miR-17-5p對小梁網(wǎng)細胞外基質(zhì)蛋白表達的調(diào)控作用及其機制△

夏侯梨 胡軍華 吳碧 廖瑩琳

原發(fā)性開角型青光眼(POAG)是一種由多種因素誘發(fā)的、伴隨進行性視力丟失和視野缺損的致盲眼病。眼內(nèi)房水排出受阻引發(fā)的眼壓升高是POAG發(fā)病的主要原因[1]。人眼中70%以上的房水引流是通過小梁網(wǎng)進行的，小梁網(wǎng)眼間隙自內(nèi)層葡萄膜小梁向外層臨管區(qū)逐漸變小，小梁網(wǎng)細胞(HTMCs)通過收縮改變網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)大小，進而調(diào)整房水排出速率[2-3]。細胞外基質(zhì)(ECM)是存在于細胞之間的動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要包括膠原、糖蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖糖苷等成分，組成細胞骨架結(jié)構(gòu)，參與細胞的遷移、增生、纖維化等生理過程[4-5]。正常生理條件下，小梁網(wǎng)中的ECM被不斷的分泌、降解，這一過程的動態(tài)平衡是維持房水引流途徑穩(wěn)態(tài)的重要條件。研究表明，小梁網(wǎng)組織間隙內(nèi)ECM的代謝異常，導(dǎo)致ECM異常聚集，是導(dǎo)致小梁網(wǎng)途徑房水排出受阻的主要原因[5-6]。miRNA是一類內(nèi)源性表達的非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，能通過與靶基因相互作用調(diào)節(jié)基因表達[7]。miR-17-5p是近年來研究較多的miRNA，有報道證實，miR-17-5p在氧化應(yīng)激條件下的人HTMCs中呈低表達[8]，同時，miR-17-5p在多種細胞纖維化過程中發(fā)揮調(diào)控作用[9-10]。然而其對HTMCs ECM蛋白表達的調(diào)控作用尚鮮有報道。本研究探討了miR-17-5p在POAG患者小梁網(wǎng)組織中的表達，同時探討了其對HTMCs的ECM蛋白表達的調(diào)控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本選擇2017年10月至2019年4月于新余市人民醫(yī)院眼科確診為POAG并行小梁切除術(shù)的患者15例15眼，其中男11例11眼、女4例4眼，年齡為24～63(32.31±8.24)歲，符合中華醫(yī)學(xué)會《我國原發(fā)性青光眼診斷和治療專家共識》中POAG診斷標(biāo)準(zhǔn)，所納入病例均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急、慢性閉角型青光眼患者；(2)虹膜睫狀體炎等其他眼部疾病所引起的眼壓升高者。所納入研究的患者行小梁切除術(shù)后將小梁網(wǎng)組織投入液氮中保存。正常小梁網(wǎng)組織供體選自江西省眼庫，共15例15眼，其中男10例10眼、女5例5眼，年齡23～59(31.05±10.54)歲，所納入供體者無眼部疾病史。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.2 細胞來源及主要試劑HTMCs購自中科院細胞庫。含胎牛血清(FBS)DMEM培養(yǎng)基(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；miR-17-5p mimics類似物(miR-17-5p mimics)和miR-17-5p陰性對照(miR-17-5p NC)序列由上海吉瑪基因公司合成；Lipofectamine 2000、實時熒光定量PCR試劑盒、抗Smad3抗體(ab2413)、抗纖連蛋白(FN)抗體(ab2413)、抗膠原蛋白I(CoL-I)抗體(ab34710)、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(ab11575)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)(美國Abcam公司)；Transwell小室試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Smad3過表達載體(pcDNA3.1-Smad3)、對照載體pcDNA(上海和元生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測正常小梁網(wǎng)和POAG患者小梁網(wǎng)組織中miR-17-5p表達分別取凍存的兩種小梁網(wǎng)組織，液氮中充分研磨，加入Trizol，振蕩混勻，提取總RNA，檢測RNA純度，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，其中miR-17-5p上游引物序列：5’-CGGCTTAGCTTCGATGGCTA-3’，下游引物序列：5’-CGGCTTAGCTTAGCTTCGAC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-ATTTCGATTCGGCTAGGCTA-3’，下游引物序列：5’-TGCTAGGCATTAGCTTAGCC-3’。反應(yīng)條件：50 ℃反應(yīng)2 min，94 ℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃變性10 s，共40個循環(huán)。使用Quantity One程序得到miR-17-5p表達的熒光強度(Ct值)，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.2 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)將凍存的HTMCs復(fù)蘇重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細胞融合至80%左右時，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，4 ℃下以3000 r·min-1離心5 min，棄上層培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，接種于新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細胞分組與轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h將待轉(zhuǎn)染HTMCs轉(zhuǎn)移至6孔板中，調(diào)整細胞密度為500×103個·mL-1，待細胞融合至80%以上時，按照Lipofectamine 2000說明書中所示步驟，將miR-17-5p mimics、miR-17-5p-NC和Lipofectamine 2000分別用DMEM培養(yǎng)液稀釋，室溫孵育5 min，將miR-17-5p mimics、miR-17-5p-NC稀釋液分別與Lipofectamine 2000混合室溫下放置15 min，將上述混合液分別加入miR-17-5p mimics組和miR-17-5p-NC組細胞培養(yǎng)液內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以供后續(xù)實驗使用。

