PD-1信號通路和CTLA-4在眼科領(lǐng)域的研究進展△

孟倩麗 呂正

2018年度諾貝爾生理學(xué)獎授予詹姆斯·艾利森教授和本庶佑教授，以表彰他們在腫瘤免疫治療方面的貢獻(xiàn)[1]。其中詹姆斯·艾利森教授最早在小鼠實驗中證明了應(yīng)用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4,CTLA-4)抗體可以促使T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞而控制腫瘤患者病情的進展，并率先提出了免疫檢查點的概念；本庶佑教授則首次發(fā)現(xiàn)了程序性死亡分子-1(programmed cell death protein-1,PD-1)基因，并致力于PD-1抗體的研發(fā)和臨床應(yīng)用。目前免疫治療藥物，特別是針對PD-1 和CTLA-4的免疫治療藥物已成為生物制藥和腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。有關(guān)PD-1信號通路和CTLA-4在眼科領(lǐng)域的研究在近10余年中也取得了較大進展。本文主要就PD-1信號通路和CTLA-4在眼生理病理方面的研究進展以及臨床應(yīng)用此類免疫抑制劑后出現(xiàn)的眼部相關(guān)不良反應(yīng)進行匯總、分析和述評。

1 PD-1/PD-Ls和CTLA-4的分子結(jié)構(gòu)和主要功能

人PD-1(CD279)基因位于染色體2q37，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，相對分子質(zhì)量為55 000，主要表達(dá)于B細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面，其功能包括抑制活化T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制B細(xì)胞的功能，以及參與免疫耐受。與CTLA-4主要對已活化的T細(xì)胞產(chǎn)生抑制信號不同，PD-1與其配體結(jié)合后，可以抑制CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并可能導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡[2]。PD-1的配體為B7H1/PD-L1(CD274)和B7DC/PD-L2(CD273)，兩者均屬于B7 / CD28超家族[3]。人PD-L1基因位于染色體9p24，相對分子質(zhì)量為33 000。其主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、非淋巴組織和某些腫瘤中，主要功能包括結(jié)合受體PD-1、抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。人PD-L2基因同樣位于染色體9q24，相對分子質(zhì)量為31 000。PD-L2的表達(dá)較PD-L1局限，主要表達(dá)于活化的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，主要功能包括與受體PD-1相結(jié)合、抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。

CTLA-4(CD152)基因位于染色體2q31-2q33，是T細(xì)胞上的一種跨膜受體，主要表達(dá)于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。CTLA-4在結(jié)構(gòu)上和CD28分子高度同源，二者均可與位于抗原提呈細(xì)胞上的配體CD80(B7-1)和CD86(B7-2)相結(jié)合。在抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化中，CD80和CD28結(jié)合，為T細(xì)胞提供重要的協(xié)同刺激信號[4-5]。若活化的T細(xì)胞表達(dá)CTLA-4，由于其與CD80/CD86的親和力顯著高于CD28，所以CTLA-4可競爭性地與CD80/CD86結(jié)合，對已活化T細(xì)胞產(chǎn)生抑制信號。CTLA-4和CD28之間的平衡關(guān)系既允許機體適當(dāng)激活T細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時又可以防止過度的自身免疫反應(yīng)[6]。

2 PD-1和CTLA-4參與眼生理病理過程的發(fā)生發(fā)展

2.1 眼免疫赦免前房相關(guān)免疫偏離(anterior chamber-associated immune deviation,ACAID)是指將抗原引入前房后誘發(fā)出的一種全身性免疫偏離現(xiàn)象,即抗原物質(zhì)進入前房后可誘導(dǎo)特異性非補體結(jié)合抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的前體細(xì)胞，但缺失了介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的T細(xì)胞和能分泌補體結(jié)合所需抗體的B細(xì)胞。眼組織結(jié)構(gòu)正常及眼免疫微環(huán)境平衡是ACAID的前提。對ACAID細(xì)胞和分子機制的深入探討將對防治自身免疫性眼病及抑制組織排斥具有重要意義。角膜處于相對“赦免狀態(tài)”，與其他器官相比其移植成功率更高[7]。有研究證明，角膜內(nèi)皮細(xì)胞可通過PD-1/PD-L1相互作用來抑制Th1細(xì)胞的效應(yīng)功能和活化，從而達(dá)到眼前房的免疫赦免狀態(tài)[8]。我們早期研究發(fā)現(xiàn)，CD4+PD-1+T細(xì)胞作為一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞參與ACAID的形成[9]。之后有研究發(fā)現(xiàn),CD4+CD25+FoxP3+T細(xì)胞高表達(dá)CTLA-4和LAG-3，在誘導(dǎo)ACAID中具有重要作用[10]。由此可見，CTLA-4+和PD-1+細(xì)胞可能作為一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的亞群參與眼免疫赦免的形成機制。

