基于cGAS-STING信號(hào)通路調(diào)控小分子化合物的研究進(jìn)展*

寇盟，蔡幸婷，李達(dá)諒

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

cGAS-STING信號(hào)通路作為先天免疫重要的組成部分，在抵抗病原體的入侵過程中發(fā)揮著重要的作用。cGAS通過識(shí)別病原體DNA激活先天免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一系列抗病毒作用因子，從而抵御病毒感染[1]。越來越多的證據(jù)表明，cGAS的過度活化是自身免疫炎癥性疾病發(fā)生的誘因。細(xì)胞中DNA主要存在于細(xì)胞核和線粒體中，在某些病理?xiàng)l件下，自身DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并在細(xì)胞質(zhì)中積累，從而持續(xù)性激活cGAS-STING信號(hào)通路，誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生[2]，而抑制cGAS-STING級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以緩解自身免疫性疾病患者的癥狀。研究表明，巨噬細(xì)胞處理壞死的腫瘤細(xì)胞過程中，巨噬細(xì)胞cGAS-STING通路應(yīng)答腫瘤細(xì)胞DNA，激活機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，cGAS-STING和細(xì)胞衰老、癌癥之間的調(diào)控關(guān)系已相繼被揭示[3,4]。因此，開發(fā)調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路的小分子藥物對(duì)病毒感染、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病的治療具有重要意義。本綜述總結(jié)了近年來靶向調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路的小分子化合物抑制劑及激動(dòng)劑，為靶向cGAS-STING通路的臨床用藥提供借鑒。

1 cGAS-STING 信號(hào)通路

1.1 環(huán)GMP-AMP合成酶cGAS

cGAS屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Nucleotidyltransferase,NTase）家族，包含1個(gè)核苷轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和2個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域是cGAS識(shí)別DNA并催化產(chǎn)生2’3’-cGAMP的必需結(jié)構(gòu)域[5]。在沒有DNA刺激的情況下，cGAS以自我抑制的狀態(tài)存在，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)異常的dsDNA分子時(shí)，包括DNA病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸或者細(xì)胞核及線粒體損傷產(chǎn)生的DNA，cGAS會(huì)與其結(jié)合，形成一個(gè)2∶2的復(fù)合物[6]。這導(dǎo)致了cGAS活性位點(diǎn)的構(gòu)象改變，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化三磷酸鳥苷（GTP）和三磷酸腺苷（ATP）形成2'3'環(huán)GMP-AMP（cGAMP）[7]。cGAMP作為第二信使，與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的接頭蛋白STING結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而激活STING[8]，接著STING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道進(jìn)入高爾基體中，在這個(gè)過程中，STING的羧基末端招募并激活TANK結(jié)合激酶 1（TANK-binding kinase 1，TBK1），激活的TBK1會(huì)磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3），活化的IRF3易位到細(xì)胞核中并誘導(dǎo)I型IFN的表達(dá)[9]。同時(shí)，STING通過IκB激酶（IKK）的活性來激活轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與IRF3等轉(zhuǎn)錄因子共同作用，誘導(dǎo)干擾素和炎性細(xì)胞因子如TNF、interleukin 1β(IL-1β)、IL-6的表達(dá)[6]。

1.2 DNA識(shí)別通路的接頭蛋白STING

STING又稱為TMEM 173/MITA或ERIS，屬于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上跨膜接頭蛋白，是I型干擾素產(chǎn)生過程中的重要接頭蛋白，通過識(shí)別2'3'-cGAMP來激活下游信號(hào)通路[10]。在結(jié)構(gòu)上，STING由氨基端的4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和梭基末端結(jié)構(gòu)域（Carboxyl-terminal domain，CTD）組成，并通過TM1-4錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[11]。C末端尾（Carboxy-terminal tail，CTT）與c-di-GMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（c-di-GMP binding domain，CBD）相結(jié)合使STING在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）上處于非活性狀態(tài)[12]，當(dāng)cGAMP與STING結(jié)合后，引起了STING構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致STING通過ER與高爾基體中間區(qū)（ERGIC）進(jìn)行運(yùn)輸[13,14]。最近，低溫電子顯微鏡揭示了cGAMP激活STING的機(jī)制[15]，cGAMP結(jié)合到STING的配體結(jié)合域?qū)е铝讼鄬?duì)于跨膜結(jié)構(gòu)域180個(gè)構(gòu)象的改變，使得STING寡聚化和易位。這種STING的易位使C末端能夠插入位于支架和二聚化結(jié)構(gòu)域[15]以及相鄰TBK1亞基的激酶域之間的TBK1的凹槽中[16]。STING寡聚作用對(duì)TBK1的激活至關(guān)重要，因?yàn)樗梢允瓜噜彽腡BK1分子發(fā)生反式自磷酸化，而由于幾何分子的限制，這一過程在其他情況下是不可實(shí)現(xiàn)的[9]。TBK1使STING的C末端磷酸化[16]，為IRF3提供了一個(gè)對(duì)接位點(diǎn)，使被TBK1磷酸化激活的IRF3形成二聚體，并在激活后進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活包括I型干擾素在內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄[17]。I型干擾素會(huì)誘導(dǎo)干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)，在抗病毒應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。