1.2.4 Western blot檢測小梁網(wǎng)組織中Smad3蛋白及各轉(zhuǎn)染組HTMC中ECM相關(guān)蛋白的表達將轉(zhuǎn)染后HTMCs繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，加入相應(yīng)一抗Smad3(11000)、FN(11000)、CoL-I(11000)、α-SMA(1500)、GAPDH(12000)，4 ℃封閉過夜，加入二抗(12000)，室溫封閉1 h，加入ECL曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件分析各種蛋白條帶灰度值。

取凍存的小梁網(wǎng)組織，RIPA裂解液提取總蛋白，以上述方法檢測Smad3(11000)蛋白表達。

1.2.5 miR-17-5p靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因分析采用靶基因數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRanda預(yù)測miR-17-5p下游靶基因為Smad3，將Smad3與miR-17-5p結(jié)合互補區(qū)突變并構(gòu)建熒光素酶報告載體，將野生型Smad3(Smad3-3’-UTR-WT)和突變型Smad3(Smad3-3’-UTR-MT)分別與miR-17-5p mimics/NC共轉(zhuǎn)染至HTMCs，培養(yǎng)24 h后依據(jù)熒光素酶檢測試劑盒檢測Smad3熒光素酶活性變化。每組實驗獨立重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 Smad3轉(zhuǎn)染與否對HTMCs中FN、CoL-I、α-SMA和Smad3蛋白表達的影響將對數(shù)期HTMCs接種至6孔板，調(diào)整細胞密度為500×103個·mL-1，將miR-17-5p mimics+pcDNA3.1-Smad3、miR-17-5p mimics+pcDNA，分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至HTMCs作為miR-17-5p +Smad3組和miR-17-5p +vector組，轉(zhuǎn)染24 h后Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組細胞中FN(11000)、CoL-I(11000)、α-SMA(1500)和Smad3(11000)蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 正常和POAG患者小梁網(wǎng)組織中miR-17-5p表達比較正常小梁網(wǎng)組織中miR-17-5p相對表達量為1.16±0.11，POAG患者小梁網(wǎng)組織中miR-17-5p相對表達量為0.19±0.05，顯著低于正常小梁網(wǎng)組織，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.641,P<0.001)；正常小梁網(wǎng)組織中Smad3蛋白相對表達量為0.34±0.08，POAG患者小梁網(wǎng)組織中Smad3蛋白相對表達量為0.87±0.10，顯著低于正常小梁網(wǎng)組織，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.105,P<0.001；見圖1)。

