多色標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色在肺癌免疫治療中的研究進(jìn)展

孫文佳 周建婭 周建英

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康及生活質(zhì)量[1]。由于早期診斷率低，大部分患者在診斷時已是晚期。目前局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率分別只有26%及4%[2]。近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs），特別是程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1, PD-1）及其配體（programmed cell death ligand 1, PD-L1）抑制劑因其普適性、顯著的抗腫瘤活性以及良好的安全性，提高了晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的預(yù)后，受到了廣泛的關(guān)注[3]。然而PD-1/PD-L1抑制劑的療效并不是在所有患者中都很理想，而且可能伴發(fā)嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件（immune-related adverse events, irAEs），甚至危及生命[4]。目前已有的生物標(biāo)志物對肺癌患者預(yù)后及療效預(yù)測均有一定的價值，但都存在著局限性與不足，需要開發(fā)更有效的生物標(biāo)志物，以優(yōu)化患者利益，并指導(dǎo)治療。

許多新發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物，特別是腫瘤免疫治療的生物標(biāo)志物，都與腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment, TIME）有關(guān)[5]。TIME是腫瘤和免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的動態(tài)交叉作用的結(jié)果，實(shí)體腫瘤的TIME包括瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的密度、定位和組成等[6,7]。越來越多的研究[6]表明，認(rèn)識TIME下免疫和腫瘤相關(guān)分子的表達(dá)模式和功能，對于選擇最有可能受益于免疫治療的患者群體至關(guān)重要。傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)染色/免疫熒光染色（immunohistochemistry/immunofluorescence, IHC/IF）是目前TIME研究最常用的檢測方法，在肺癌的病理類型和生物標(biāo)志物的評估中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠協(xié)助臨床醫(yī)生及時、準(zhǔn)確地做出治療決策，但仍存在許多局限性，必須開發(fā)更加可靠和高效的免疫組化系統(tǒng)[8]。最近一種新的多標(biāo)記免疫組織化學(xué)染色/免疫熒光染色（multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence, mIHC/IF）技術(shù)能夠在一個組織切片上獲得多種生物標(biāo)志物，同時獲得關(guān)于細(xì)胞組成和空間排列的多通道信息，對TIME進(jìn)行高維分析。近來使用mIHC/IF技術(shù)對TIME下特異性免疫細(xì)胞群作為肺癌患者治療預(yù)后及療效預(yù)測因素的研究取得了一定的進(jìn)展，本文對此作一綜述。

1 mIHC/IF檢測

傳統(tǒng)的IHC/IF檢測是用酶或熒光標(biāo)記的抗體對福爾馬林固定及石蠟包埋（formalin fixation and paraffin embedding, FFPE）的樣本進(jìn)行染色，顯示特定目標(biāo)抗原在組織中的表達(dá)和定位分布，是目前被廣泛應(yīng)用于TIME研究的組織病理學(xué)診斷技術(shù)。

mIHC/IF的染色流程與傳統(tǒng)的IHC/IF相近，只是在每一輪染色過程中間增加了一個抗體洗脫步驟，通過順次單標(biāo)、多輪復(fù)染的方式實(shí)現(xiàn)在同一張F(tuán)FPE切片上同時檢測多個生物標(biāo)志物。一種名為多路免疫組織化學(xué)單片連續(xù)染色（multiplexed immunohistochemical consecutive staining on single slide, MICSSS）的技術(shù)較早地被開發(fā)出來并廣泛運(yùn)用，該技術(shù)通過重復(fù)循環(huán)的免疫過氧化物酶標(biāo)記、圖像掃描以及顯色底物的洗脫，最后進(jìn)行圖像的對齊整合處理來實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記染色（圖1）[9]。隨后，另一種Opal多標(biāo)記免疫熒光染色技術(shù)也被開發(fā)出來，利用酪胺信號放大（tyramine signal amplification, TSA）技術(shù)的熒光信號與抗原共價鍵結(jié)合不受微波加熱的影響，通過重復(fù)循環(huán)的TSA熒光染色、微波加熱去除抗體但保留熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)7色-9色標(biāo)記[10,11]。后期處理將混雜的各色信號進(jìn)行識別和拆分，以及單色信號間的自由組合，從而進(jìn)行單個生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物間的分析。隨后，幾種自動分析的算法被開發(fā)出來，能夠自動將多標(biāo)記圖像中具有特異性結(jié)構(gòu)的目標(biāo)組織區(qū)域識別分割開來，并針對感興趣區(qū)域進(jìn)行定量統(tǒng)計分析，從而實(shí)現(xiàn)定量評估細(xì)胞免疫表型和免疫細(xì)胞的功能定位，同時提供組織背景和空間分布信息[12,13]。目前，一種“組織成像質(zhì)譜流式系統(tǒng)”的新技術(shù)被開發(fā)出來，將質(zhì)譜流式（mass cytometry, CyTOF）超高檢測通道數(shù)量的優(yōu)勢運(yùn)用到組織成像研究領(lǐng)域，用稀有金屬同位素標(biāo)記的抗體染色，在同一張F(tuán)FPF切片上可以獲得高達(dá)40種蛋白標(biāo)志物的圖像數(shù)據(jù)[14]。