盡管虹膜色素上皮(IPE)誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)多種共刺激分子，但研究證明，IPE細(xì)胞和自身應(yīng)答性T細(xì)胞均必須表達(dá)內(nèi)源性合成的B7-1和B7-2分子，同時T細(xì)胞也必須表達(dá)CTLA-4，IPE細(xì)胞才能通過細(xì)胞直接接觸的方式將CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[11]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，CD8+IPE誘導(dǎo)的Tregs可顯著抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化，例如T細(xì)胞的增殖和Th1、Th2和Th17細(xì)胞因子的產(chǎn)生。雖然IPE誘導(dǎo)的Tregs表達(dá)多種共刺激分子，但在Tregs上僅PD-L1可通過T細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相互作用被傳遞到目標(biāo)Th1細(xì)胞。當(dāng)PD-L1的中和抗體與IPE誘導(dǎo)的Tregs共培養(yǎng)時，Th1抑制即被破壞；而敲除PD-1后同樣會破壞Tregs對IFN-γ生成的抑制作用。因此可見，暴露于IPE的T細(xì)胞可獲得完全的調(diào)節(jié)能力，通過PD-1/PD-L1負(fù)性共刺激信號抑制Th1效應(yīng)細(xì)胞[12]。PD-1/PD-L1對抑制虹膜的免疫炎癥性疾病可能具有積極調(diào)控作用。

視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)層位于脈絡(luò)膜血液供應(yīng)和神經(jīng)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層之間，在眼后節(jié)的免疫赦免中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜MHC Ⅱ 類和PD-L1的表達(dá)上調(diào)可使視網(wǎng)膜保護自身免受CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷，并且二者的表達(dá)與IFN-γ密切相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RPE細(xì)胞暴露于炎癥細(xì)胞因子中時，可升高PD-L1的表達(dá)水平，進而誘導(dǎo)具有調(diào)節(jié)活性的葡萄膜源性T細(xì)胞浸潤，從而促進T細(xì)胞介導(dǎo)的眼內(nèi)炎癥的自然消退[14]。此外，RPE細(xì)胞表達(dá)PD-L1可通過負(fù)性共刺激作用抑制PD-1+的Th22細(xì)胞的產(chǎn)生[15]。上述這些研究結(jié)果均證明了CTLA-4和PD-1/PD-L1通路在眼免疫赦免機制形成中的重要作用。

2.2 自身免疫性眼病自身免疫性葡萄膜炎是最具代表性的自身免疫性眼部疾病，多與眼組織抗原被免疫系統(tǒng)識別后產(chǎn)生的自身免疫應(yīng)答有關(guān)。Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子常引起葡萄膜的炎癥反應(yīng)，而Tregs的數(shù)量降低或功能紊亂不能有效抑制免疫反應(yīng)也是其重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，黑素皮質(zhì)素5受體(MC5r)和腺苷2A受體(A2Ar)是誘導(dǎo)實驗性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(EAU)后Tregs的必要條件，而阻斷PD-1/PD-L1通路減弱了EAU后Tregs對EAU的抑制作用。葡萄膜炎患者中由A2Ar誘導(dǎo)的PD-1+FoxP3+Tregs與健康對照組相似，但在MC5r刺激下PD-1+FoxP3+Tregs數(shù)量明顯降低[16]。我們曾經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1和PD-L2在活動性非感染性葡萄膜炎患者外周血中的表達(dá)降低[17]。這些研究結(jié)果提示，PD-1/PD-Ls通路可能通過調(diào)控Tregs參與自身免疫性葡萄膜炎。有報道顯示，缺乏CLTA-4的患者出現(xiàn)自身免疫性脈絡(luò)膜炎，使用CTLA-4類似物后癥狀緩解[18]。提示CTLA-4可能也參與自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機制。

