生存素(Survivin)抑制劑YM155對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞活力和遷徙能力的影響△

楊旭 李騰 王彤 陳曉冬

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)常發(fā)生于孔源性視網(wǎng)膜脫離術(shù)后以及陳舊性視網(wǎng)膜脫離和眼外傷的患者，是一種嚴(yán)重的致盲性眼病。研究顯示，視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞異常增殖和遷徙是PVR發(fā)生的重要原因[1]，因此抑制RPE細(xì)胞異常增殖和遷徙可能是防治PVR的重要方法。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，通過影響表皮生長因子受體(EGFR)及其下游信號(hào)通路蛋白表達(dá)，可以抑制RPE細(xì)胞活力，降低細(xì)胞增殖和遷徙能力[2-4]。YM155是一種特異性生存素(Survivin)抑制劑，它能特異性抑制Survivin基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞增殖和生長[5-6]。YM155可以抑制RPE細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7],通過下調(diào)Survivin表達(dá)抑制RPE細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，這可能對PVR的發(fā)生與發(fā)展有一定的防治作用[8]。迄今為止，YM155對于RPE細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究使用不同濃度的YM155處理ARPE-19細(xì)胞，觀察YM155對RPE細(xì)胞活力和遷徙能力的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器ARPE-19細(xì)胞(美國ATCC公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，生存素抑制劑YM155(美國Selleck公司)；噻唑藍(lán)(MTT)和DAPI(美國Sigma公司)，EGFR抗體、AKT抗體、Survivin抗體、β-actin抗體、鬼筆環(huán)肽熒光染料、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國CST公司)。倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)，多功能酶標(biāo)儀(德國BMG公司)，電泳儀(美國BioRad公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理取生長狀態(tài)良好的ARPE-19細(xì)胞放入含體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基于37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。制備ARPE-19單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分組。將ARPE-19細(xì)胞分為對照組(不作任何處理)，10 nmol·L-1、20 nmol·L-1、50 nmol·L-1YM155組(用相應(yīng)濃度YM155處理細(xì)胞)，采用MTT檢測各組細(xì)胞活力，采用Western blot檢測各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況；采用細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測對照組和20 nmol·L YM155組細(xì)胞遷徙和EGFR表達(dá)情況。處理時(shí)間均為24 h。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞活力ARPE-19細(xì)胞以每孔10×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，參考文獻(xiàn)[8]的研究方法給予細(xì)胞10 nmol·L-1、20 nmol·L-1、50 nmol·L-1YM155處理24 h，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，在含0.05 mg·L-1MTT的DMEM/F12培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h，每孔加0.15 mL二甲基亞砜，使用水平搖床在室溫下振蕩10 min，溶解細(xì)胞內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶。最后使用酶標(biāo)儀測定570 nm處的光密度(D)值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對細(xì)胞活力。

1.2.3 細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)ARPE-19細(xì)胞以每孔100×103個(gè)接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24～48 h至細(xì)胞融合，用10 μL移液器吸頭劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用倒置相差顯微鏡觀察，測量細(xì)胞遷徙的相對距離。

1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)使用10 nmol·L-1、20 nmol·L-1、50 nmol·L-1的YM155處理ARPE-19細(xì)胞24 h，PBS洗2次，裂解細(xì)胞提取蛋白；于100 ℃加熱10 min，離心取上清，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白，然后使用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g·L-1脫脂奶粉的PBST封閉PVDF膜2 h；分別加EGFR、AKT、Survivin、β-actin一抗，稀釋比均為11000，4 ℃孵育過夜，用PBST緩沖液洗膜3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1～2 h；再用PBST緩沖液洗膜3次后加用ECL發(fā)光液使PVDF膜顯色，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)將PVDF膜曝光顯影，采集圖像，進(jìn)行分析。

1.2.5 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)將ARPE-19細(xì)胞接種在12孔板中的細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞全部貼壁，用20 nmol·L-1YM155處理細(xì)胞24 h后移去培養(yǎng)基，PBS 洗3次，使用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min，PBS 洗3次；使用含體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton-100的PBST孵育3 min，用含體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白的PBST封閉非特異性抗體1 h，然后使用EGFR抗體(1100)孵育2 h，PBS洗3次，按11000稀釋熒光二抗和Phalloidin熒光染料，室溫孵育1 h，PBS洗3次。使用含DAPI抗熒光封片劑封片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量指標(biāo)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 YM155對ARPE-19細(xì)胞形態(tài)和活力的影響倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組ARPE-19細(xì)胞呈多邊形，采用10 nmol·L-1和20 nmol·L-1YM155處理ARPE-19細(xì)胞24 h對細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，50 nmol·L-1YM155會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞間隙擴(kuò)大(見圖1A)。MTT檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，10 nmol·L-1、20 nmol·L-1和50 nmol·L-1YM155組處理細(xì)胞24 h后ARPE-19細(xì)胞的相對細(xì)胞活力平均降低約42.3%、55.6%、73.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖1B)。

圖1 YM155對ARPE-19細(xì)胞形態(tài)和活力的影響 A：各組細(xì)胞形態(tài)變化；B：各組相對細(xì)胞活力,與對照組相比，**P<0.01。圖中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別指10 nmol·L-1、20 nmol·L-1、50 nmol·L-1YM155組。