2 mIHC/IF檢測的優(yōu)勢與局限性

圖1 多路免疫組織化學(xué)單片連續(xù)染色流程圖Fig 1 The multiplexed immunohistochemical consecutive staining on single slide (MICSSS)workflow. FFPE: formalin fixation and paraffin embedding.

2.1 傳統(tǒng)IHC/IF檢測的局限性 傳統(tǒng)的IHC/IF檢測最大的局限性是在一張F(tuán)FPF切片上只能染色1個-3個靶標(biāo)，而精準(zhǔn)治療的腫瘤評估，需要對多個蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行檢測，這就需要充足的組織學(xué)標(biāo)本。在大多數(shù)病例中，患者的活檢樣本無法滿足除腫瘤病理組織學(xué)分型之外的額外檢測，這導(dǎo)致錯失了從患者樣本中獲得重要的診斷和預(yù)后信息的機(jī)會[15]。此外，即使有足夠的樣本進(jìn)行一系列連續(xù)的組織切片傳統(tǒng)IHC/IF染色，在多細(xì)胞群的研究中對于蛋白之間的相關(guān)性也無法準(zhǔn)確評估[16]。因此，雖然IHC/IF是一種實(shí)用且成本效益高的檢測方法，但這種方法不能說明復(fù)雜TIME的全部情況。

傳統(tǒng)的IHC/IF的另一大限制是觀察者之間的高變異性，其結(jié)果判讀主要通過人為定性或半定量，有一定的主觀性。例如，Ki-67是多種惡性腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物[17]。但在2017年圣加侖國際專家共識會議上，專家們提出IHC用于Ki-67檢測的可重復(fù)性的問題及其對臨床決策的影響。為減少主觀性的影響，目前國際上存在共識，要求實(shí)驗(yàn)室具備經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家。此外，有研究[18]表明，使用可重復(fù)且定量的數(shù)字分析對Ki-67進(jìn)行評分，可以消除觀察者間的差異。

2.2 mIHC/IF檢測的優(yōu)勢 mIHC/IF檢測實(shí)現(xiàn)了在FFPE組織切片上進(jìn)行多個生物標(biāo)志物檢測，配合定量分析軟件，能夠自動區(qū)分腫瘤和非腫瘤組織，客觀地分析多個生物標(biāo)志物以及細(xì)胞組成、功能狀態(tài)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，具有高重復(fù)性、高效率和高成本效益的優(yōu)點(diǎn)[12,13]。