由于cGAS-STING信號(hào)通路對(duì)于機(jī)體先天免疫的重要性，接下來本文將從以下2方面進(jìn)行介紹。

圖1 cGAS-STING通路

2 cGAS-STING通路的直接調(diào)控

2.1 cGAS的小分子抑制劑

細(xì)胞中DNA通常被嚴(yán)格限制在細(xì)胞核和線粒體中，病毒侵染進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中病毒DNA具有很強(qiáng)免疫刺激性[18]，能被cGAS快速檢測(cè)到，從而引發(fā)抗感染的免疫反應(yīng)[19]。然而，自身DNA也會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中積累，造成cGAS慢性激活，導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫性疾

病，目前尚無有效的治療方法。在由TREX1的功能喪失引起的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）和Aicardi Goutières等炎性疾病模型中，cGAS的敲除能夠有效地挽救這些致死性的自身免疫疾病，使其成為治療這些疾病的理想靶點(diǎn)[2]。因此，越來越多的研究小組致力于開發(fā)cGAS抑制劑。以往的cGAS抑制劑的藥物化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)效應(yīng)在其他綜述中已詳細(xì)討論，在這里僅進(jìn)行歸納不再進(jìn)行綜述[20]。cGAS的抑制劑見表1。

表1 cGAS小分子抑制劑

最近報(bào)道了2種人類cGAS（hcGAS）抑制劑，Rosaura等人[21]基于hcGAS的蛋--蛋白接口（proteinprotein interface，PPI）為靶點(diǎn)，針對(duì)cGAS/dsDNA復(fù)合物的藥物文庫進(jìn)行高通量篩選來識(shí)別新的hcGAS小分子抑制劑。研究表明，CU-32和CU-76選擇性地抑制人類細(xì)胞中的DNA通路，對(duì)RIG-I-MAVS或Toll樣受體通路沒有影響。2種化合物都呈劑量依賴性，IC50分別為CU-32[IC50=(0.66±0.10)μm]和CU-76[IC50=(0.27±0.06)μm]。這類小分子為開發(fā)具有潛在治療應(yīng)用的hcGAS抑制劑提供了一個(gè)新的化學(xué)支架，也為研究人類細(xì)胞中cGAS生物學(xué)和cGAS相關(guān)疾病提供了有效的小分子化學(xué)探針。

2.2 STING的小分子調(diào)節(jié)劑

2.2.1 STING的小分子抑制劑

STING的持續(xù)活化已被認(rèn)為與單基因自炎性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如Aicardiu-goutieres綜合征和STING相關(guān)性血管病變，起病于嬰兒期[22]。最近，越來越多的證據(jù)表明，STING在一系列更復(fù)雜的炎癥疾病中起致病作用[23]，因此，STING是一個(gè)有吸引力的治療干預(yù)靶點(diǎn)。STING抑制劑的藥物化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)效應(yīng)在其他綜述中已詳細(xì)討論，在這里不再進(jìn)行綜述[24]。STING 的抑制劑見表2。

表2 STING小分子抑制劑

2.2.2 STING的小分子激動(dòng)劑

激活cGAS-STING通路可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。最近發(fā)現(xiàn)了幾種STING的激動(dòng)劑，見表3。

Shi等人[25]，通過基因組采集和生物合成的方法，發(fā)現(xiàn)新的含肉桂?；姆呛颂求w肽（Cinnamoylcontaining nonribosomal peptides，CCNPs），從而從公共細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫中識(shí)別出51個(gè)假定存在的CCNP基因簇。在對(duì)菌株進(jìn)行優(yōu)先排序后，發(fā)現(xiàn)了一類新的C C N P 型糖肽， 命名為吉他霉素（kitacinnamycins），其中kitacinnamycins 8對(duì)STING表現(xiàn)出較強(qiáng)的激活能力。

