絲瓜花不同溶劑提取物抗氧化活性及其酚類成分分析

鄢貴龍 ，劉楊，李學(xué)鵬，張潔

1. 江蘇省食品質(zhì)量安全與營養(yǎng)功能評價重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室（淮安 223300）；2. 淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院（淮安 223300）

絲瓜（Luffa cylindrica（L.）Roem.）為葫蘆科絲瓜屬一年生攀緣藤本植物[1-2]，被廣泛栽培于溫帶和熱帶區(qū)域，在我國各地也均有種植。絲瓜果實(shí)是我國常見的一種食用瓜類蔬菜，除食用價值外，其味甘、性平，具有涼血解毒、祛風(fēng)化痰等藥用功效[3-6]。而絲瓜絡(luò)、絲瓜藤葉、絲瓜種子等均有藥用價值，具有清涼利尿、舒筋活血、涼血解毒、止咳祛痰等醫(yī)療保健功能[7-10]。

在我國，絲瓜花也是民間傳統(tǒng)的食材。絲瓜花營養(yǎng)豐富，而且具有很好的藥用功能。中醫(yī)認(rèn)為其能清熱解毒，消痰下氣，退火毒，治瘡毒[11-12]。但是，目前對于絲瓜花的研究鮮見報(bào)道，因此，以不同溶劑對絲瓜花進(jìn)行提取，采用多種方法分析不同提取物的抗氧化活性，并對提取物部分有效成分進(jìn)行高效液相色譜分析。試驗(yàn)結(jié)果將為絲瓜花的綜合開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

絲瓜花，收集于江蘇省淮安市淮陰縣。

1.2 試劑

沒食子酸、3, 4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、（±）-兒茶素水合物、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、木犀草素、對香豆酸、芹菜素、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、楊梅素、山奈酚、槲皮素、2, 4, 6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Folin- Ciocalteu酚試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2, 2-二苯基-1-吡咯肼基（DPPH），TCI化學(xué)工業(yè)有限公司；HPLC級甲酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HPLC級乙腈，江蘇漢邦科技有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

Infinite 200pro多功能酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司；inifinte1260高效液相色譜（配備G1311A四元泵、G1315B紫外檢測器、G1313A自動進(jìn)樣器、G1379A柱溫箱和Chemstation工作站），美國Agilent公司。

1.4 方法

1.4.1 抗氧化物質(zhì)提取

將干燥的絲瓜花粉碎后分別用無水乙醇、70%乙醇、40%乙醇和水提取。取50 g花與400 mL不同溶劑混合，并于50 ℃超聲處理30 min，然后用濾紙過濾，濾渣用相同溶劑再萃取兩次，合并濾液于50 ℃真空蒸發(fā)，進(jìn)一步通過冷凍干燥獲得干燥的提取物并保存在-20 ℃。使用時用DMSO將提取物溶解并稀釋以評估其抗氧化能力。

1.4.2 總酚含量的測定

總酚含量（TPC）測定采用Folin-Ciocalteu方法[13]并進(jìn)行少許修改。取10 μL適當(dāng)濃度的提取物樣品溶液和60 μL水于96孔板中混勻，然后加入50 μL稀釋5倍的Folin-酚試劑并混勻，靜置5 min后加入60 μL 20% Na2CO3溶液，混勻后室溫靜置2 h，于760 nm測定吸光度。以沒食子酸作為對照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以每克干提取物的沒食子酸當(dāng)量（mg GAE/g DW）表示。

1.4.3 總黃酮含量測定

總黃酮含量（TFC）測定采用Chen等[14]報(bào)道的方法并進(jìn)行少許修改。在96孔板中將20 μL的樣品溶液與12 μL的5% NaNO2溶液混合，5 min后加入12 μL 10% AlCl3溶液并充分混合，反應(yīng)6 min后，再分別加入80 μL 1 mol/L NaOH和76 μL水，充分混勻后于510 nm處測定吸光度。以槲皮素作為對照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總黃酮含量以每克干提取物的毫克槲皮素當(dāng)量（mg QE/g DW）表示。

1.4.4 DPPH·清除活性的測定

采用文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測定。將10 μL不同濃度的樣品溶液和190 μL 0.2 mmol/L DPPH·甲醇溶液混勻于96孔板中，室溫避光靜置反應(yīng)30 min后，于517 nm處測定吸光度，DPPH·清除率按式（1）計(jì)算：