最近，國際上的多項(xiàng)研究探究了mIHC/IF檢測較傳統(tǒng)方法的準(zhǔn)確性和可行性。新加坡學(xué)者[19]收集了25例三陰性乳腺癌、12例NSCLC和8例其他實(shí)體腫瘤的組織，分別用傳統(tǒng)的IHC檢測方法標(biāo)記3種PD-L1抗體（22C3、SP142和SP263）的表達(dá)情況，然后由4位病理學(xué)專家評估染色百分比；mIHC/IF檢測方法同時標(biāo)記3種PD-L1抗體（22C3、SP142和SP263）的表達(dá)情況，使用光譜成像設(shè)備采集圖像并通過軟件進(jìn)行定量分析。該研究評估兩種檢測方法結(jié)果之間的一致性，包括聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)（combined positive score, CPS）、腫瘤細(xì)胞陽性比例分?jǐn)?shù)（tumor proportion score, TPS）及免疫計數(shù)（immune count, IC）評分，結(jié)果顯示，兩種檢測方法之間存在中-強(qiáng)相關(guān)性，一致性達(dá)到67%-100%，斯皮爾曼秩相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.88。該研究證明了mIHC/IF檢測與傳統(tǒng)的IHC檢測相比，PD-L1定量檢測的一致性良好，并且前者更具客觀性。美國學(xué)者[13]對最常見的預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑療效的生物標(biāo)志物PD-L1 IHC、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB）、基因表達(dá)譜（gene expression profiling, GEP）和mIHC/IF檢測進(jìn)行了預(yù)測準(zhǔn)確性分析。研究納入了24篇研究，共10余種實(shí)體腫瘤8,135例患者，使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）進(jìn)行預(yù)測準(zhǔn)確性的評估發(fā)現(xiàn)，mIHC/IF檢測的曲線下面積（area under the curve,AUC）（0.79）較PD-L1 IHC（AUC為0.65，P＜0.001）、GEP（AUC為0.65，P=0.003）及TMB（AUC為0.69，P=0.049）更高，即mIHC/IF檢測的預(yù)測準(zhǔn)確性（加權(quán)/非加權(quán)AUC為0.790/0.872；95%CI：0.650-0.688/0.657-0.710）高于其他的檢測方法[13]。此外，他們發(fā)現(xiàn)mIHC/IF檢測的陽性預(yù)測值（positive predictive value, PPV）和陽性似然比（positive likelihood ratio, LR+）顯著高于其他生物標(biāo)志物，即mIHC/IF出現(xiàn)假陽性結(jié)果可能性更低[13]。該研究闡明了mIHC/IF檢測在預(yù)測患者免疫治療的療效方面的準(zhǔn)確性高于目前的PD-L1 IHC、TMB及GEP檢測方法，意味著其在未來的臨床應(yīng)用上將有較大潛力。

2.3 mIHC/IF檢測的局限性 在技術(shù)上，mIHC/IF仍然是一個基于IHC的平臺，也面臨著抗體交叉反應(yīng)以及光學(xué)交叉問題。為了克服抗體交叉反應(yīng)，mIHC/IF檢測采用抗體剝離的方法，早期的MICSSS技術(shù)經(jīng)過化學(xué)方法洗脫抗體，容易造成組織樣本損傷，特別是抗原丟失。較新的Opal多標(biāo)記免疫熒光染色技術(shù)通過微波加熱去除抗體，此過程與抗原修復(fù)過程相似，減小了對組織樣本及抗原的損傷。此外，該技術(shù)相比MICSSS技術(shù)，不需要圖像后期對齊整合，多種熒光信號同時存在于一張圖像上，改善了標(biāo)記物間定位的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，但面臨著光譜串?dāng)_的問題。對于三色以下的復(fù)染圖像，可以通過普通顯微鏡采集，但對于更多色的復(fù)染圖像，由于光譜串?dāng)_，需要采用更加專業(yè)的光譜成像設(shè)備以及定量分析軟件進(jìn)行圖像采集和分析，昂貴的費(fèi)用限制了這種方法的廣泛使用[20]。而mIHC/IF檢測平臺作為一個臨床轉(zhuǎn)化平臺，其分析速度、周轉(zhuǎn)時間、計算能力、服務(wù)器和存儲也對臨床病理實(shí)驗(yàn)室具有較高的要求。

此外，傳統(tǒng)的IHC/IF檢測是在整個組織中進(jìn)行評分，而mIHC/IF檢測捕捉整個組織切片中感興趣的區(qū)域進(jìn)行分析，很可能因?yàn)榻M織異質(zhì)性而導(dǎo)致結(jié)果與實(shí)際情況存在偏差，存在組織學(xué)定量不準(zhǔn)確或錯過罕見事件的可能。目前，mIHC/IF檢測對于整個組織切片的分析正在測試中[19]。

