鐵皮石斛花色苷提取及其抗氧化活性分析

楊曉娜，陳自宏，謝雯穎，吳春燕，張星和

保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院（保山 678000）

花色苷是植物次生代謝過(guò)程中產(chǎn)生的類黃酮物質(zhì)，它是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的天然色素，不僅安全，且在動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病中有一定的治療作用[1]。國(guó)內(nèi)外科研工作者已對(duì)不同植物花色苷的提取工藝做了大量的研究，微波加熱使細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)吸收微波能，產(chǎn)生熱量，破壞植物細(xì)胞壁，并將胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)[3]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，植物花色苷微波輔助提取及其抗氧化性研究成果較多，主要集中在紫洋蔥[4]、石榴[5]、紅米[6]、紫薯[7]、紫馬鈴薯[8]、黑果枸杞[9]等植物，但是微波輔助提取鐵皮石斛花色苷及其抗氧化性研究鮮有報(bào)道。

云南省保山市是我國(guó)蘭科石斛屬植物分布較集中的地區(qū)之一，獨(dú)特的氣候條件和多樣的生態(tài)環(huán)境，為石斛屬植物的生長(zhǎng)提供了有利條件[2]。目前，對(duì)石斛的研究主要集中在資源、繁殖生長(zhǎng)、活性成分及功能、組織培養(yǎng)、資源鑒定與評(píng)價(jià)、化學(xué)成分、內(nèi)生菌、藥理作用等方面。通過(guò)對(duì)保山不同品種石斛的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉鞘富含天然色素花色苷。

因此，此次試驗(yàn)在傳統(tǒng)浸泡法基礎(chǔ)上，加以微波輔助提取鐵皮石斛花色苷，并對(duì)其進(jìn)行抗氧化性研究，以了解鐵皮石斛花色苷用微波輔助提取的工藝及其對(duì)清除DPPH自由基和羥自由基的抗氧化能力，為石斛天然色素開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛采自龍陵縣龍江鄉(xiāng)石斛人工種植基地，選用長(zhǎng)勢(shì)好、無(wú)病蟲害的鐵皮石斛葉鞘作為試材，自然干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，密封保存，備用。無(wú)水乙醇、鹽酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、水楊酸、過(guò)氧化氫等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-800 g搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；DK-8AX電熱恒溫水槽（上海一恒科技儀器有限公司）；G70F20N2L-DG（SO）微波（廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司）；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；HC-2062離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司）；UV5100紫外/可見分光光度計(jì)（安徽皖儀科技股份有限公司）；CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛花色苷含量測(cè)定及最大吸收波長(zhǎng)的確定方法

稱取1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%）浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時(shí)間60 s條件下處理，抽濾，將提取液置于紫外-可見分光光度計(jì)200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)[10]。

用pH示差法測(cè)定花色苷的含量[11]，分別用pH 1.0的KCl和pH 4.5的乙酸鈉緩沖液定容至25 mL，室溫下平衡20 min，測(cè)定2份樣品在λmax和700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。吸光度及紫皮石斛提取液中花色苷含量按式（1）和（2）計(jì)算。

式中：V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.4；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，26 900；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 浸泡時(shí)間

稱取6份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%），分別浸泡0，1，2，3，4和5 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時(shí)間60 s條件下處理，抽濾，測(cè)定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)

稱取5份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，分別加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%和70%，浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W，輻射時(shí)間60 s條件下處理，抽濾，測(cè)定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.4 料液比

稱取5份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，分別加入20，25，30，35和40 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分?jǐn)?shù)均為40%），浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時(shí)間60 s條件下處理，抽濾，測(cè)定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.5 輻射時(shí)間

稱取5份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%），浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時(shí)間分別為30，60，90，120和150 s條件下處理，抽濾，測(cè)定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.6 輻射功率

稱取4份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%），浸泡1 h，然后在輻射時(shí)間60 s，微波輻射功率分別為126，406，567和700 W條件下處理，抽濾，測(cè)定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.7 正交試驗(yàn)方法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇浸泡時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、輻射時(shí)間、輻射功率進(jìn)行五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用L16(45)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以提取液中花色苷含量為考察指標(biāo)，確定最佳工藝參數(shù)。