DPPH·清除率=（Ac-As）/Ac×100% （1）

式中：As為樣品的吸光度；Ac為溶劑空白吸光度（以樣品溶解試劑代替測試樣品）。

1.4.5 超氧陰離子自由基清除活性測定

參考文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道方法測定超氧陰離子自由基清除活性并進(jìn)行適當(dāng)修改。分別取核黃素、甲硫氨酸和NBT溶液加入96孔板中，總體積為180 μL，然后加入20 μL不同濃度的樣品溶液。反應(yīng)混合物中核黃素、甲硫氨酸和NBT溶液以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）配制，其終濃度分別為3×10-3，10.0和0.1 mmol/L。溶液混合后以兩支20 W的熒光燈（1 000 Lux）照射25 min，然后在560 nm處測定吸光度。超氧陰離子自由基清除活性按式（2）計(jì)算：

式中：As為樣品的吸光度；Ac為溶劑空白吸光度（以樣品溶解試劑代替測試樣品）。

1.4.6 鐵離子還原力（FRAP）測定

FRAP測定依據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道方法測定并進(jìn)行適當(dāng)修改。將10 μL不同濃度的樣品溶液與190 μL FRAP溶液混合（FRAP溶液：0.3 mol/L乙酸鹽緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ（以40 mmol/L HCl配制）、20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液以10∶1∶1（V/V）的比例混合），在黑暗中反應(yīng)30 min后于593 nm處測定吸光度。吸光度大小表示其抗氧化活性強(qiáng)弱。

1.4.7 亞鐵離子螯合能力測定

采用Gallegos-Tintoré等[19]和Yan等[13]的方法并稍加修改。取10 μL樣品溶液、150 μL甲醇和10 μL FeCl2溶液（2 mmol/L）加入96孔板中，混勻后反應(yīng)5 min，加入20 μL TPTZ溶液（5 mmol/L），混勻后室溫反應(yīng)10 min，然后在562 nm處測定吸光度。以EDTA-Na2為陽性對照。亞鐵離子螯合能力按式（3）計(jì)算：

式中：Ac為空白對照的吸光度（含測試樣品以外的所有試劑）；As為樣品的吸光度。

1.4.8 酚類化合物的HPLC分析

HPLC分析色譜柱為漢邦Megres C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱，柱溫35 ℃。流動相由0.1%的甲酸水溶液（溶劑A）和甲醇（溶劑B）組成，使用的梯度溶劑系統(tǒng)為：0～5 min，97% A；5～50 min，97% A～75% A；50～95 min，75% A～30% A；95～100 min，30% A；100～110 min，30% A～97% A。流動相流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長270 nm。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行比對，確定各提取物中的酚類化合物，根據(jù)酚類化合物的峰面積和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)曲線對它們進(jìn)行定量，結(jié)果顯示為每克干提取物中酚類物質(zhì)的毫克數(shù)（mg/g DW）。

1.4.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示（n=3）。采用單One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚及總黃酮含量測定

許多研究[14,20]表明，酚類化合物是各種天然產(chǎn)品中主要抗氧化活性成分，其廣泛存在于各種植物中，可能是植物提取物中的主要抗氧化劑。絲瓜花不同溶劑提取物中總酚和總黃酮的含量測定結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，絲瓜花不同提取物的總酚差異顯著，在26.05 mg GAE/g DW和44.01 mg GAE/g DW之間，與Li等[21]報(bào)道相比，絲瓜花提取物的總酚含量高于很多食用花卉和野生花卉。同時，從結(jié)果可以看出70%乙醇和40%乙醇是絲瓜花酚類物質(zhì)較好的提取溶劑，而水和無水乙醇對酚類的提取能力較差。提取物中總黃酮的含量與總酚的含量有相似的趨勢，其中70%乙醇和40%乙醇提取物總黃酮含量較高，而水提物和無水乙醇提取物總黃酮含量稍低，不同提取物中總黃酮含量在14.27～26.24 mg QE/g DW之間，占總酚的49.4%～ 80.0%。結(jié)果表明，40%乙醇和70%乙醇適合絲瓜花中酚類物質(zhì)和黃酮類成分的提取。

表1 絲瓜花提取物中總酚、總黃酮含量及抗氧化能力IC50值

2.2 DPPH·清除活性

DPPH·是一個穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，并已被廣泛用來測試各種樣品的清除自由基的能力。絲瓜花不同提取物對DPPH·清除率見圖1，其IC50值見表1。

