生物炭固定微生物對草甘膦的去除效果研究*

陳楸健 周 玲 梁 媛

(蘇州科技大學環(huán)境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215000)

草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導性有機磷除草劑，被廣泛應用于防治農(nóng)田草害。草甘膦的極性強，會被土壤和底泥大量吸附，從而惡化土壤和水環(huán)境[1]，抑制微生物酶活性[2]，影響非靶目標植物生長[3]，長期接觸草甘膦污染土壤或水源甚至會影響胎兒發(fā)育[4]。通常人們利用生物炭的吸附效應處理水或土壤中的有機污染物。研究表明，生物炭對0～6 mg/L草甘膦的吸附效果較土壤顆粒高400～2 500倍，可通過吸附作用去除土壤中的草甘膦[5]。微生物因其生物降解效應被廣泛研究，在實驗室模擬條件下，高效降解菌分枝桿菌(Mycobacteriumsp.) ESG4可使土壤中50 mg/kg的草甘膦降解68.89%[6]。TANG等[7]從草甘膦污染水灌溉的農(nóng)田土壤中篩選出高效降解菌，在60 d內(nèi)可降解0.59 mmol的草甘膦。

單一生物炭或微生物均可去除草甘膦，但仍存在一些問題，如生物炭會受土壤粒徑[8]、陽離子交換量(CEC)[9]、pH[10]等理化性質(zhì)影響，使其對草甘膦的吸附容量產(chǎn)生較大波動，無法穩(wěn)定吸附草甘膦。純菌在真實環(huán)境中由于條件惡劣且競爭力遜于土著菌，其草甘膦降解能力大幅下降甚至消失[11]。固定化微生物技術(shù)可將微生物固定于生物炭上制成特定大小、形狀的復合材料顆粒，以提高微生物密度和活性，提高處理負荷，增強微生物對不同濃度、溫度、pH等環(huán)境條件的適應力[12]。微生物還可改變生物炭表面的疏水性和極性[13]，從而提高復合材料與草甘膦的親和力，同時微生物具有降解草甘膦的作用，因此復合材料具有更高效修復草甘膦的潛能。若以生物炭為載體固定草甘膦降解菌，能發(fā)揮生物炭與功能菌各自的優(yōu)勢，可提高對草甘膦的去除效果。因此，本研究以蘆葦生物炭為載體固定草甘膦降解菌，通過對比單一生物炭、單一微生物和復合材料對草甘膦的去除效果，探究生物炭固定微生物是否能發(fā)揮吸附和降解的雙重功效從而提高對草甘膦的去除效果并闡述其機制。

1 材料與方法

1.1 原料的制備

生物炭：蘆葦粉碎，限氧，550 ℃下慢速熱解3 h后得蘆葦生物炭[14]。將制得的蘆葦生物炭研磨，過100目篩，密封備用。

草甘膦降解菌：從某長期施用草甘膦的農(nóng)田土壤中富集馴化得到。按照文獻[15]培養(yǎng)得到草甘膦降解菌菌液。

1.2 復合材料的制備

取1.0 g生物炭置于150 mL三角瓶中，加入10 mL LB培養(yǎng)液混勻，121 ℃下滅菌30 min，取出冷卻至室溫。向三角瓶中加入100 mL接種草甘膦降解菌菌液(接種量4%(體積分數(shù))) 的LB培養(yǎng)液，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h完成吸附固定。將混合液過200目篩網(wǎng)，并用無菌水沖洗篩網(wǎng)上的材料以去除游離菌得到復合材料。將復合材料風干至含水率為30%，存于4 ℃冰箱備用。

1.3 草甘膦去除實驗

(1) 微生物組：在250 mL錐形瓶中各加入200、400、800 mg/L草甘膦培養(yǎng)液200 mL，按4%接種量接種草甘膦降解菌菌液，30 ℃、200 r/min振蕩，分別于1、3、5、18、24、48、72 h用濾頭取2 mL樣液，測定草甘膦濃度、600 nm處的吸光度(OD600)。