表1 正交因素水平

1.3.8 DPPH清除自由基能力的測(cè)定方法

稱取0.019 7 g DPPH，用無(wú)水乙醇定容至100 mL，避光保存，備用。將花色苷溶液用二倍稀釋法稀釋5組，備用。按表2中試驗(yàn)內(nèi)容，在比色管中將溶液混勻，避光室溫保存30 min后，定容至10 mL，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，重復(fù)3次試驗(yàn)，計(jì)算清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%和IC50值清除率。采用VC作對(duì)照，VC的濃度和花色苷相同，同樣采用二倍稀釋法配制5組不同濃度的VC溶液。操作步驟和計(jì)算公式與花色苷一致。

表2 DPPH清除自由基能力測(cè)定方法

1.3.9 羥自由基清除能力的測(cè)定方法

分別配置6 mmol/L水楊酸（稱取0.041 4 g水楊酸，用無(wú)水乙醇定容50 mL）、6 mmol/L硫酸亞鐵（稱取0.083 4 g硫酸亞鐵，用蒸餾水定容50 mL）和0.3%過(guò)氧化氫溶液（移取0.5 mL 30%過(guò)氧化氫，用蒸餾水定容50 mL，現(xiàn)配）。用A0組的混合液在200～700 nm下測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)。按表3的試驗(yàn)內(nèi)容在比色管中將A0組、A1組、A2組溶液加好后，在37 ℃進(jìn)行水浴加熱30 min，再用蒸餾水定容至10 mL，在紫外/可見分光光度計(jì)測(cè)λmax的吸光度A，重復(fù)3次試驗(yàn)，計(jì)算清除率= [1-（A1-A2）/A0]×100%和IC50值清除率。采用VC作對(duì)照，VC的濃度和花色苷相同，同樣采用二倍稀釋法配制5組不同濃度的VC溶液。操作步驟和計(jì)算公式與花色苷一致。

表3 羥自由基清除能力測(cè)定方法

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛花色苷最大吸收波長(zhǎng)的確定

從圖1可以看出，鐵皮石斛最大吸收波長(zhǎng)為530 nm。王立江等[12]以黑馬鈴薯鮮樣為試驗(yàn)材料，采用微波輔助有機(jī)溶劑提取法對(duì)黑馬鈴薯中花色苷的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，黑馬鈴薯花色苷的最大吸收波長(zhǎng)在536 nm處。蔣海偉等[13]采用酸化乙醇作為提取劑，微波輔助提取紅米中花色苷，其最大吸收波長(zhǎng)在517 nm。任虹等[14]研究蒸汽加熱和微波加熱處理對(duì)紫甘藍(lán)花色苷及其清除自由基活性的影響，紫甘藍(lán)花色苷最大吸收波長(zhǎng)在500 nm處。根據(jù)文獻(xiàn)可知花色苷及其色素元在可見光465～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收峰[15]。由此可以判斷鐵皮石斛色素屬花色苷[16]。

圖1 鐵皮石斛花色苷可見光譜圖

2.2 單因素對(duì)花色苷提取的影響

2.2.1 浸泡時(shí)間對(duì)花色苷提取的影響

由圖2可知，當(dāng)浸泡時(shí)間小于4 h時(shí)，隨著浸泡時(shí)間的增加，鐵皮石斛花色苷的提取含量逐漸增大；當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)4 h后，鐵皮石斛花色苷的含量又開始下降，其原因可能是浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取劑過(guò)多進(jìn)入細(xì)胞，加以微波輔助提取，細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)不斷被提取出來(lái)，影響花色苷的含量。所以，浸泡時(shí)間4 h為提取鐵皮石斛花色苷最適宜的浸泡時(shí)間。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取的影響

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～50%之間，鐵皮石斛花色苷提取含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而增大，且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，鐵皮石斛花色苷的含量最高。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)50%時(shí)，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，花色苷含量反而呈下降趨勢(shì)。其原因可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，將鐵皮石斛中其他易溶于乙醇的有機(jī)物也一起提取出來(lái)。所以，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%作為提取鐵皮石斛花色苷的最佳提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)鐵皮石斛花色苷含量的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)鐵皮石斛花色苷含量的影響