從圖1可以看出，隨著提取物濃度的增加，DPPH· 清除率也在增加，濃度和清除率之間存在明顯的量效關(guān)系。其中，40%乙醇提取物和70%乙醇提取物對DPPH·清除作用較強(qiáng)，而乙醇提取物和水提物也表現(xiàn)出良好的清除能力。從結(jié)果中可以得出，絲瓜花的乙醇提取物、70%乙醇提取物、40%乙醇提取物和水提物對DPPH·清除作用的IC50值分別為0.742，0.358，0.340和0.526 mg/mL，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH· 清除能力，但低于陽性對照槲皮素的清除能力（IC50值為0.011 mg/mL）。結(jié)果表明，中等體積分?jǐn)?shù)的乙醇對于絲瓜花中抗氧化活性成分提取較好，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高或過低，提取物的DPPH·清除能力均下降，這可能是因?yàn)榻z瓜花中抗氧化活性成分主要是一些稍強(qiáng)極性成分，其在一定體積分?jǐn)?shù)乙醇中溶解性較好。

圖1 絲瓜花提取物對DPPH·清除率

對結(jié)果分析表明，各提取物的總酚含量與DPPH· 清除率之間存在較好的相關(guān)性（R2=0.868 8），說明總酚是絲瓜花各提取物中清除DPPH·的主要化學(xué)成分。許多研究[22-23]也報(bào)道各種花提取物中總酚含量和DPPH·清除率之間存在較強(qiáng)的正相關(guān)。但是各提取物的總黃酮含量與DPPH·清除率之間相關(guān)性較弱（R2=0.281 2），說明總黃酮在各提取物清除DPPH· 中貢獻(xiàn)不大。

2.3 超氧陰離子自由基的清除活性

超氧陰離子可以誘導(dǎo)形成其它活性氧如羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧等。因此，清除超氧陰離子對于生物體來說顯得尤為重要。圖2顯示絲瓜花不同提取物對超氧陰離子自由基清除活性。

從圖2可知，絲瓜花提取物在低濃度時與超氧陰離子清除率均表現(xiàn)出正的劑量效應(yīng)關(guān)系。其中，40%乙醇提取物對超氧陰離子清除能力最強(qiáng)，水提物次之，而醇提物清除能力最弱。如表1所示，絲瓜花的乙醇提取物、70%乙醇提取物、40%乙醇提取物和水提物對超氧陰離子清除能力IC50值分別是1.825，1.022，0.177和0.400 mg/mL，所有提取物的清除能力均低于陽性對照槲皮素（IC50值為0.021 mg/mL）。從結(jié)果可以看出，較強(qiáng)極性溶劑有利于從絲瓜花中提取具有超氧陰離子清除能力化合物，如40%乙醇溶液或者水溶液。一些研究[24]也得出相似結(jié)果，植物的強(qiáng)極性溶劑提取物有較高的超氧陰離子自由基清除活性。

絲瓜花提取物的超氧陰離子清除率與各提取物總酚或總黃酮含量之間的相關(guān)性較弱（R2=0.274 5，0.004 9），說明絲瓜花提取物清除超氧陰離子能力不是來源于其所含的總酚或總黃酮。

2.4 FRAP法測定抗氧化活性

抗氧化劑的抗氧化能力與還原力具有直接關(guān)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化性能就越強(qiáng)，因此一個抗氧化劑的還原力可以作為其抗氧化能力的重要指標(biāo)。還原力強(qiáng)弱可以用FRAP法測定，當(dāng)其測定體系吸光度越大時，說明該樣品的抗氧化性就越強(qiáng)。絲瓜花各提取物還原力測定結(jié)果如圖3所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，所有樣品的鐵離子還原力隨著濃度的增加而增加，其中40%乙醇提取物和70%乙醇提取物還原力較強(qiáng)，其變化趨勢也相似，乙醇提取物和水提物還原力較弱。這一趨勢與絲瓜花各提取物對DPPH·清除能力相似。這也說明，40%乙醇或70%乙醇是絲瓜花中還原性化合物提取的有效溶劑，以此溶劑進(jìn)行提取的絲瓜花提取物也具有較強(qiáng)抗氧化活性。