2.2 YM155對ARPE-19細(xì)胞遷徙能力的影響倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，使用20 nmol·L-1YM155處理ARPE-19細(xì)胞24 h會(huì)降低細(xì)胞遷徙能力。細(xì)胞遷徙距離的量化分析結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞24 h遷徙距離為劃痕的24%；20 nmol·L-1YM155組遷徙距離為劃痕的5%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖2)。

圖2 YM155對ARPE-19細(xì)胞遷徙能力的影響 A：兩組ARPE-19細(xì)胞遷徙情況；B：兩組細(xì)胞遷徙距離量化比較，與對照組相比，**P<0.01。圖中Ⅱ組指20 nmol·L-1 YM155組。

2.3 YM155對ARPE-19細(xì)胞EGFR、AKT和Survivin蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，YM155處理細(xì)胞24 h后，10 nmol·L-1YM155組細(xì)胞EGFR和AKT蛋白表達(dá)與對照組相比無明顯差異(均為P>0.05)，但Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；20 nmol·L-1YM155組細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)與對照組相比亦無明顯差異(P>0.05)，EGFR和Survivin蛋白表達(dá)均下調(diào)(均為P<0.05)；50 nmol·L-1YM155組細(xì)胞EGFR、AKT和Survivin三種蛋白表達(dá)均下調(diào)，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖3)。

圖3 YM155處理細(xì)胞24 h后各組細(xì)胞EGFR、AKT、Survivin蛋白表達(dá)情況 A：Western blot檢測各種蛋白表達(dá)結(jié)果，β-actin為內(nèi)參對照；B、C、D：量化分析各種蛋白表達(dá)的變化。與對照組比較，*P<0.05、**P<0.01。圖中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組分別指10 nmol·L-1、20 nmol·L-1、50 nmol·L-1 YM155組。

免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組ARPE-19細(xì)胞EGFR均勻表達(dá)于細(xì)胞膜,20 nmol·L-1YM155組表達(dá)于細(xì)胞膜的EGFR被內(nèi)吞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞核周圍呈顆粒狀分布；YM155可以誘導(dǎo)細(xì)胞骨架損傷、F-肌動(dòng)蛋白纖維排列紊亂、細(xì)胞核增大(見圖4)。

圖4 對照組與20 nmol·L-1 YM155組免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色中EGFR顯示為綠色，Phalloidin顯示為紅色，DAPI顯示為藍(lán)色。圖中Ⅱ組指20 nmol·L-1 YM155組。

3 討論

視網(wǎng)膜的外屏障由RPE細(xì)胞緊密連接構(gòu)成，具有重要的解剖和生理作用。當(dāng)眼內(nèi)環(huán)境發(fā)生異常改變時(shí)，RPE細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖和遷徙，成為PVR發(fā)生和發(fā)展的重要因素[9-10]。當(dāng)傳遞細(xì)胞間信號(hào)功能的細(xì)胞因子異常表達(dá)時(shí)，可引起細(xì)胞遷徙、增殖和分化，促進(jìn)PVR的發(fā)展[11]。研究報(bào)道，EGF可以誘導(dǎo)RPE細(xì)胞增殖[12]，并且通過EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)RPE細(xì)胞遷徙[13]，在視網(wǎng)膜前膜表達(dá)的EGFR可能對PVR的發(fā)生和發(fā)展有促進(jìn)作用[14-15]。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，EGF能增加RPE細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷徙，并誘導(dǎo)EGFR 和 AKT 蛋白磷酸化[16]。這些結(jié)果提示EGFR和AKT蛋白對RPE細(xì)胞異常增殖和遷徙有重要作用，可能是防治PVR發(fā)生的重要靶點(diǎn)。

Survivin蛋白屬于凋亡抑制蛋白家族，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、阻斷細(xì)胞凋亡[17]。YM155作為一種特異性Survivin抑制劑，具有抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)自噬和凋亡等作用[18-19]。Jane等[20]研究發(fā)現(xiàn)，YM155可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體功能障礙，引起細(xì)胞自噬、DNA損傷以及細(xì)胞凋亡。Ferrario等[7]研究報(bào)道，2 nmol·L-1YM155可以抑制RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力，誘導(dǎo)少量細(xì)胞凋亡。Zhang等[8]研究顯示，下調(diào)Survivin表達(dá)或使用YM155可影響轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路，抑制RPE細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，會(huì)對PVR進(jìn)展有一定的防治作用。在本研究中，我們觀察了不同濃度YM155對RPE細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，YM155可以顯著抑制RPE細(xì)胞活力和遷徙能力，下調(diào)Survivin、EGFR和AKT蛋白的表達(dá)，同時(shí)引起EGFR內(nèi)吞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。有學(xué)者報(bào)道YM155能抑制EGFR表達(dá)，誘導(dǎo)EGFR由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[21]，YM155也能增加腫瘤細(xì)胞對EGFR酪氨酸激酶抑制的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[22]。本研究結(jié)果顯示，10 nmol·L-1、20 nmol·L-1、50 nmol·L-1的YM155均能引起Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)，但10 nmol·L-1的YM155不影響EGFR蛋白的表達(dá)，10 nmol·L-1和20 nmol·L-1的YM155不影響AKT蛋白的表達(dá)，只有YM155濃度增加到50 nmol·L-1才會(huì)引起EGFR和AKT的蛋白表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果與國外學(xué)者的研究結(jié)果相似[21]。

綜上所述，YM155對RPE細(xì)胞活力和遷徙能力的影響與Survivin、EGFR和AKT蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)，這對PVR的發(fā)生和發(fā)展能產(chǎn)生一定的抑制作用。