2.2.3 料液比對(duì)花色苷提取的影響

由圖4可知，料液比在1∶20～1∶25（g/mL）內(nèi)，隨著提取劑體積的增加，花色苷含量逐漸增大，且上升很大。但是繼續(xù)增加提取劑體積，花色苷含量緩慢下降。其原因可能是料液比大，提取劑體積大，加熱時(shí)間長(zhǎng)，溫度高，使得花色苷降解。倘若一開始料液比過(guò)大，則不利于下一步的濃縮分離以及增加后面的工作能耗，所以結(jié)合經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇1∶25（g/mL）作為最佳料液比。

2.2.4 輻射時(shí)間對(duì)花色苷提取的影響

由圖5可知，當(dāng)輻射時(shí)間為30～60 s時(shí)，花色苷含量呈上升趨勢(shì)。在60～120 s，花色苷含量呈下降趨勢(shì)；但在120 s之后，增大輻射時(shí)間，花色苷含量又上升。其原因可能是在輻射時(shí)間在60～120 s時(shí)，加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，加熱溫度升高，使花色苷受到一定的破壞；在150 s，花色苷含量又增大，可能是因?yàn)槲⒉ㄌ崛∵^(guò)程中，電磁波把能量直接傳遞到鐵皮石斛內(nèi)部并快速加熱，使溫度快速升高，使得一些未溶于提取劑的其他色素溶解一并被提取出來(lái)，增大花色苷含量。但是從節(jié)約資源、省時(shí)、省電角度考慮，150 s耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，而且后期提純工藝較繁瑣，所以選擇60 s作為最適提取時(shí)間。

圖4 料液比對(duì)鐵皮石斛花色苷含量的影響

圖5 輻射時(shí)間對(duì)鐵皮石斛花色苷含量的影響

2.2.5 輻射功率對(duì)花色苷提取的影響

由圖6可知，微波功率在126～567 W內(nèi)，隨著微波提取功率的增加，鐵皮石斛花色苷含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，且在567 W時(shí)花色苷含量最高。但是，繼續(xù)增加微波提取功率，其含量增加呈緩慢下降的趨勢(shì)，這是由于微波功率過(guò)大易造成溫度過(guò)高，使部分花色苷分解，進(jìn)而降低花色苷的提取含量。所以選擇567 W為提取最適功率。

2.3 鐵皮石斛花色苷正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表4可知，采用微波輔助提取鐵皮石斛花色苷，在5個(gè)單因素影響中，乙醇體積分?jǐn)?shù)極差為0.037，是對(duì)提取花色苷含量影響最小的，而料液比極差最大，影響也最大，為主要影響因素，各因素對(duì)提取花色苷含量的影響依次是料液比＞輻射時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞輻射功率。綜合所有試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)最終確定的最佳參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶20（g/mL），輻射功率為406 W，輻射時(shí)間為90 s，浸泡時(shí)間為4 h。從表5中可以看出，4個(gè)因素顯著水平值均為極顯著，說(shuō)明這4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果有顯著影響。

圖6 微波功率對(duì)鐵皮石斛花色苷含量的影響

表5 方差分析

表4 正交試驗(yàn)及結(jié)果

2.4 最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)、提取次數(shù)

根據(jù)正交試驗(yàn)可知，最佳提取工藝參數(shù)為A2B1C2D3E4，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶25（g/mL），微波功率為406 W，輻射時(shí)間90 s，浸泡時(shí)間4 h，按此試驗(yàn)條件再進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，提取鐵皮石斛花色苷含量為0.452，0.435和0.392 mg/g，3組鐵皮石斛花色苷含量與正交試驗(yàn)中第5組含量相差不大，說(shuō)明該組試驗(yàn)提取穩(wěn)定，因此確定A2B1C2D3E4為最佳提取工藝。

