植物表面乳酸菌分布研究進(jìn)展

田靜 張建國(guó)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)南方草業(yè)中心，廣州 510642）

青貯是保存青綠多汁飼料營(yíng)養(yǎng)成分最先進(jìn)、最經(jīng)濟(jì)、最簡(jiǎn)便的貯藏方法，為草食動(dòng)物提供全年優(yōu)質(zhì)牧草的最有效技術(shù)［1］。它是通過(guò)乳酸菌（LAB）利用牧草中的水溶性碳水化合物產(chǎn)生以乳酸為主的有機(jī)酸，降低pH，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，從而保存牧草營(yíng)養(yǎng)。所以，牧草表面附著的LAB菌群在青貯過(guò)程起主導(dǎo)作用，是決定青貯優(yōu)劣、成敗的關(guān)鍵因素之一［1］。與青貯飼料發(fā)酵相關(guān)的LAB有乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pedicoccus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈球菌屬（Streptococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）［1-2］。產(chǎn)乳酸的球菌如鏈球菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬和片球菌屬的一些種，通常在青貯初期迅速繁殖，使青貯飼料pH下降，然后乳桿菌屬的菌種開始旺盛繁殖，進(jìn)一步將pH降低至抑制不良微生物生長(zhǎng)和增殖的水平［3］。其中，同型發(fā)酵LAB如乳桿菌屬和片球菌屬等的菌株發(fā)酵葡萄糖只產(chǎn)乳酸，能快速降低青貯飼料pH，營(yíng)養(yǎng)損失較少；而異型發(fā)酵LAB如魏斯氏菌屬的菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生多種發(fā)酵產(chǎn)物，部分碳源以氣體的形式損失，但其在改善青貯窖開封后的有氧穩(wěn)定性效果顯著［4］，因此，LAB的種類對(duì)青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)具有不同的意義。

通常情況下牧草表面附著的LAB數(shù)量較少，在生產(chǎn)實(shí)踐中，常常通過(guò)添加LAB彌補(bǔ)其數(shù)量的不足，進(jìn)而改善其青貯發(fā)酵品質(zhì)［3］。但若牧草表面附著優(yōu)良LAB數(shù)量較多，添加LAB則是一種浪費(fèi)，增加了生產(chǎn)成本。此外，有研究表明牧草表面附著LAB的發(fā)酵效率高于市售LAB接種劑［5］。若能根據(jù)牧草的生長(zhǎng)時(shí)期或生產(chǎn)管理改善牧草本身LAB的數(shù)量和種類，使LAB在牧草適宜收獲期時(shí)的數(shù)量最大、種類最佳，如玉米的成熟初期［6］，而盡量避免在LAB最少時(shí)收獲［7］。因此，確定影響植物表面LAB菌群的關(guān)鍵因素可能對(duì)未來(lái)優(yōu)化青貯飼料生產(chǎn)具有重要意義。本論文對(duì)影響植物表面LAB的主要因素進(jìn)行了闡述。

1 植物種類及特性

1.1 植物種類

新鮮植物表面附著LAB數(shù)量及種類差異較大，一般低于105CFU/g FM，主要是乳桿菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬的一些種［1，7］。如森地敏樹和大山嘉信［8］調(diào)查了日本農(nóng)林水產(chǎn)省畜產(chǎn)試驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)201點(diǎn)新鮮牧草的LAB數(shù)量，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬、明串珠菌屬和片球菌屬的數(shù)量普遍低于102CFU/g FM。蔡義民等［9］發(fā)現(xiàn)意大利黑麥草（Lolium multiflorum）在刈割時(shí)總LAB數(shù)達(dá)105CFU/g FM，主要為乳球菌屬，乳桿菌屬僅為102CFU/g FM。Zhang等［10］對(duì)多年生黑麥草（Lolium perenne）的研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌屬的數(shù)量最多，高達(dá)105CFU/g FM，其次為明串珠菌屬，為104CFU/g FM，片球菌屬和乳桿菌屬的數(shù)量較少，在102CFU/g FM水平左右。Stirling和Whittenbury［11］在生長(zhǎng)植物中進(jìn)行了廣泛的調(diào)查，分離的400個(gè)菌株中，明串珠菌屬的菌株占80%，其余的為乳桿菌屬和片球菌屬。