3 mIHC/IF技術(shù)在肺癌免疫治療中的臨床價值

近年來，肺癌治療已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)療的時代，其中，有效的生物標(biāo)志物檢測是準(zhǔn)確選擇獲益人群的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Remark等[9]和Tsujikawa等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥患者中，ICIs治療前后TIME的高維特征與治療反應(yīng)相關(guān)。國內(nèi)研究[6]發(fā)現(xiàn)，TIME內(nèi)的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）與腫瘤細(xì)胞的相互作用密切，能夠促進(jìn)或阻止腫瘤的生長和侵襲，在肺癌中具有預(yù)后及療效預(yù)測價值。由于TILs是一群具有較大異質(zhì)性的細(xì)胞群體，因此需要進(jìn)一步細(xì)化及量化具體指標(biāo)。mIHC/IF檢測能夠同時分析多個生物標(biāo)志物，客觀地評估TILs亞群。

3.1 TILs亞群的密度 目前的臨床實(shí)踐中，肺癌患者的結(jié)局主要依據(jù)腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis,TNM）分期、病理組織學(xué)分型和相關(guān)生物標(biāo)志物等。近幾年，國際上采用mIHC/IF檢測探究不同TILs亞群的密度用于判斷肺癌臨床結(jié)局已有不少報道。目前，已有多項(xiàng)研究使用mIHC/IF檢測采用不同生物標(biāo)志物組合對NSCLC患者的TILs亞群進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)高密度的CD3+CD8-TILs亞群和CD8+TILs亞群，與NSCLC患者較長的總生存期（overall survival, OS）相關(guān)，其中，CD8+TILs是獨(dú)立于年齡、腫瘤大小、組織學(xué)和腫瘤分期的預(yù)后因素[22-24]。2018年，意大利學(xué)者[25]收集了100例早期NSCLC患者，包括42例腺癌（adenocarcinoma, ADC）和58例鱗癌（squamous cell carcinoma, SCC）的手術(shù)切除標(biāo)本和26例接受那武利尤單抗（Nivolumab）免疫治療的晚期NSCLC患者（13例ADC、13例SCC）的組織標(biāo)本，通過mIHC/IF檢測發(fā)現(xiàn)PD-1低表達(dá)的CD8+TILs亞群的高密度與手術(shù)切除患者較長的OS相關(guān)（HR=2.268, 95%CI: 1.056-4.871,P=0.03），且與Nivolumab治療的晚期NSCLC患者較長的無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）相關(guān)（HR=4.51, 95%CI:1.45-13.94,P=0.004）。并且，100% Nivolumab治療有臨床獲益的患者（n=9）均顯示較低的PD-1與CD8的比值，而僅有21.4%療效差的患者（n=17）顯示低比值（P＜0.001）。提示PD-1低表達(dá)的CD8+TILs亞群對手術(shù)切除患者的預(yù)后以及晚期NSCLC患者對免疫治療的反應(yīng)均有積極影響。同年，美國學(xué)者[26]對39例接受不同PD-1/PD-L1抑制劑單藥免疫治療的NSCLC患者及110例未接受免疫治療的NSCLC患者進(jìn)行mIHC/IF檢測評估發(fā)現(xiàn)，接受免疫治療的NSCLC患者中，19例獲得持久臨床獲益患者的CD3+TILs密度較23例療效差的患者高出2.4倍（P=0.02），并且，“休眠”的CD3+TILs細(xì)胞亞群（即低活化低增殖的CD3+TILs）密度越高，NSCLC患者免疫治療的PFS（P=0.043）及OS（P=0.003）越長；而在未接受免疫治療的NSCLC患者中，“休眠”的CD3+TILs細(xì)胞亞群與較長的生存獲益沒有相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了該細(xì)胞亞群可能是免疫治療反應(yīng)的預(yù)測生物標(biāo)志物，但不是預(yù)后標(biāo)志物。