圖1 正常和POAG患者的小梁網(wǎng)組織中miR-17-5p和Smad 3表達 A：RT-PCR檢測的小梁網(wǎng)組織中miR-17-5p表達；B：Western blot檢測的小梁網(wǎng)組織中Smad 3蛋白表達。1：正常小梁網(wǎng)組織；2：POAG患者小梁網(wǎng)組織。

2.2 miR-17-5p NC組和miR-17-5p mimics組HTMCs 中FN、CoL-I和α-SMA蛋白表達miR-17-5p mimics組HTMCs中FN、CoL-I和α-SMA蛋白表達均低于miR-17-5p NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(tFN=10.244、tCoL-I=6.546、tα-SMA=5.228,均為P<0.001；見圖2、表1)。

表1 miR-17-5p NC組和miR-17-5p mimics組HTMCs中FN、CoL-I和α-SMA的蛋白相對表達量

圖2 Western blot檢測兩組HTMCs中FN、CoL-I和α-SMA蛋白表達 1：miR-17-5p mimics組；2：miR-17-5p NC組

2.3 miR-17-5p靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因分析miR-17-5p通過靶向識別3’-UTR抑制Smad3的表達雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生載體后，miR-17-5p NC組熒光素酶活性為1.77±0.10，miR-17-5p mimics組熒光素酶活性為0.87±0.08，顯著低于miR-17-5p NC組(t=8.024,P<0.001)；轉(zhuǎn)染突變載體的miR-17-5p NC組熒光素酶活性為1.38±0.06，miR-17-5p mimics組熒光素酶活性為1.41±0.05，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.514,P=0.597)(圖3A)；miR-17-5p mimics組HTMCs中Smad3蛋白表達為0.10±0.03，miR-17-5p NC組Smad3蛋白表達為0.85±0.06，顯著高于miR-17-5p mimics組(t=13.260,P<0.001；見圖3B)。

圖3 miR-17-5p靶基因預(yù)測及兩組中Smad 3蛋白表達 A：生物信息軟件檢測miR-17-5p和Smad3潛在結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-17-5p和Smad3的靶向關(guān)系；B：兩組中Smad 3表達比較。1：miR-17-5p mimics組；2：miR-17-5p NC組。

2.4 Smad3轉(zhuǎn)染與否對HTMCs中Smad3、FN、CoL-I和α-SMA蛋白表達的影響miR-17-5p+Smad3轉(zhuǎn)染組HTMCs中Smad3、FN、CoL-I和α-SMA蛋白表達均高于miR-17-5p+vector轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(tSmad3=6.200,P<0.001;tFN=6.347,P<0.001;tCoL-I=5.201,P<0.001;tα-SMA=7.355,P<0.001；見表2，圖4)。

表2 Smad3轉(zhuǎn)染與否對HTMCs中FN、CoL-I、α-SMA和Smad3蛋白表達的影響

圖4 Western blot檢測Smad3轉(zhuǎn)染與否對兩轉(zhuǎn)染組HTMCs中FN、CoL-I、α-SMA和Smad3蛋白表達的影響 1：miR-17-5p+vector轉(zhuǎn)染組；2：miR-17-5p+Smad3轉(zhuǎn)染組。