熱帶牧草較溫帶牧草可能具有較多的異型發(fā)酵LAB，會(huì)導(dǎo)致青貯過(guò)程中乙酸型發(fā)酵。如玉米（Zea mays）表面LAB主要是異型發(fā)酵的乳球菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬，有時(shí)會(huì)檢測(cè)到很少同型發(fā)酵的乳桿菌屬［12-14］；象草（Pennisetum purpureum）表面主要是乳球菌屬，很少量的乳桿菌屬、明串珠菌屬和片球菌屬［14-15］；高粱（Sorghum bicolor）表面主要是乳球菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬［14，16］；蘇丹草（Sorghum Sudanese）表面主要是乳球菌屬［14］；雜交狼尾草（P. americanum×P. purpureum）和銀合歡（Leucaena glauca）表面乳桿菌屬最豐富［17-18］；柱花草（Stylosanthes）主要是乳桿菌屬、腸球菌屬、魏斯氏菌屬和乳球菌屬［18］。而鴨茅（Dactylis glomerata）表面主要是鏈球菌屬［19］；燕麥（Avena fatua）表面主要是乳桿菌屬、其次是異型發(fā)酵LAB，包括乳球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和片球菌屬［18，20］；披堿草（Elymus nutans）表面主要是乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬［21］；苜蓿（Medicago sativa）表面主要是腸球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬［13，15，22］；紅豆草（Onobrychis viciifolia）只有乳桿菌屬［23］。

在種水平上，植物乳桿菌（Lb. plantarum）、短乳桿菌（Lb. brevis）、干酪乳桿菌（Lb. casei）、乳酸乳球菌（Lc. lactis）和融合魏斯氏（W. confusa）是牧草表面最主要的LAB。陳鑫珠［24］研究了廣東的13種植物物種或品種表面上的微生物，發(fā)現(xiàn)植物種類對(duì)LAB的影響很大，其中植物乳桿菌、乳酸乳球菌和融合魏斯氏菌分別占LAB總數(shù)的30.2%、23.9%和22.6%；大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）和燕麥中乳酸乳球菌和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lc. lactis subsp. lactis）共占51.9%。狼尾草屬牧草表面主要是植物乳桿菌、戊糖乳桿菌（Lb.pentosus）、乳酸乳球菌、檸檬明串珠菌（Le. citreum）和融合乳桿菌［25］，玉米秸稈表面附著的主要LAB是植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和短乳桿菌，占LAB總數(shù)的85.6%［26］；苜蓿表面主要是食竇魏斯氏菌（W.cibaria）、植物乳桿菌、戊糖片球菌（P. pentosaceus）、戊糖乳桿菌、赫倫魏斯氏菌（W. hellenica）、短乳桿菌、布氏乳桿菌（Lb. buchneri）［22］，燕麥主要是耐酸乳桿菌（Lb. acetotolerans）［27］。Minervini等［28］發(fā)現(xiàn)硬質(zhì)小麥從分蘗期（4月初）到生理成熟期（7月初）均有植物乳桿菌的不同菌株存在。以上LAB具有較大的基因組，包含許多附屬基因，且在菌株的水平上似乎已經(jīng)多樣化，具有保守的核心代謝途徑，且大多數(shù)植物性食品的發(fā)酵都受其控制［29］。

1.2 植物表面營(yíng)養(yǎng)組成及含量

植物表面附著LAB的數(shù)量和種類在不同茬次、部位和生長(zhǎng)期存在差異，如紫花苜蓿、王草和象草表面LAB的數(shù)量隨生育期的推進(jìn)而增加［7，24］；幼葉上的細(xì)菌多樣性指數(shù)高于老葉［25］；第二茬和第三茬王草和象草表面的LAB數(shù)量多于第一茬［24］；玉米莖上存在的LAB種類比葉上的多［24］。這些差異很大程度上是由葉片特有的物理和營(yíng)養(yǎng)狀況引起的，而葉片的化學(xué)特性對(duì)其影響更大［30-31］。Wilson等［32］研究表明葉片上碳源的可用性是附生細(xì)菌定植的主要決定因素，其次是氮源。Tang等［31］研究也表明LAB種群大小與植物的水溶性碳水化合物含量呈極顯著正相關(guān)，且葡萄糖、果糖和蔗糖是LAB生長(zhǎng)的優(yōu)選碳源，在碳源選擇上也有較大差異［33］，如明串珠菌屬的菌株只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、甘露糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖和纖維二糖［34］，戊糖乳桿菌和植物乳桿菌首選蔗糖和果糖作為碳源，屎腸球菌（E. faecium）首選蔗糖和木糖，而發(fā)酵乳桿菌（Lb.fermentum）首選棉籽糖，融合魏斯氏菌首選蔗糖和果糖，其次是木糖和葡萄糖［24］。此外，LAB的附著部位與其營(yíng)養(yǎng)利用也有必然聯(lián)系［24］，如嗜果糖乳酸菌屬（Fructobacillus）僅能從富含果糖的環(huán)境中分離到，如花蜜和水果表面［35］。因其基因組中編碼碳水化合物運(yùn)輸、代謝基因的比例低于葡萄糖代謝的菌種［35］。戊糖乳桿菌和短乳桿菌能在富含半纖維素的小麥秸稈上生長(zhǎng)良好［36］，可能由于其具有參與半纖維素降解的基因，如α-葡萄糖醛酸酶、多糖脫乙酰酶、內(nèi)切木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶和乙酰酯酶［37］。除此之外，植物表面的總酚、游離氨基酸、可溶性蛋白和磷含量等對(duì)LAB的定植也有不同程度的影響［38］。