Ramanjulu等人[26]使用放射標(biāo)記的cGAMP和hSTING進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，報(bào)道了一種新型的氨基苯并咪唑（ABZI）的STING激動(dòng)劑，該激活劑對(duì)STING亞基具有一定的結(jié)合親和力，二聚后通過連接劑4碳丁烷（di-ABZI）使其結(jié)合的親和力明顯增強(qiáng)。此外，在人類PBMCs樣本中，對(duì)di-ABZI誘導(dǎo)劑量依賴性激活STING和分泌產(chǎn)生的IFN-β進(jìn)行分析評(píng)估半最大濃度（EC50）為130 nM。該小組已經(jīng)在具有免疫能力的同基因結(jié)腸腫瘤小鼠中測(cè)試了STING的激動(dòng)劑di-ABZI的抗腫瘤活性，靜脈給藥后結(jié)果顯示腫瘤體積在徹底持久地消退。同樣，最近一篇研究報(bào)道中的化合物24b，是一種氨基苯并咪唑的衍生物（EC50值為0.287μm），對(duì)建立的同系結(jié)腸腫瘤小鼠經(jīng)靜脈給藥后也展現(xiàn)了顯著的抗腫瘤作用[27]。 Pan等人[28]，通過高通量細(xì)胞的表型篩選，鑒定了一種口服的非核苷酸的作用于人類和小鼠的STING的小分子激動(dòng)劑，稱為MSA-2。在同基因小鼠腫瘤模型中，皮下和口服MSA-2均耐受良好，可刺激腫瘤中IFN-β的分泌而誘導(dǎo)腫瘤消退，具有持久的抗腫瘤免疫，并能夠協(xié)同抗PD-1的治療。實(shí)驗(yàn)和理論分析表明，MSA-2在溶液中以互轉(zhuǎn)化單體和二聚體這2種形式存在，但只有二聚體形式能夠與STING結(jié)合并激活STING。因此，用合成共價(jià)模型對(duì)MSA-2二聚體進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)MSA-2二聚體確實(shí)是STING的強(qiáng)有力的激動(dòng)劑。此外，還發(fā)現(xiàn)在酸性腫瘤微環(huán)境中，MSA-2的細(xì)胞效能隨著細(xì)胞外酸化而增強(qiáng)。以上這些特性都證明了MSA-2是一個(gè)適用于臨床應(yīng)用的有價(jià)值的STING激動(dòng)劑。

表3 STING小分子激動(dòng)劑

Emily等人[29]使用cGAS-STING通路靶向細(xì)胞表型篩選方法來鑒定功能性非核苷酸STING小分子激動(dòng)劑，發(fā)現(xiàn)了小分子SR-717，SR-717用0.18 nm共晶結(jié)構(gòu)與h-STINGR232結(jié)合，是一種能夠模擬cGAMP與STING結(jié)合方式的小分子激動(dòng)劑，能夠誘導(dǎo)STING的“封閉”構(gòu)象。通過對(duì)重組人和小鼠STING （hSTING和mSTING）的蛋白熱轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析，SR-717可直接與靶點(diǎn)結(jié)合產(chǎn)生活性，展現(xiàn)跨物種活性和人類等位基因特異性。因此，SR-717表現(xiàn)出抗腫瘤活性和促進(jìn)相關(guān)組織中CD8+ T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活化的功能，并促進(jìn)了抗原的交叉啟動(dòng)。SR-717以STING為靶點(diǎn)誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達(dá)，包括程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1），這對(duì)于臨床試驗(yàn)具有重要的意義。

2.3 IRF3的小分子抑制劑

雷公藤紅素（Celastrol，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2）是從藥用植物雷公藤中分離出來的最有效的生物活性分子之一，因其對(duì)包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和Aicardian -Goutieres綜合征，或其他干擾素疾病在內(nèi)的各種慢性疾病的潛在治療價(jià)值而聞名。然而雷公藤紅素潛在的作用機(jī)制尚不清楚。我們課題組發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素在體內(nèi)外抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的激活，從而下調(diào)由細(xì)胞質(zhì)DNA引發(fā)的干擾素反應(yīng)。并且觀察到雷公藤紅素可以有效地抑制外源DNA誘導(dǎo)的IFN反應(yīng)，IC50值為(145.7±23.6)nm。此外，用雷公藤紅素治療可顯著改善TREX1-/-自身免疫性疾病小鼠模型的自身免疫表型，包括心肌炎、干擾素異常反應(yīng)和自身抗體的產(chǎn)生，以及T細(xì)胞的過度激活。因此，雷公藤紅素可抑制自身DNA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并具有治療自身免疫性疾病以及干擾素相關(guān)疾病的潛力[30]。

圖2 雷公藤紅素化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 cGAS-STING信號(hào)通路的間接調(diào)控

3.1 靶向BAF間接調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路

Guey等人[31]在各種細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了BANF1編碼的自整合障礙因子1（BAF）的下調(diào)可以引發(fā)強(qiáng)烈的干擾素應(yīng)答。BAF是一種染色質(zhì)結(jié)合蛋白，在有絲分裂結(jié)束時(shí)對(duì)核膜重組至關(guān)重要。研究者們通過使用單分子全內(nèi)反射熒光（smTIRF）顯微鏡實(shí)時(shí)可視化監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)BAF可以動(dòng)態(tài)取代瞬時(shí)結(jié)合到cGAS單體上的dsDNA。這種機(jī)制抑制了cGAS-STING信號(hào)通路的激活，限制了異常的免疫反應(yīng)，因此，通過抑制BAF來激活cGAS-STING信號(hào)通路，可能是一種有效的抗腫瘤策略。