美國學(xué)者Carvajal-Hausdorf等[27]利用mIHC/IF檢測對90例小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）患者的TILs探索發(fā)現(xiàn)，與NSCLC患者預(yù)后顯著相關(guān)的CD8+TILs亞群，與SCLC患者的預(yù)后無顯著相關(guān)性（P=0.16）。相似地，挪威學(xué)者Rakaee等[28]通過mIHC/IF檢測對536例NSCLC患者研究表明，瘤內(nèi)高密度的CD66b+腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils, TANs）在SCC患者中是一個預(yù)后良好的獨(dú)立預(yù)測因素（P=0.038），而在ADC患者中則是預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因素（P=0.032）。這些研究提示了同一種TILs亞群在不同病理組織學(xué)類型的肺癌患者中對腫瘤-宿主免疫活動有不同的影響，這可能與基因組及基質(zhì)異質(zhì)性有關(guān)，許多人認(rèn)為不同組織類型肺癌是不同的實(shí)體。法國學(xué)者對于驅(qū)動基因陽性的肺癌亞群患者進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，ALK陽性的NSCLC患者PD-L1表達(dá)及瘤內(nèi)CD8+TILs密度均高于EGFR陽性患者（P=0.03）和野生型患者（P=0.012），這個結(jié)果表明EGFR突變患者不易對免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)，而ALK可能是抗PD-1/PD-L1抑制劑治療的潛在靶點(diǎn)[29]，但臨床研究[30]未能證實(shí)ALK陽性增加NSCLC患者對PD-1/PD-L1抑制劑治療的敏感性。這表明在該群體中可能還存在其他的耐藥機(jī)制，如T細(xì)胞的抑制受體的共同表達(dá)或免疫抑制細(xì)胞的浸潤[10,11]。

此外，mIHC/IF檢測的多參數(shù)分析可以更好地顯示傳統(tǒng)方法無法檢測到的復(fù)雜細(xì)胞表型的TILs亞群。最近發(fā)現(xiàn)的一種存在于組織中不參與循環(huán)的記憶CD8+T細(xì)胞亞群，被稱為組織常駐記憶T（tissue-resident memory T, TRM）細(xì)胞，是一種包括多個生物標(biāo)記（如CD103、CD49a、CD69）的復(fù)合表型細(xì)胞[31]。mIHC/IF檢測發(fā)現(xiàn)，TRM細(xì)胞能夠在上皮腫瘤區(qū)域內(nèi)與腫瘤細(xì)胞密切接觸，在肺癌等多種人類惡性腫瘤中的浸潤與較好的臨床預(yù)后相關(guān)，且在免疫監(jiān)測中發(fā)揮了重要作用[31,32]。TRM細(xì)胞在不同的臨床研究中被證實(shí)是比CD8+TILs更好的預(yù)后標(biāo)記[33,34]。

3.2 TILs亞群的定位和空間關(guān)系 目前，較多mIHC/IF檢測相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TILs亞群的定位及空間關(guān)系也有較大的臨床價值。Parra等[35]通過mIHC/IF檢測112例NSCLC患者（接受新輔助化療患者61例，未接受新輔助化療患者51例）的組織樣本發(fā)現(xiàn)，接受新輔助化療的NSCLC患者中，CD4+CD3+TILs的定位與患者的生存相關(guān)，其在上皮內(nèi)的高密度與患者更長的OS獲益相關(guān)（P=0.048），而在基質(zhì)內(nèi)的高密度與患者的OS無明顯相關(guān)性。TILs亞群與腫瘤細(xì)胞、不同TILs亞群間的空間關(guān)系能更全面地評估患者預(yù)后，例如，Barua等[36]通過mIHC/IF檢測120例NSCLC患者的組織樣本發(fā)現(xiàn)，腫瘤核心區(qū)域Foxp3+TILs（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）增加是NSCLC患者預(yù)后總生存較差的獨(dú)立因素（HR=1.52, 95%CI: 1.11-2.07,P=0.009），但Foxp3+TILs間的CD8+TILs緩解了這一效應(yīng)，反而與患者較好的OS顯著相關(guān)（HR=0.96, 95%CI: 0.92-0.99,P=0.042）。此外，Mezheyeuski等[37]還發(fā)現(xiàn)CD8+TILs與腫瘤細(xì)胞的距離、CD8+TILs/Treg細(xì)胞比值與NSCLC患者預(yù)后密切相關(guān)。由此，我們推定免疫細(xì)胞的定位及其空間關(guān)系，都與肺癌預(yù)后有著密切的關(guān)系，這可能與空間接近的細(xì)胞間的相互作用相關(guān)。

