HPLC同步測定禿瘡花中紫堇丁堿同分異構(gòu)體的含量

倪居，田野，張效斌，高金鑫，張衛(wèi)，周樂

1. 鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院（鄭州 451460）；2. 河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院烹飪食品與健康學(xué)院（鄭州 450046）；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院（楊陵 712100）

禿瘡花[Dicranostigma leptopodum（maxim.）Fedde，DLF][1]，又名滇川禿瘡花、禿子花、紅茂草、勒馬回（陜西），屬于罌粟科禿瘡花屬。帶根全草民間供藥用，春夏采集，曬干；性涼，苦澀味，有毒；有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲的功效；用于治療扁桃體炎、牙痛、咽喉痛、淋巴結(jié)核，主治咽喉痛、扁桃體炎、齒齦腫痛、禿瘡、瘰疬、癤瘡、尋常疣、疥癬、癰疽、頭癬、體癬等?，F(xiàn)代藥理研究證明，傳統(tǒng)中草藥禿瘡花提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、殺蟲等多種藥理活性[2-4]。禿瘡花化學(xué)成分主要為多種異喹啉類生物堿[5]。其中，生物堿包括阿樸啡型、原小檗堿型、原阿片堿型，對癌細(xì)胞系如SMCC-7721、A549、HT-29、KB和p388等癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可抑制癌細(xì)胞增殖[6]，可能是禿瘡花抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

工藝研究指出異紫堇丁堿在該植物中的含量較高[7]，并且具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而有關(guān)同步提取分離和HPLC同步測定紫堇丁堿同分異構(gòu)體的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。試驗(yàn)采用超聲提取法和硅膠柱層析法分離純化紫堇丁堿和異紫堇丁堿，通過HPLC同時(shí)測定其含量，以期為禿瘡花的有效利用和資源開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

禿瘡花為花期全草，2018年5月采自陜西省西北農(nóng)林科技大學(xué)北校園區(qū)。經(jīng)過西北農(nóng)林科技大學(xué)苗芳教授鑒定為禿瘡花（Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde）。自然風(fēng)干，粉碎后用孔徑0.150 mm篩篩分，密封，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試驗(yàn)試劑

甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、氨水、氫氧化鈉等（分析純，天津市津東天正精細(xì)化化學(xué)試劑廠，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；48～74 μm氧化鋁、GF254薄層層析硅膠、74～149 μm和48～74 μm柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；0.5% CMC、110 ℃活化GF254薄層層析硅膠（自制）；羧甲基纖維素鈉（CMC）（南京化學(xué)試劑公司）；75%乙醇、95%工業(yè)乙醇（山東安捷高科公司）；色譜純甲醇（德國默克）；超純水（上海和泰）。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JPCT-20L型超聲提取器（無錫久平儀器有限公司）；WFH-203三用紫外分析儀（上海光譜儀器有限公司）；BC-R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HPLC（Waters公司）；C-18反相色譜柱（Merk公司）；CP224C萬分位電子分析天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；YP30002電子天平（上海越平科學(xué)儀器蘇州制造有限公司）。

E2695 Waters高效液相色譜儀；1525-2707 TCM-2489色譜系統(tǒng)（Water 1525 Binary HPLC Pump，Water 2707 Autosampler，Water 2489 UV/Visible Detector）；柱型C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Breeze電腦程序系統(tǒng)。

1.4 提取分離試驗(yàn)方法

將禿瘡花全草藥材干燥粉碎，取其干粉400 g，用2 000 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，在常壓下按照1∶5（g/mL）的固液比超聲波提取3次，45 ℃，每次1 h，過濾，合并濾液，50 ℃減壓回收溶劑，制得乙醇提取物用水充分混懸后，依次用極性由小到大的不同溶劑萃取。用等量石油醚溶劑連續(xù)萃取3次，混合萃取液，并減壓蒸餾除去石油醚溶劑，得石油醚萃取相浸膏，剩余水相，加入鹽酸進(jìn)行酸化（pH 1～2），用等量氯仿溶劑萃取3次，合并萃取液，減壓除去氯仿溶劑，得酸化氯仿相。取1.00 g禿瘡花酸化氯仿相，用48～74 μm硅膠柱層析和中性Al2O3柱層析（規(guī)格：35 mm× 280 mm），洗脫劑依次為V（CHCl3）∶V（CH3OH）= 15∶1～8∶1，分離得到196.9 mg紫堇丁堿和488.6 mg異紫堇丁堿[8]。紫堇丁堿占酸化氯仿相的19.7%，異紫堇丁堿占酸化氯仿相的48.9%，兩者合計(jì)共占酸化氯仿相的68.6%，是酸化氯仿相的主要有效成分。