Wanil Kim等人[32]發(fā)現(xiàn)Obtusilactone B（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3）是一種丁醇內(nèi)酯衍生物，純化自珍珠繡線菊，可以作為BAF的小分子抑制劑，通過抑制牛痘相關(guān)激酶1（VRK1）介導(dǎo)的-礙-自整合因子（BAF）的磷酸化來調(diào)控BAF。其與BAF的特異性結(jié)合抑制了VRK1介導(dǎo)的BAF磷酸化和隨后的DNA核膜解離，從而使BAF失活。另外，Seong-Hoon Kim等人[33]從豆科叢中分離到brazilin（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3），證明它在體外和體內(nèi)都抑制了BAF的磷酸化，同樣通過抑制VRK1介導(dǎo)的BAF磷酸化從而使其失活。因此，有證據(jù)表明Obtusilactone B和brazilin可以作為一種間接調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路的候選小分子化合物。

3.2 靶向HER2間接調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路

Wu等人[34]通過雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)篩選到了酪氨酸激酶受體HER2（又稱ErbB-2或Neu），發(fā)現(xiàn)HER1能有效抑制cGAS-STING信號(hào)通路。抑制機(jī)制主要是通過HER2胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)域（ICD）與STI緊結(jié)合結(jié)合，同時(shí)活化后的HER2能夠招募下游蛋白激酶AKT1，將AKT1引入STING后，在S510位點(diǎn)磷酸化TBK1，進(jìn)而阻礙了STING與TBK1復(fù)合物的形成和TBK1 K63連接泛素化，從而衰減了STING信號(hào)。HER2減弱了由細(xì)胞質(zhì)DNA傳感引起的抗病毒防御，因此通過抑制HER2可能有效地激活cGAS-STING信號(hào)通路。

圖3 間接調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路的候選小分子化合物

Kulukian等人[35]報(bào)道了一種新型的、高選擇性的可口服靶向HER2的小分子抑制劑tucatinib（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖3），在生化和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，tucatinib以納米級(jí)效價(jià)抑制HER2激酶活性。故，可以通過tucatinib抑制HER2，進(jìn)而間接調(diào)控到cGAS-STING信號(hào)通路。

4 結(jié)論與展望

近年來相關(guān)研究已經(jīng)證明了cGAS-STING通路在抵抗細(xì)菌、病毒入侵和腫瘤生成方面的重要作用，因此，靶向cGAS-STING信號(hào)通路激活先天免疫，增強(qiáng)機(jī)體的免疫性能被科學(xué)領(lǐng)域認(rèn)為是治療癌癥的希望。但cGAS-STING通路的異常激活，是引發(fā)炎癥和自身免疫性疾病的主要誘因，如心血管疾病、炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等，因此研究開發(fā)cGAS-STING信號(hào)通路的有效且有選擇性的激動(dòng)劑和抑制劑藥物是一項(xiàng)重要的任務(wù)。

同時(shí)，發(fā)現(xiàn)間接調(diào)控該通路的小分子化合物也將成為研究的熱點(diǎn)，最近核小體抑制cGAS的機(jī)制[36-40]和環(huán)狀RNA抑制cGAS-STING信號(hào)通路[41]被相繼報(bào)道，鑒于此調(diào)節(jié)核小體和環(huán)狀RNA的小分子可能會(huì)成為調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路的候選藥物。

目前，在發(fā)現(xiàn)靶向cGAS-STING信號(hào)通路的藥物方面有著較大進(jìn)展，但是在對(duì)該通路的認(rèn)識(shí)和調(diào)控能力方面還處于初級(jí)階段，我們?nèi)悦媾R著許多的問題和挑戰(zhàn)。在微生物感染和自身免疫性疾病的背景下，細(xì)胞質(zhì)中的cGAS如何選擇性的感知危險(xiǎn)DNA，從而被有效激活的疑問仍然存在。cGAS活性的調(diào)控因子以及cGAMP是如何結(jié)合并誘導(dǎo)STING的激活，目前還沒有明確的線索。STING是如何轉(zhuǎn)運(yùn)和降解以及激活下游激酶和轉(zhuǎn)錄因子的機(jī)制，還需要更深入的研究。

我們期望在未來可以看到在針對(duì)性調(diào)節(jié)cGASSTING信號(hào)通路的激活等各個(gè)方面有突破性的進(jìn)展，并出現(xiàn)更多有效的藥物用于臨床治療。