(2) 生物炭組：取0.2 g生物炭置于250 mL錐形瓶中，其余操作同微生物組，測定草甘膦濃度及溶液pH。

(3) 復合材料組：取0.2 g復合材料置于250 mL錐形瓶中，其余操作同生物炭組。

1.4 分析測試和計算方法

采用《草甘膦水劑》(GB/T 20684—2017)中紫外分光光度法測定草甘膦濃度。全自動比表面積測定儀(V-sorb2 800)測定材料比表面積。掃描電子顯微鏡(Quanta FEG 250)對材料表面形貌結(jié)構(gòu)與元素進行分析。傅立葉紅外光譜(FT-IR)儀(Thermo 6700型)對材料的表面官能團進行分析。高分辨電位及粒度分析儀(ZetaPALS)測定材料分散在溶液中電位為0 mV時的溶液pH(記為ζ0)。

草甘膦去除量以草甘膦濃度差和溶液體積的乘積計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 草甘膦的去除效果比較

2.1.1 微生物

由圖1(a)可知，當草甘膦初始質(zhì)量濃度為200～800 mg/L時，微生物的生長呈現(xiàn)遲緩期、對數(shù)期和平穩(wěn)期。隨草甘膦初始濃度升高，微生物的生長速度和平穩(wěn)期的生物量逐漸降低，表明高濃度草甘膦對微生物的生長有一定的抑制作用。由圖1(b)可看出，微生物對草甘膦的去除量隨微生物生長同步提高，72 h時，200、400、800 mg/L的草甘膦的去除量分別為26.71、22.84、19.52 mg，隨草甘膦初始濃度增加而降低，表明雖然草甘膦濃度越高可能會提供更多底物供微生物降解代謝，但草甘膦毒性也隨之提高，阻礙微生物對其降解利用。

圖1 微生物在不同初始質(zhì)量濃度草甘膦中的生長及對草甘膦的降解Fig.1 Microbial growth and degradation of glyphosate under different initial mass concentrations of glyphosate

2.1.2 生物炭

由圖2(a)可知，當草甘膦初始質(zhì)量濃度為200、400、800 mg/L時，生物炭吸附草甘膦的速率較快，5 h時，生物炭對草甘膦的去除量分別已達最終去除量的76.52%、77.32%和75.69%；5～18 h，生物炭對草甘膦的吸附迅速減緩，并在24 h后趨于平穩(wěn)；72 h時，生物炭對草甘膦的去除量分別為23.56、30.20、32.78 mg，生物炭對草甘膦的去除量隨草甘膦初始濃度提高而增加，但增量明顯減小，可能是生物炭接近飽和吸附，表面點位不足以吸附過量的草甘膦。由圖2(b)可知，當草甘膦初始質(zhì)量濃度為200～800 mg/L時，吸附過程中溶液pH變幅為4.41～5.17。草甘膦在pH>2.29的溶液中會解離出H+，H+被生物炭中的堿性成分中和，在一定程度上維持了pH的相對穩(wěn)定，且隨草甘膦被生物炭吸附，解離的H+逐漸減少，從而使溶液pH提高。

2.1.3 復合材料

由圖3(a)可知，草甘膦去除量隨初始濃度的提高而增加但增量逐漸減小。當草甘膦初始質(zhì)量濃度為200、400、800 mg/L時，72 h時去除量分別為40.69、52.12、64.14 mg，比微生物組提高52.34%、128.20%、228.59%，比生物炭組提高72.71%、72.58%、95.67%，表明將生物炭作為載體固定草甘膦降解菌可有效提高草甘膦的去除效果。當草甘膦初始質(zhì)量濃度為200～800 mg/L時，溶液pH為4.38～4.96(見圖3(b))，會一定程度上減小草甘膦降解菌活性，降低復合材料表層降解菌的降解效果。