各種養(yǎng)分在植物表面分布并不均勻，如葉片的大多數(shù)區(qū)域僅包含少量營(yíng)養(yǎng)，且可能僅在少數(shù)區(qū)域相對(duì)豐富［39］。但若局部外滲，如腺毛或損傷部位，會(huì)形成大型細(xì)菌聚集體，如鏈球菌屬主要出現(xiàn)在鴨茅的開花部位［40］。片球菌屬和鏈球菌屬菌株在未受損的植物表面稀少，甚至在植物的完整花序或種子未檢測(cè)到，而在被昆蟲破壞的葉子、草根的鞘和枯萎的草葉上能檢測(cè)到［11］。此外，在牧草收獲和青貯作業(yè)期間，植物材料上的LAB數(shù)量會(huì)顯著增加，作物收獲期間使用的機(jī)械設(shè)備和手持工具中也檢測(cè)到許多微生物［1］。陳鑫珠和張建國(guó)［41］的研究表明王草和甜玉米的LAB數(shù)量從收獲到切碎階段顯著增加，主要是乳酸乳球菌、檸檬明串珠菌和融合魏斯氏菌的增加。

1.3 植物葉表面結(jié)構(gòu)

除葉片表面滲出的養(yǎng)分影響外，葉片特有的物理結(jié)構(gòu)對(duì)LAB分布也有較大影響。如闊葉植物（豆類）中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)明顯大于禾草或蠟質(zhì)葉片的植物［42］。有些植物葉片有厚厚的蠟質(zhì)表皮或較大的接觸角，表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性，不僅限制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散并會(huì)抑制葉面的潤(rùn)濕度來(lái)干擾細(xì)菌的定植［43］。Tang等［31］對(duì)不同象草品種葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：葉表面LAB數(shù)量與葉表皮毛存在顯著的正相關(guān)，一方面表皮毛可能為微生物提供了附著的位點(diǎn)［44］；另一方面，表皮毛可能影響葉表面的潤(rùn)濕性，短而密集的絨毛會(huì)增大葉表面的接觸角，如紫花苜蓿下表面和玉米葉片上表面的長(zhǎng)而尖的表皮毛可能會(huì)刺破小水珠因張力而形成的薄膜，導(dǎo)致葉表面形成的水滴極容易鋪展開，導(dǎo)致接觸角劇烈減小，葉片親水性增加［45］。有些細(xì)菌產(chǎn)生具有表面活性劑特性的化合物提高葉片的潤(rùn)濕性，可能使?fàn)I養(yǎng)從葉片組織內(nèi)部更易擴(kuò)散和外滲，從而為葉表面微生物提供營(yíng)養(yǎng)［46］。