2 含量測定

2.1 供試樣品及濃度配制

實(shí)時(shí)提取物[9]：稱取5 g禿瘡花全草粉末，用95%工業(yè)乙醇，于50 ℃超聲提取，提取3次，每次1 h，制得0.855 g醇提物，命名為TCH-1。

禿瘡花中生物堿類化合物紫堇丁堿（Cor）、異紫堇丁堿（Iso-Cor）均為研究分離、提取和純化的單體化合物。

稱取相應(yīng)量的醇提物和單體化合物，用色譜甲醇溶解，并用0.22 μm超濾膜過濾，配制成相應(yīng)濃度的甲醇溶液。生物堿單體化合物濃度和醇提物濃度配制梯度見表1和表2所示。

表1 禿瘡花生物堿類單體化合物濃度梯度配制表

表2 禿瘡花醇提物濃度梯度配制表

2.2 定量分析方法[10-11]

采用HPLC（1525-2707 TCM-2489色譜系統(tǒng)）、柱型C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水洗脫體系，洗脫方法為：0～5 min用10%甲醇-水體系溶液平衡柱子，5～35 min由10%甲醇水溶液過渡到100%甲醇體系，進(jìn)行10%甲醇-100%甲醇體系梯度洗脫，45～48 min由100%甲醇過渡為10%甲醇-水體系，48～50 min用10%甲醇-水體系平衡柱子。上樣量1 mL，進(jìn)樣體積10 μL，每個(gè)樣品運(yùn)行檢測時(shí)間為50 min，柱溫30 ℃，檢測波長260 nm。

2.3 醇提物和單體化合物的保留時(shí)間與峰值

圖1為10 g/mL禿瘡花乙醇提取液HPLC分析色譜圖，橫軸是保留時(shí)間（單位是min），縱軸是電信號（單位是Au）。在保留時(shí)間22 min時(shí)有高強(qiáng)度色譜峰。圖2為同一條件下紫堇丁堿和異紫堇丁堿的色譜圖，其保留時(shí)間與禿瘡花醇提物一致。

2.4 含量分析

單體化合物的含量計(jì)算方法：設(shè)單體化合物的濃度梯度，經(jīng)HPLC分析，建立積分面積與濃度之間關(guān)系的回歸方程、線性關(guān)系和保留時(shí)間（見圖5和表3）；將醇提物中該物質(zhì)在某一濃度（如10 mg/mL）下的峰面積（y）代入回歸方程，計(jì)算出該物質(zhì)的質(zhì)量濃度x（mg/mL）；將x帶入物質(zhì)的含量計(jì)算公式，可得該單體化合物在原材料中的含量（注：根據(jù)前期試驗(yàn)，提取率按照平均為17%進(jìn)行計(jì)算）。禿瘡花中紫堇丁堿含量為0.79%、異紫堇丁堿含量為1.33%。

圖1 禿瘡花醇提物（10 mg/mL）的保留時(shí)間以及吸光度峰值

圖2 紫堇丁堿和異紫堇丁堿的保留時(shí)間以及吸光度峰值

圖3 紫堇丁堿和異紫堇丁堿的積分面積與濃度線性回歸方程和關(guān)系圖

表3 2種生物堿單體化合物的線性回歸方程和保留時(shí)間

3 討論

利用峰面積與單體化合物濃度之間線性回歸方程和物質(zhì)的含量計(jì)算公式，計(jì)算出單體化合物在各自原材料中的含量。異紫堇丁堿占酸化氯仿相的48.9%，紫堇丁堿占酸化氯仿相的19.7%，兩者合計(jì)共占酸化氯仿相的68.6%；建立積分面積與濃度之間關(guān)系的回歸方程，紫堇丁堿y=16 369 907.7x-393 024.811（R2=0.999 872 719），禿瘡花中紫堇丁堿含量為0.79%；異紫堇丁堿y=13 281 438.44x-36 671.693 15（R2=0.999 834 091），禿瘡花中異紫堇丁堿含量為1.33%。

4 結(jié)論

建立禿瘡花中紫堇丁堿和異紫堇丁堿的同步提取分離制備方法，采用HPLC研究藥用植物禿瘡花中分離得到的同分異構(gòu)體在植物中的含量，并與粗提物保留時(shí)間對比定位，檢驗(yàn)試驗(yàn)工藝的可行性，初步建立HPLC同時(shí)測定生物堿的檢測方法。為進(jìn)一步研究禿瘡花的藥理活性和構(gòu)效關(guān)系提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為藥食同源植物中單體化合物含量的定量測定奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。