3.3 TILs亞群上的分子表達(dá) mIHC/IF檢測相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)除TILs亞群的密度、定位及空間關(guān)系外，TILs亞群上相關(guān)分子的表達(dá)與肺癌患者的臨床結(jié)局也有較大的關(guān)系。美國學(xué)者Zugazagoitia等[38]利用mIHC/IF檢測進(jìn)一步分析了69例接受免疫治療的NSCLC患者和258例未接受免疫治療的NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)接受免疫治療的NSCLC患者較長的OS與CMTM6和PD-L1在CD68+TILs亞群（巨噬細(xì)胞）中的高共表達(dá)顯著相關(guān)（HR=0.38, 95%CI:0.16-0.92,P=0.03），但與其在腫瘤細(xì)胞中的高共表達(dá)無明顯相關(guān)性（P=0.15），而此現(xiàn)象在未接受免疫治療的NSCLC患者中未觀察到。類似地，美國學(xué)者Liu等[39]利用mIHC/IF檢測，在425例未接受免疫治療和62例接受帕博利珠單抗（Pembrolizumab）/Nivolumab/阿特珠單抗（Atezolizumab）治療的NSCLC患者的檢測中發(fā)現(xiàn)，單藥免疫治療的NSCLC患者更長的OS與CD68+TILs亞群（巨噬細(xì)胞）中PD-L1高表達(dá)有關(guān)（細(xì)胞計數(shù)P=0.036；分子共定位P=0.019），但是與腫瘤細(xì)胞（細(xì)胞計數(shù)P=0.29）或者間質(zhì)細(xì)胞（細(xì)胞計數(shù)P=0.71）中PD-L1的高表達(dá)無關(guān)；而在未接受免疫治療的NSCLC患者中，CD68+TILs亞群中PD-L1高表達(dá)與患者OS無關(guān)（P=0.16）。PD-L1是最常用于免疫治療選擇的可靠預(yù)測性生物標(biāo)志物，這些研究結(jié)果表明，其在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)較腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)有更大的臨床價值。由此我們推測，如PD-L1這些常用的生物標(biāo)志物與TILs的分析相結(jié)合，對NSCLC患者免疫治療療效的預(yù)測可能更具有準(zhǔn)確性。

TILs在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，并依賴于各種TILs亞群的密度、定位和空間關(guān)系等，嚴(yán)重影響患者的臨床結(jié)果。mIHC/IF檢測讓我們不僅能夠分析一種特定的細(xì)胞類型，還能整合腫瘤不同部位的免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，通過mIHC/IF檢測對NSCLC的TILs亞群深入分析，可以獲得更多的預(yù)后和預(yù)測數(shù)據(jù)，有助于準(zhǔn)確地選擇能夠從免疫治療中獲益的肺癌患者。尤其在組織學(xué)標(biāo)本稀少的情況下，mIHC/IF檢測可以作為新的檢測方法選擇，有望成為臨床上有力的工具。

4 總結(jié)

綜上所述，在肺癌免疫治療的時代，判斷肺癌患者的臨床預(yù)后以及預(yù)測其對免疫治療的療效的方法不斷創(chuàng)新。傳統(tǒng)的IHC/IF檢測仍是當(dāng)今的主流，用以篩選獲益人群，但是受到諸多因素的影響，包括患者組織樣本有限，染色過程冗長費(fèi)力，染色結(jié)果受病理醫(yī)生主觀影響，數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)落后等。新興的mIHC/IF檢測能夠在一個FFPE切片上獲得多種生物標(biāo)志物，同時獲得關(guān)于細(xì)胞組成和空間排列的全面信息。目前的研究顯示其在篩選免疫治療的受益人群上較傳統(tǒng)方法有較高的準(zhǔn)確性，讓我們相信，mIHC/IF檢測在未來有著廣闊的應(yīng)用前景[40]。當(dāng)然，在作為臨床常規(guī)檢測前，mIHC/IF檢測還需要進(jìn)行更多抗體的探索，并進(jìn)行嚴(yán)格的大規(guī)模驗(yàn)證研究。