前5 h，3種材料對草甘膦的去除量為生物炭>復合材料>微生物，生物炭對草甘膦的吸附作用顯著高于微生物對草甘膦的降解作用。該階段復合材料去除草甘膦主要依靠生物炭的吸附作用，由于復合材料表面菌膜覆蓋阻礙了草甘膦向材料內(nèi)部擴散，因此對草甘膦的去除量和去除速率均小于生物炭。5 h后，生物炭對草甘膦的吸附趨緩，微生物對草甘膦的去除量仍較小，而復合材料對草甘膦的去除量卻迅速增加，草甘膦克服表面菌膜阻力，開始向復合材料內(nèi)部孔道遷移擴散。18 h后，生物炭由于表面吸附點位接近飽和，對草甘膦的去除量基本達到平衡，微生物因進入對數(shù)生長期，對草甘膦的去除量開始增加，但單一微生物易受草甘膦毒性抑制，其對草甘膦的最大去除量僅為26.71 mg。生物炭能為微生物提供其生長的必要養(yǎng)分和場所，降低草甘膦對微生物的抑制作用，因此在復合材料系統(tǒng)中，生物炭作為微生物載體的作用顯著，生物炭的吸附作用與微生物的降解作用同時發(fā)揮作用，產(chǎn)生協(xié)同效果，對更高濃度的草甘膦去除量較單一生物炭或微生物進一步增大。

圖2 生物炭對不同初始質(zhì)量濃度草甘膦的吸附效果Fig.2 Adsorption effect of biochar on glyphosate with different initial mass concentrations

圖3 復合材料對草甘膦的去除效果Fig.3 Removal of glyphosate by composite materials

當草甘膦初始質(zhì)量濃度為800 mg/L時，采用準一級反應動力學方程(見式(1))和準二級反應動力學方程(見式(2))對生物炭和復合材料去除草甘膦的過程進行分析，計算所得動力學參數(shù)見表1。生物炭去除草甘膦的反應動力學更符合準一級反應動力學方程，表明生物炭去除草甘膦的過程主要受草甘膦初始濃度控制。復合材料去除草甘膦的反應動力學更符合準二級反應動力學方程，表明草甘膦初始濃度并不是控制反應速率的唯一因素，可能還存在固液界面上的電子共用或轉(zhuǎn)移和共價鍵作用。

qt=qe[1-exp(k1t)]

(1)

(2)

式中：t為時間，h；qt、qe分別為t時刻、平衡時單位質(zhì)量材料對草甘膦的去除量，mg/g；k1為準一級反應動力學速率常數(shù)，h-1；k2為準二級反應動力學速率常數(shù)，g/(mg·h)。

2.2 生物炭、微生物和復合材料去除草甘膦機理分析

2.2.1 吸附機制

由表2可知，生物炭和復合材料的ζ0分別為2.92和5.10。ζ0可反映材料在不同pH溶液中表面電荷的情況。當溶液pH小于材料的ζ0時，材料表面帶正電，反之則帶負電(見圖4)。草甘膦分子具有強極性，在溶液pH大于一級解離常數(shù)(pK1，2.29)和二級解離常數(shù)(pK2，5.96)時，會在水中電離出數(shù)個H+，分別形成C3H7NO5P-和C3H6NO5P2-，帶負電[16]。由圖2和圖3可知，生物炭和復合材料溶液pH在4.38～5.17，此時草甘膦主要以C3H7NO5P-形式存在，帶負電。生物炭組：pK2<生物炭ζ0(2.92)<溶液pH(4.41～5.17)，生物炭表面帶負電荷，與草甘膦電荷相斥。復合材料組：pK2<溶液pH(4.38～4.96)<復合材料ζ0(5.10)，復合材料表面帶正電荷，有利于通過靜電力吸附草甘膦。

材料表面的掃描電鏡圖見圖5。微生物及菌膜大量覆蓋在生物炭表面，使其高度變形，孔徑分布不規(guī)則，一定程度上豐富了生物炭表面孔道結(jié)構(gòu)和吸附位點，有利于吸附更多的草甘膦。但由于生物炭表面被大量菌膜覆蓋，草甘膦需克服菌膜阻力，膜擴散時間延長，且擴散速率受限，導致5 h前復合材料對草甘膦的去除速率和去除量均小于生物炭。

