HPLC法測定食用動物油脂中丙二醛殘留量

鄒沫君，陳誠

1. 樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）；2. 山東高速四川產(chǎn)業(yè)運營公司（樂山 614000）

油脂受到光、熱、空氣中氧的作用，發(fā)生酸敗反應(yīng)，分解出醛、酸之類的化合物，丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)物的一種，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，從丙二醛含量可反映油脂過氧化的程度[1-2]。此外，丙二醛含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，可以反映機體脂質(zhì)過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度，在機體衰老生理和抗性生理研究中丙二醛含量也是一個常用指標(biāo)[3-4]。

試驗根據(jù)丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色的MDA-TBA化合物這一測定原理，對測定條件進行優(yōu)化，顯著節(jié)省前處理時間，減少有毒有害溶劑的使用和待測組分的損失，采用二極管陣列檢測器，屏蔽雜質(zhì)在紫外區(qū)對樣品測定的干擾，方法快速、靈敏度高，適用于食用動物油脂中丙二醛殘留量的測定[5-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5批試樣（市售，包括1批食用豬油、1批食用牛油、1批食用羊油、1批食用雞油、1批食用鴨油）；丙二醛乙縮醛（98.36%，Lot M1906002，2～8 ℃貯藏，Pure Chemland）；甲醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸（TBA）、乙酸銨（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；實驗室用水為超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）；0.22 μm水系進口聚醚砜PES濾膜（PALL公司）；雙層定量慢速濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DGU-20A3R島津高效液相色譜儀（帶SPD-M20A二極管陣列檢測器，日本島津公司）；CP-225D電子天平（Sartorius公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SHA-B水浴恒溫培養(yǎng)振蕩器（常州冠軍儀器制造有限公司）；UPT-Ⅱ-10T優(yōu)普系列超純水機（成都超純科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Thermo公司）；流動相：0.01 mol/L乙酸銨-甲醇=65∶35（體積比）；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10.0 μL；SPD-M20A二極管陣列檢測器波長200～800 nm，定值波長530 nm。

1.3.2 試樣制備與提取

稱取5 g（精確到0.001 g）均勻試樣于100 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL三氯乙酸混合液（準(zhǔn)確稱取37.50 g三氯乙酸及0.50 g乙二胺四乙酸二鈉，用水定容至500 mL），在振蕩器上以50 ℃、300 r/min振蕩提取30 min，取出，冷卻至室溫，用雙層定量慢速濾紙過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。

1.3.3 試樣的衍生化

準(zhǔn)確移取5 mL 1.3.2中濾液置于25 mL具塞比色管中，加入5 mL硫代巴比妥酸（TBA）水溶液，加塞，混勻，置于90 ℃水浴內(nèi)反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，取適量上層清液過0.22 μm水系濾膜，供HPLC分析。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.315 g（精確到0.000 1 g）丙二醛乙縮醛，用水溶解后稀釋至1 000 mL，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于冰箱4 ℃儲存，有效期3個月。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用三氯乙酸混合液配成質(zhì)量濃度1.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液，繼續(xù)用三氯乙酸混合液稀釋成0.01，0.05，0.10，0.15，0.25，0.50和2.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確移取5 mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與試樣提取液一同衍生后，在設(shè)定的色譜條件下，濃度由低到高進行進樣，采用外標(biāo)法定量，作峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測譜圖

在1.3.1的色譜條件下，丙二醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液、試樣溶液及試樣加標(biāo)溶液色譜圖見圖1～圖3。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 試樣色譜圖

圖3 試樣加標(biāo)色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限考察

試驗采用外標(biāo)法，配制成1.3.4的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在1.3.1的色譜條件下進樣檢測，得到丙二醛的峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系，擬合回歸方程式，確定相關(guān)系數(shù)、最低檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），詳見圖4和表1。結(jié)果表明，丙二醛在0.01～2.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且該方法檢出限低、靈敏度高，完全能滿足丙二醛含量分析檢測的要求。

圖4 丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 丙二醛的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限、定量限

2.3 精密度考察

取1.3.4的線性第4點標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.1的色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄丙二醛色譜圖峰面積。計算RSD值為0.68%，表明儀器精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗（n=6）

2.4 重復(fù)性考察

取編號為食用豬油試樣，按1.3.2、1.3.3的方法制備6份供試品溶液進行色譜分析，在1.3.1的色譜條件下測定丙二醛的殘留量。計算RSD值為1.47%，表明方法重復(fù)性好，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗（n=6）

2.5 穩(wěn)定性考察

取制備好的編號為食用豬油試樣供試品溶液，按1.3.1的色譜條件分別于0，4，8，12，16，20和24 h進樣，測定丙二醛色譜峰面積，計算RSD值為0.28%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗（n=6）

2.6 耐受性考察

取1.3.4的線性第4點標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別考察采用不同柱溫（34，35和36 ℃），以及不同流速（0.9，1.0和1.1 mL/min）進行測定時儀器色譜行為的變化。以峰面積計，不同柱溫條件下RSD為0.56%；不同流速條件下RSD為0.59%。表明在實際測定過程中色譜條件有微小變化時，食用動物油脂中丙二醛含量測定條件較寬，測定結(jié)果不受影響，系統(tǒng)具有較好的耐受性。

表5 耐受性考察表（n=3）

2.7 回收率考察

表6 丙二醛加標(biāo)回收率（n=3）

分別取一定的食用豬油、食用牛油、食用羊油、食用雞油、食用鴨油試樣，添加0.1，0.2和0.6 mg/kg 3個濃度水平的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照所建立的方法進行處理和測定，對每個添加水平做3次平行試驗，計算丙二醛的平均回收率及其RSD值（見表6），考察方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，丙二醛平均回收率在97.41%～102.25%，RSD值為1.08%～2.15%，方法準(zhǔn)確度高，符合丙二醛分析檢測要求。

3 討論

3.1 流動相的選擇

試驗?zāi)康氖强焖佟⒂行Х蛛x出丙二醛，參考文獻[7-9]，采用0.01 mol/L乙酸銨溶液和甲醇作為流動相，進行等度洗脫。在優(yōu)化的色譜條件下，目標(biāo)物得到有效分離，縮短分析時間，且峰形良好，實際試樣無干擾峰。

3.2 衍生反應(yīng)溫度的選擇

取丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在50，60，70，80，90和100 ℃下分別與硫代巴比妥酸（TBA）水溶液反應(yīng)，結(jié)果表明適當(dāng)提高溫度有利于衍生反應(yīng)的進行，經(jīng)測定，在90 ℃時生成衍生產(chǎn)物量最大，但繼續(xù)升溫對衍生產(chǎn)物的生成量影響不大，反而有下降趨勢，為了避免其他副反應(yīng)的產(chǎn)生，選擇90 ℃作為衍生反應(yīng)溫度[10]。

3.3 測定波長的選擇

為使丙二醛獲得較好的靈敏度，試驗利用二極管陣列檢測器多通道檢測功能，優(yōu)先選擇特征性較強的可見波長作為丙二醛的定值波長，明顯提高丙二醛的靈敏度和特異性，克服洗脫時的基線漂移，減少共存物的干擾[11]。通過綜合比較確定丙二醛的定值波長為530 nm。

4 結(jié)論

建立HPLC法測定食用動物油脂中丙二醛殘留量的檢測方法。與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定相比，工作效率顯著提高，且前處理和色譜分析方法簡便，檢出限低，方法精密度和準(zhǔn)確度好，能滿足食用動物油脂中丙二醛殘留量的測定要求，可應(yīng)用到實驗室開展食用動物油脂中丙二醛殘留量的檢測工作中。