由圖7可知，當(dāng)提取條件為A2B1C2D3E4時(shí)，提取2次，鐵皮石斛花色苷含量最高，為1.052 mg/g，花色苷質(zhì)量濃度為35.07 mg/L；提取3次時(shí)，花色苷含量又降低，但含量比提取1次含量高。提取3次，鐵皮石斛花色苷含量有所下降的原因可能是：提取2次，鐵皮石斛濾渣已呈無(wú)色，第3次同樣條件提取，提取液幾乎呈無(wú)色，花色苷色素幾乎提取完畢，再次提取，反而將濾渣中的多糖或者其他成分提取出來(lái)，影響最終的花色苷的含量。所以3最終確定以提取次數(shù)2次最佳。

圖7 提取次數(shù)對(duì)鐵皮石斛花色苷含量的影響

2.5 鐵皮石斛花色苷對(duì)羥自由基的清除能力

羥自由基是人體內(nèi)危害性較強(qiáng)的一種自由基，與機(jī)體內(nèi)分子失電子或電子轉(zhuǎn)移，來(lái)影響機(jī)體正常的生理功能。硫酸亞鐵被過(guò)氧化氫氧化為Fe3+，再與水楊酸反應(yīng)形成紫色絡(luò)合物，加入自由基清除劑后，紫色絡(luò)合物顏色變淺，且清除劑濃度越高，顏色越淺。由圖8可知，鐵皮石斛花色苷質(zhì)量濃度在2.2～35.07 μg/mL范圍內(nèi)，花色苷質(zhì)量濃度增大，清除率越大，呈上升趨勢(shì)，而VC的清除率趨于平緩，當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度達(dá)到35.07 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到97.8%。用SPSS 18.0軟件分析IC50得：鐵皮石斛花色苷的IC50（7.61 μg/mL）＞VC的IC50（5.56×1020μg/mL）。鐵皮石斛花色苷具有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力，抗氧化能力強(qiáng)于VC。

2.6 鐵皮石斛花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH是一種紫紅色物質(zhì)，DPPH自由基溶于乙醇且能穩(wěn)定存在，當(dāng)有自由基清除劑加入與之結(jié)合，會(huì)使顏色變淺，且與清除劑濃度呈一定的量效關(guān)系。由圖2可知，鐵皮石斛花色苷質(zhì)量濃度在0.3～35.07 μg/mL范圍內(nèi)，花色苷濃度增大，清除率越大，呈上升趨勢(shì)，而VC的清除率趨于平緩，當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度達(dá)到35.07 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到97.8%，VC清除率為56.7%。用SPSS 18.0軟件分析IC50得：鐵皮石斛花色苷的IC50（0.53 μg/mL）＞VC的IC50（74.46 μg/mL）。鐵皮石斛花色苷具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，抗氧化能力強(qiáng)于VC。

圖8 鐵皮石斛花色苷及VC對(duì)羥自由基的清除能力比較

圖9 鐵皮石斛花色苷及VC對(duì)DPPH的清除能力

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)利用浸泡-微波輔助聯(lián)合方法提取鐵皮石斛花色苷，得出鐵皮石斛花色苷的最大吸收波長(zhǎng)，為530 nm；由單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對(duì)提取花色苷含量的影響依次是料液比＞輻射時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞輻射功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。最佳提取參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比為1∶20（g/mL），輻射功率406 W，輻射時(shí)間90 s，浸泡時(shí)間4 h，提取次數(shù)2次。此時(shí)，鐵皮石斛花色苷含量最高，為1.052 mg/g，花色苷質(zhì)量濃度為35.07 mg/L。通過(guò)軟件分析IC50，鐵皮石斛花色苷對(duì)清除羥自由基和DPPH自由基的IC50分別為7.61和0.53 μg/mL。VC對(duì)清除羥自由基和DPPH自由基IC50分別為5.56×1020和74.46 μg/mL。鐵皮石斛花色苷對(duì)DPPH自由基和羥自由基均有較強(qiáng)的抗氧化能力，抗氧化效果均強(qiáng)于VC，且抗氧化能力與花色苷濃度顯現(xiàn)出一定的正比關(guān)系，但對(duì)DPPH自由基的抗氧化能力要強(qiáng)于羥自由基。