由圖6可知，生物炭在固定微生物后3 433 cm-1處的峰發(fā)生偏移，可能是生物炭固定微生物時酚羥基發(fā)生反應；復合材料比生物炭新增了2 964、1 455、1 084 cm-1處的特征峰，是被固定的微生物細胞膜表面脂肪酸、蛋白質(zhì)酰胺和多糖類物質(zhì)[17]。反應后復合材料在3 410、1 662 cm-1處的峰發(fā)生偏移，分別是酚羥基和羧基以化學作用和氫鍵的形式參與固定草甘膦[18-19]；1 394 cm-1處新增一個峰，是pH較低時草甘膦分子表現(xiàn)出的強陽離子-π鍵，與草甘膦分子形成π+-π相互作用形成的C—N鍵[20]，從而形成多層吸附；2 964、1 455 cm-1處特征峰消失，1 084 cm-1處特征峰偏移，表明細胞膜表面脂肪酸、蛋白質(zhì)酰胺和多糖類物質(zhì)參與了草甘膦的去除過程[21]。因此，與生物炭相比，復合材料可提供更多的吸附點位，通過強化酚羥基、羧基等化學鍵，多層吸附和微生物表面脂肪酸、蛋白質(zhì)酰胺和多糖類物質(zhì)的生物反應等作用方式，提高化學吸附能力，吸附更多的草甘膦。

表1 生物炭和復合材料對草甘膦的反應動力學參數(shù)

表2 材料的基本理化性質(zhì)

圖4 材料在不同溶液pH下的ζ0Fig.4 ζ0 of materials with different pH

圖5 材料表面的掃描電鏡圖Fig.5 SEM image of surface of materials

圖6 材料的FT-IR圖譜Fig.6 FT-IR spectra of materials

2.2.2 降解機制

生物炭中的全氮、全磷分別為127、63.5 mg/kg，可為微生物提供充足的養(yǎng)分，提高微生物密度和活性，固定微生物后生物炭的pH由8.63降至7.54，更符合微生物的生長條件。生物炭固定微生物后比表面積降低了22.97%，孔體積降低了24.12%，相對較低的比表面積不會導致草甘膦的生物利用性降低，因此生物炭可作為微生物良好的載體，提高微生物抵御高濃度草甘膦的能力，增強微生物對草甘膦的代謝能力。

草甘膦的降解途徑主要有兩條：被降解為乙醛酸和氨甲基磷酸；被降解為肌氨酸。測定草甘膦為800 mg/L時復合材料組和生物炭組中乙醛酸和肌氨酸濃度，判斷是否有草甘膦降解及其降解途徑。生物炭組溶液中未檢出乙醛酸和肌氨酸，表明生物炭對草甘膦沒有降解作用。復合材料組檢測出乙醛酸(見圖7)，未檢測到肌氨酸，表明微生物通過乙醛酸和氨甲基膦酸途徑對草甘膦進行降解。乙醛酸濃度呈先升后降的趨勢，可能是本實驗微生物是具有草甘膦降解功能的混合菌群，前中期菌群中優(yōu)勢菌為草甘膦降解菌，當乙醛酸達到一定濃度后利用乙醛酸的菌成為優(yōu)勢菌，乙醛酸消耗量高于草甘膦降解產(chǎn)生的乙醛酸量，具體機制需進一步探究。

圖7 復合材料組溶液中乙醛酸質(zhì)量濃度Fig.7 Mass concentration of glyoxylic acid in composite solution

3 結(jié) 論

(1) 微生物對草甘膦的去除量隨草甘膦初始濃度增加而減小，72 h時200、400、800 mg/L的草甘膦的降解去除量分別為26.71、22.84、19.52 mg，草甘膦會抑制微生物生長，降低其降解效果。

(2) 生物炭可快速吸附草甘膦，5 h的去除量可達最終去除量的75%以上，生物炭對草甘膦的去除量隨草甘膦初始濃度提高而增加，72 h時200、400、800 mg/L的草甘膦的吸附去除量分別為23.56、30.20、32.78 mg。

(3) 復合材料可去除更多的草甘膦，72 h時200、400、800 mg/L的草甘膦的去除量分別為40.69、52.12、64.14 mg，比微生物組提高52.34%、128.20%、228.59%，比生物炭組提高72.71%、72.58%、95.67%。

(4) 固定的微生物會在生物炭表面覆蓋菌膜，改變生物炭微觀形態(tài)，提高材料ζ0，增強酚羥基、羧基等表面官能團和化學鍵作用，提高生物炭對草甘膦的靜電和化學吸附能力。生物炭可為微生物提供養(yǎng)分和附著空間，提高微生物抵御高濃度草甘膦的能力，有利于提高微生物的草甘膦降解能力。