xù)的傳質(zhì)，增加逆流提取的級(jí)數(shù)，可以增加物料浸提的次數(shù)和浸提液的利用率；但是，隨著級(jí)數(shù)的增加，物料中有效成分的含量越來(lái)越低，而浸提液中有效成分的含量越來(lái)越高，在提取的有效成分達(dá)到飽和后，浸提液中有效成分含量幾乎不再增大，因此最佳級(jí)數(shù)的確定有利于生產(chǎn)效率的提高[25]。根據(jù)圖8的結(jié)果，選擇3級(jí)提取為優(yōu)化級(jí)數(shù)，即可以合理利用物料和溶劑，又能達(dá)到最佳的提取效果。

不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2每級(jí)提取時(shí)間的確定

選擇逆流提取級(jí)數(shù)為3級(jí)，每級(jí)提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，測(cè)定提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖9。從圖9可以看出，每級(jí)均提取20 min時(shí)，提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度最高，與其他組有顯著性差異(P<0.05)。因?yàn)椴柙硭氐奶崛∈抢糜筒杵芍胁柙硭氐母哔|(zhì)量濃度和提取液中的低質(zhì)量濃度之間的質(zhì)量濃度差，而隨著提取的進(jìn)行，質(zhì)量濃度差逐漸減小，傳質(zhì)速率降低，茶皂素提取變得緩慢[23]。時(shí)間太短，提取不夠充分；時(shí)間太長(zhǎng)，提取后期進(jìn)程緩慢，浪費(fèi)資源，而且茶皂素在高溫水溶液中不穩(wěn)定，因此選擇20 min作為合適的逆流提取時(shí)間間隔，從而保證每級(jí)的提取效果都達(dá)到最佳。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 單級(jí)提取與連續(xù)多級(jí)逆流提取的比較分析

在優(yōu)化提取條件下，單級(jí)提取85 min所得提取液中茶皂素質(zhì)量濃度為14.87 mg/mL，而連續(xù)多級(jí)逆流提取的提取液中茶皂素質(zhì)量濃度為33.14 mg/mL，比單級(jí)單次提取質(zhì)量濃度提高了1.23倍，提取時(shí)間縮短為60 min，提高了提取效率，可以大大減少后續(xù)的濃縮成本。

表4 單級(jí)提取與連續(xù)多級(jí)逆流提取結(jié)果對(duì)比

3 討 論

目前針對(duì)茶皂素的提取，主要有水提取法和有機(jī)溶劑法。其中宗毅等[11]利用超聲波-甲醇法從油茶粕中提取茶皂素，在甲醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取溫度30 ℃、料液比1∶7 mg/mL及提取時(shí)間30 min的最優(yōu)條件下，得到茶皂素提取率和純度分別為96.21%和59.3%。孫萬(wàn)里[26]使用乙醇為萃取劑，在浸提時(shí)間4 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)76%、料液比1∶11 g/mL、提取溫度81 ℃的條件下，茶皂素的得率為21.5%。胡平平等[27]在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶9 g/mL、提取時(shí)間4 h、提取溫度90 ℃的條件下，得到茶皂素得率為8.98%。栗銘澤等[28]首次采用油茶粕造粒后連續(xù)提取茶皂素的方法，以乙醇為浸提溶劑，模擬工廠逆流連續(xù)提取的生產(chǎn)工藝，在提取溫度65 ℃、提取時(shí)間120 min，物料含水率6.57%的條件下，茶皂素殘留1.79%。甲醇或乙醇提取茶皂素的得率與本研究的差異不顯著，但是提取時(shí)間普遍較長(zhǎng)，溶劑使用量大，尤其是甲醇具有較高的毒性，對(duì)環(huán)境造成一定的污染，對(duì)提取設(shè)備要求更高。

本研究利用水溶液結(jié)合連續(xù)多級(jí)逆流提取，綠色環(huán)保，縮短了提取時(shí)間，更易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。茶皂素水提液可用于啤酒工業(yè)的發(fā)泡劑和穩(wěn)定劑，用于加氣酒中，使其具有豐富的泡沫，也可應(yīng)用于開發(fā)洗發(fā)水，香皂等洗滌用品。因茶皂素水提溶液沒(méi)有化學(xué)試劑殘留的問(wèn)題[29]，應(yīng)用在食品和日化領(lǐng)域，更加安全環(huán)保。同時(shí)，由于提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度得到提高，可不經(jīng)過(guò)濃縮，根據(jù)實(shí)際需要簡(jiǎn)單去雜后直接利用，可減少能耗，降低生產(chǎn)成本。茶皂素在食品中的應(yīng)用及洗滌用品配方設(shè)計(jì)、性能測(cè)試方面還需研究，以期為進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得到優(yōu)化的單級(jí)提取茶皂素條件為提取時(shí)間85 min，提取溫度80 ℃，料液比1∶16 g/mL，在此條件下，提取液中茶皂素質(zhì)量濃度為(14.87 ± 0.59)mg/mL，茶皂素得率為22.78%。另外茶皂素粒度為60～100目是較合適的提取粒度。

在單級(jí)提取基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)連續(xù)多級(jí)逆流提取的優(yōu)化提取級(jí)數(shù)為3級(jí)，每級(jí)的較佳提取時(shí)間為20 min，得到提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度為(33.14±0.33)mg/mL，比單級(jí)提取液中質(zhì)量濃度提高了1.23倍，而且提取時(shí)間減少了29.41%，提高了提取效率。