3 討論

眼壓升高被認為是POAG的主要致病因素，這主要取決于房水排出與流入之間的平衡。小梁網(wǎng)是位于眼前節(jié)的一個組織結(jié)構(gòu)，在平衡房水流入排出過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。研究表明，ECM蛋白的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和代謝平衡是保證房水自小梁網(wǎng)流入排出平衡的重要因素，ECM在小梁網(wǎng)部位的過分沉積會造成房水流出阻力增加[11]。正常生理條件下，HTMCs會分泌多種ECM蛋白，包括I～VI型膠原蛋白(Collagen I～VI)，非膠原蛋白成分如FN、α-SMA等。研究發(fā)現(xiàn)，POAG患眼中小梁網(wǎng)的ECM蛋白如FN、CoL-I、CoL-IV、α-SMA等表達增加[12]。POAG患眼中，ECM在小梁網(wǎng)處的積聚沉淀能造成組織纖維化，這樣的纖維化過程在POAG的病程進展中發(fā)揮重要作用[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在HTMCs的ECM調(diào)控中發(fā)揮作用：Shen等[14]報道，Ln-RP11-820通過miR-3178調(diào)控HTMCs的ECM產(chǎn)生；黨曉潔等[15]證實氧化應(yīng)激條件下miR-21可增加HTMCs胞外基質(zhì)產(chǎn)物。miR-17-5p屬于miR-17-92基因簇，有研究證實，在體外青光眼HTMCs模型中，miR-17-5p呈低表達，靶向PTEN調(diào)控HTMCs的增殖和凋亡[8]。同時有研究顯示，miR-17-5p對細胞的纖維化或間質(zhì)化有調(diào)控作用：Wang等[16]報道m(xù)iR-17-5p在乳腺癌細胞中能靶向netrin4促進細胞的間質(zhì)化，增加細胞的遷移和侵襲活性；Yu等[17]研究證實，miR-17-5p通過靶向WIF1而激活Wnt/β-Catenin信號通路，上調(diào)α-SMA、CoL-I蛋白表達，促進肝纖維化?；谝陨侠碚?，本研究探討了miR-17-5p在HTMCs的ECM蛋白表達中能否發(fā)揮調(diào)控作用。實驗結(jié)果顯示，miR-17-5p在POAG小梁網(wǎng)組織中的表達低于正常小梁網(wǎng)組織，這一結(jié)果與Wang等[8]的結(jié)果一致，在轉(zhuǎn)染了miR-17-5p mimics的HTMCs中，ECM相關(guān)蛋白如FN、CoL-I、α-SMA等的表達低于轉(zhuǎn)染miR-17-5p NC的細胞，提示miR-17-5p能抑制HTMCs中ECM相關(guān)蛋白表達。

TGF-β/Smad信號通路在多種細胞的ECM產(chǎn)生及纖維化過程中發(fā)揮重要作用，在小梁網(wǎng)的ECM產(chǎn)生過程中也有重要作用。在POGA患者房水和小梁中發(fā)現(xiàn)TGF-β2異常高表達，使房水外流受阻，并促進ECM產(chǎn)生[18]。TGF-β在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號主要依賴Smad系統(tǒng)，Smad蛋白是TGF-β下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，根據(jù)功能不同分為受體調(diào)節(jié)型(R-Smad：Smad1、2、3、5、8)、共同型(Co-Smad：Smad3)和抑制型(I-Smad：Smad6、7)，在整個通路中，配體與受體結(jié)合，誘導(dǎo)TGF-β受體激活，并使R-Smad磷酸化，繼而與Co-Smad形成異構(gòu)復(fù)合物，激活ECM蛋白，誘導(dǎo)細胞纖維化[19-20]。Smad3作為核心組分,其磷酸化水平直接反映了TGF-β通路的活性。Lu等[21]報道在肝癌細胞中miR-17能靶向抑制Smad3的表達。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smad3在POAG小梁網(wǎng)組織中的表達高于正常小梁網(wǎng)組織，miR-17-5p mimics組HTMCs中Smad3蛋白相對表達量低于miR-17-5 PNC組，這一結(jié)果與Lu等[21]結(jié)果一致。在HTMCs中，Smad3是miR-17-5p的下游靶基因，能負向調(diào)控Smad3的表達，抑制ECM蛋白表達。同時，當(dāng)Smad3過表達可以減輕miR-17-5p對ECM蛋白的抑制作用。

綜上所述，miR-17-5p 能抑制HTMCs的ECM蛋白表達，這一過程可能是通過靶向抑制Smad3表達而實現(xiàn)的。