2 生長(zhǎng)環(huán)境

2.1 溫濕度

由于日間不同時(shí)間溫度、濕度的變化，以及降雨等的影響，植物表面的溫、濕環(huán)境變化較為劇烈，從而影響乳酸菌的附著、生長(zhǎng)。當(dāng)植物生長(zhǎng)環(huán)境溫度較高而相對(duì)濕度較低時(shí)，葉片蒸騰作用減弱，氣孔關(guān)閉，葉片表面變得相對(duì)干燥且限制了葉內(nèi)營(yíng)養(yǎng)擴(kuò)散到表面，減少了葉際微生物可利用的水分和營(yíng)養(yǎng)，從而影響微生物數(shù)量和活性［43］。但若植物長(zhǎng)期處于干旱，植物葉片將會(huì)水分虧損，細(xì)胞膜受到損傷，內(nèi)容物外滲，尤其是脯氨酸和可溶性蛋白含量增加，使植物表面的微生物數(shù)量急劇增加［43］。LAB對(duì)外界溫度的適應(yīng)性廣泛，但最適生長(zhǎng)溫度不同，如乳桿菌屬的菌株最適生長(zhǎng)溫度為30-40℃，明串珠菌屬為20-30℃，腸球菌屬和鏈球菌屬為37℃，而片球菌屬為30℃［47］。研究表明高溫下植物表面LAB的數(shù)量少于低溫下的植物［47-49］，陳鑫珠［24］研究表明10℃、15℃和20℃下生長(zhǎng)的植物表面LAB數(shù)量明顯高于25℃下的植物。腸膜明串珠菌（Le.mesenteroides）在10℃和15℃最多。植物乳桿菌和類腸膜魏斯氏菌（W. paramesenteroides）分別在20℃和25℃下最多。10℃和15℃時(shí)LAB種類較豐富。環(huán)境濕度會(huì)影響植物表面的水活度，從而影響微生物對(duì)植物表面水分和營(yíng)養(yǎng)的利用率。通常，外界環(huán)境濕度越高，牧草表面LAB數(shù)量越多［33，38］。唐國(guó)建［38］研究表明一年生黑麥草在50%濕度下的LAB數(shù)量為4 lg CFU/g FM以下，而90%濕度下接近5 lg CFU/g FM。

2.2 季節(jié)、降雨和干旱

季節(jié)、降雨和干旱會(huì)顯著影響植物表面的微生境。Stirling［50］報(bào)道LAB數(shù)量不受季節(jié)的影響，而有研究表明LAB的數(shù)量在整個(gè)季節(jié)中是變化的［6-7］，且植物表面附著的LAB數(shù)量夏季（6-9月）比其它季節(jié)多［11］，LAB種類春季（3-6月）比夏末秋初（9-10月）豐富［51］。陳鑫珠［24］研究表明植物乳桿菌和融合魏斯氏菌主要出現(xiàn)在2-4月種植的植物上，而乳酸乳球菌和乳酸乳球菌乳酸亞種主要出現(xiàn)在12月種植的植物上。關(guān)于降雨對(duì)植物表面LAB影響的研究很少，Guan等［49］從四川、重慶和貴州的五個(gè)主要生態(tài)區(qū)收集了48個(gè)處于乳熟期的玉米材料，LAB數(shù)量為2.9-6.4 lg CFU/g FM；魏斯氏菌屬是這些玉米中主要的LAB，其次是乳桿菌屬和明串珠菌屬；玉米表面的乳桿菌屬、醋桿菌屬（Acetobacter）、乳球菌屬和明串珠菌屬的相對(duì)豐度與平均降雨量之間存在顯著正相關(guān)。唐國(guó)建［38］研究表明不同干旱脅迫處理一年生黑麥草后，其表面的LAB數(shù)量隨著干旱程度的增加而顯著下降，干旱程度很強(qiáng)時(shí)又顯著上升。Daranas等［52］報(bào)道植物乳桿菌PM411可誘導(dǎo)編碼干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，且多糖的合成有助于LAB承受干旱脅迫［53］。

2.3 氧氣

通常，LAB被認(rèn)為是兼性厭氧菌，依靠發(fā)酵代謝生長(zhǎng)，但許多植物表面依然有LAB存在，這就使得其耐氧并具有抵御活性氧的能力。許多LAB都具有由cydABCD操縱子編碼的基本電子傳遞鏈，但只有當(dāng)植物表面的其它微生物產(chǎn)生血紅素或甲萘醌時(shí)，才能激活其有氧呼吸［54-55］。LAB產(chǎn)生有氧呼吸的關(guān)鍵酶，如NADH氧化酶、NADH過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶和細(xì)胞色素氧化酶等。Golomb等［56］研究表明植物表面的乳酸乳球菌KF147缺失了非核糖體多肽合成酶/聚酮化合物合酶，導(dǎo)致了其對(duì)H2O2和超氧化物自由基的高度敏感。目前，有關(guān)LAB呼吸代謝在植物組織上的生長(zhǎng)和存活研究很少，有待進(jìn)一步研究。