圖2 絲瓜花提取物對超氧陰離子清除率

圖3 絲瓜花提取物FRAP抗氧化活性

2.5 亞鐵離子螯合能力

在Fenton反應(yīng)分解H2O2形成羥自由基的反應(yīng)過程中，二價過渡金屬離子作為催化劑發(fā)揮重要作用，如果將這些金屬離子進(jìn)行螯合，有利于減少羥自由基的形成，因此提取物對于二價過渡金屬離子的螯合能力也是其抗氧化活性的重要反映。各提取物對亞鐵離子螯合能力見圖4。

由圖4可知，絲瓜花水提物對亞鐵離子螯合能力最強(qiáng)，醇提物最弱，而且隨著提取溶劑極性增強(qiáng)，提取物的亞鐵離子螯合能力也在增強(qiáng)。在較低濃度時，70%乙醇提取物、40%乙醇提取物和水提物對亞鐵離子螯合能力隨著濃度增加呈近似線性增加，而當(dāng)濃度較大時，螯合能力維持相對穩(wěn)定的最大值。如表1所示，絲瓜花的乙醇提取物、70%乙醇提取物、40%乙醇提取物和水提物對亞鐵離子螯合能力IC50值分別是1.526 0，0.513 7，0.301 2和0.128 1 mg/mL，它們的螯合能力低于陽性對照EDTA-Na2（IC50值為0.015 mg/mL）。這些結(jié)果表明，絲瓜花中具有螯合能力活性化合物是具有較強(qiáng)極性的，水更適合從絲瓜花中提取這些化合物。絲瓜花各提取物對亞鐵離子鐵螯合能力和總酚或總黃酮之間沒有相關(guān)性。

圖4 絲瓜花提取物對亞鐵離子螯合率

2.6 酚類化合物的HPLC分析

酚類化合物是許多天然提取物中主要的抗氧化活性成分，但是對于絲瓜花中酚類組成，目前還未見報(bào)道，因此研究以HPLC方法對絲瓜花提取物進(jìn)行初步分析，不同提取物酚類化合物及其含量結(jié)果見表2，色譜圖見圖5。

在絲瓜花4種不同提取物中共檢測出9種酚類化合物，但是未檢測出兒茶素、綠原酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸、芥子酸、蘆丁、槲皮素和山奈酚。檢測出的化合物中楊梅素的含量在乙醇提取物、70%乙醇提取物、40%乙醇提取物和水提取物中均是最高的，濃度分別為1.253，4.772，5.428和1.658 mg/g DW。各酚類總含量在3.407～8.529 mg/g DW之間，其中40%乙醇提取物含量最高，70%乙醇提取物次之，水提物含量最低，酚類化合物很多都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，較高含量的酚類化合物含量可能有較好的抗氧化活性，這與前面的結(jié)果相符合。從各酚類總含量來看，40%乙醇和70%乙醇是絲瓜花中酚類化合物提取的較好溶劑。

圖5 絲瓜花提取物中酚類物質(zhì)（A）及對照品（B）的HPLC 色譜圖

表2 絲瓜花提取物中酚類化合物含量

3 結(jié)論

采用不同的溶劑對絲瓜花進(jìn)行提取，測定不同提取物的抗氧化活性并分析其酚類成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同提取物中的總酚含量、總黃酮含量、抗氧化能力和酚類化合物的含量存在顯著的差異。結(jié)果也表明，70%乙醇提取物和40%乙醇提取物總酚、總黃酮含量最高，同時它們的DPPH·清除活性和FRAP抗氧化能力也較強(qiáng)，此外40%乙醇提取物具有最強(qiáng)的超氧陰離子自由基的清除活性，而水提物具有最強(qiáng)的亞鐵離子螯合能力。各提取物總酚含量與DPPH·清除能力之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，表明總酚是絲瓜花提取物的DPPH·清除活性主要物質(zhì)基礎(chǔ)，然而總酚、總黃酮含量與其他抗氧化活性沒有相關(guān)性。在各種絲瓜花提取物中共檢測出沒食子酸、3, 4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、4-香豆酸、楊梅素、木犀草素和芹菜素9種酚類化合物，其中楊梅素在4種提取物中的含量最高。結(jié)果表明70%乙醇、40%乙醇是絲瓜花抗氧化性物質(zhì)提取的有效溶劑，但是水對于提取亞鐵離子螯合物的效果更好。這些結(jié)果對于絲瓜花的應(yīng)用開發(fā)具有較好的參考價值。