2.4 光照

通常光照也會(huì)影響植物表面LAB的分布。唐國(guó)建［38］研究表明16 h光周期條件下的一年生黑麥草表面LAB數(shù)量顯著高于12 h和22 h光周期的。光周期為22 h時(shí)，同一成熟葉的上表面LAB數(shù)量顯著低于下表面的，這可能是長(zhǎng)時(shí)間光照顯著改變了葉表面蠟質(zhì)的晶體形態(tài)，使得上表面更加疏水，營(yíng)養(yǎng)滲出更難［57］。尉志霞［58］研究表明中午刈割的紫花苜蓿表面附著微生物的數(shù)量小于早上或傍晚刈割的。紫外線較強(qiáng)會(huì)嚴(yán)重影響LAB的生長(zhǎng)甚至致死［59］，強(qiáng)的紫外線輻射通常是植物表面微生物必須適應(yīng)表面環(huán)境最突出的特征之一，Sundin和Jacobs曾報(bào)道能忍受紫外線輻射的細(xì)菌能產(chǎn)生色素［60］，而有關(guān)LAB產(chǎn)生色素的研究未見報(bào)道。

3 田間管理

田間管理措施在一定程度上間接影響植物表面的微生境，從而影響其表面菌群。陳鑫珠［24］研究表明黑麥草噴施少量尿素后LAB種類和數(shù)量顯著高于不噴施或噴施較多的處理，且主要是植物乳桿菌。李春江［61］曾報(bào)道在一定范圍內(nèi)小麥表面的LAB數(shù)量隨施氮量而增加，但施氮量進(jìn)一步增加則減少LAB數(shù)量，原因可能是施肥造成的C/N比變化影響了微生物活性［62］。此外，施肥種類也不同程度地影響LAB的分布［15］，但缺乏系統(tǒng)性的研究。

牧草的刈割茬次和高度也不同程度地影響LAB，如陳鑫珠和張建國(guó)［63］研究表明熱研4號(hào)王草的第二和三茬LAB的數(shù)量顯著高于第一茬，且植株在2 m高度的LAB數(shù)量較多。第一茬、第二茬的1.0 m植株和第三茬1.5 m及以下的植株表面植物乳桿菌占優(yōu)勢(shì)，而第一茬1.0 m植株有少量的乳酸乳球菌，1.5 m及以上有少量戊糖乳桿菌；第二茬1.5 m及以上植株分離到融合魏斯氏菌；第三茬2.0 m植株有大量融合魏斯氏菌（84.1%）和少量食竇魏斯氏菌（15.4%）。Torriani等［64］連續(xù)研究了玉米收割前35天，及紫花苜蓿第二茬至第五茬附著LAB的變化，發(fā)現(xiàn)玉米上的LAB數(shù)量變化范圍為1×101-3×105CFU/g FM，紫花苜蓿為2×101-4×103CFU/g FM；LAB數(shù)量與天氣狀況、生長(zhǎng)時(shí)間無(wú)關(guān)；兩種植物上的優(yōu)勢(shì)LAB都是植物乳桿菌和假腸膜明串珠菌（Le.Pseudomesenteroides），而紫花苜蓿上布氏乳桿菌也較多。最近，有研究表明混播或間作收獲的混合材料附生的LAB多于單播或單作材料［65-66］。

4 其它因素

除以上影響因素外，海拔高度和表面其它微生物等也會(huì)影響植物表面LAB［29，59］。如在臺(tái)灣海拔約800 m的兩個(gè)農(nóng)場(chǎng)中，最常見的LAB是異型發(fā)酵的明串珠菌屬和魏斯氏菌屬，而海拔約1 200 m處，乳酸乳球菌乳酸亞種是最常見的LAB［67］，海拔的影響主要是通過(guò)溫度和紫外線等因素綜合作用。因此，影響植物表面LAB的因素較復(fù)雜。若利用高通量測(cè)序、核酸分子雜交等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（gfp）與針對(duì)影響因子有響應(yīng)的啟動(dòng)子連接起來(lái)，可能有助于了解LAB的一些特性以及它們耐受與植物相關(guān)的理化脅迫。

5 展望

提高對(duì)植物表面LAB的了解，根據(jù)草種、生長(zhǎng)環(huán)境、利用時(shí)期等事先預(yù)測(cè)其上LAB的存在狀態(tài)，或通過(guò)一些管理技術(shù)提高優(yōu)良LAB的數(shù)量，可減少青貯飼料生產(chǎn)中LAB添加的盲目性。這不僅可以豐富青貯研究理論，促進(jìn)低成本、高效率生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)青貯飼料，也可更好地促進(jìn)其他領(lǐng)域中LAB的利用，如發(fā)酵植物食品和飲料、植物促生劑、生物防治劑或服務(wù)于人類和動(dòng)物健康的益生菌等［68-69］。