Vogt-小柳原田病綜合征(VKH綜合征)和Behcet病是我國最常見的兩種全葡萄膜炎。除自身免疫應(yīng)答導(dǎo)致炎癥通路激活和固有免疫應(yīng)答異常引發(fā)疾病外，遺傳因素在這兩類疾病發(fā)生中也起著一定作用。VKH綜合征是以雙側(cè)肉芽腫性全葡萄膜炎為特征的疾病，常伴有腦膜刺激征、聽力障礙、白癜風(fēng)、毛發(fā)變白或脫落等眼外改變。研究已證明，HLA基因和一些非HLA基因(如IL23R-C1orf141、ADO-ZNF365-EGR2)在亞洲人群中與VKH綜合征的發(fā)生密切相關(guān)[19-21]。我們曾研究發(fā)現(xiàn)，PD-1.3(rs11568821)和PD-1.6(rs10204525)的多態(tài)性與中國漢族人對VKH綜合征的易感性無關(guān)，但PD-1.5(rs2227981)可能與VKH綜合征的眼外改變呈負(fù)相關(guān)性[22]。

Behcet病是一種以復(fù)發(fā)性葡萄膜炎、口腔潰瘍、皮膚損害和生殖器潰瘍?yōu)樘卣鞯淖陨硌装Y性疾病。雖然HLA-B51與該病發(fā)生的相關(guān)性已得到廣泛證實，但其所占Behcet病的整體遺傳易感性不足20%[23]。有研究分析了CTLA-4基因的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)(21661A/G、2318C/T、+49G/A和CT60G/A)與國人(漢族)Behcet病發(fā)生的相關(guān)性，但結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)CTLA-4基因多態(tài)性與Behcet病相關(guān)[24]。提示中國漢族人CTLA-4和PD-1基因的多態(tài)性可能與VKH綜合征和Behcet病的發(fā)生無直接或密切相關(guān)性。

干眼又稱角結(jié)膜干燥癥。免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致角膜和結(jié)膜微環(huán)境失衡可加快干眼進程。干眼炎癥/免疫反應(yīng)的核心是眼表上皮細(xì)胞與骨髓免疫細(xì)胞之間的動態(tài)相互作用。眼表上皮細(xì)胞不但在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵的啟動作用，同時也是活化T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的作用靶點[25]。角膜上皮細(xì)胞構(gòu)成性表達(dá)高水平的PD-L1，其能夠直接抑制局部T細(xì)胞反應(yīng)，有助于維持角膜的免疫赦免狀態(tài)[26],并負(fù)性調(diào)節(jié)角膜中趨化因子的表達(dá)[27]。干眼早期角膜上皮細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致趨化因子配體和受體的表達(dá)升高，促進CD4+T細(xì)胞在眼表的浸潤增強，最終加重干眼相關(guān)角膜炎癥和上皮病變[27]。除了免疫炎癥反應(yīng)之外，細(xì)胞凋亡、性激素水平降低等也是干眼發(fā)生發(fā)展的重要因素。深入探討各種因素的作用機制以及其相互關(guān)系，將有助于全面了解干眼的發(fā)病機制，為臨床診療提供理論依據(jù)和作用靶點。

2.3 眼部惡性腫瘤葡萄膜黑色素瘤(UM)雖較為罕見，但惡性程度較高，預(yù)后較差。UM內(nèi)PD-1的高表達(dá)與患者生存不良有關(guān)，PD-1表達(dá)和視神經(jīng)侵犯是該病獨立的預(yù)后危險因素。UM細(xì)胞系中過表達(dá)PD-1可促進腫瘤細(xì)胞的增殖，而敲除PD-1后則抑制了細(xì)胞的增殖能力[28]。Yang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在UM的局部微環(huán)境中IFN-γ的存在可以促進PD-L1的表達(dá)上調(diào)，而PD-L1可能通過抑制IL-2的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，從而促進腫瘤免疫逃逸。這些研究結(jié)果提示，選擇性阻斷PD-1/PD-L1可能是一種潛在的治療UM的T細(xì)胞免疫治療策略。

UM易發(fā)生血源性播散，進展為轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤(MUM)。研究證明，單一使用PD-1或PD-L1抗體治療MUM效果欠佳[30]，突變負(fù)荷低、T細(xì)胞浸潤少、MYC基因過度表達(dá)以及PD-L1低表達(dá)可能是限制治療反應(yīng)的因素[31-32]。聯(lián)合使用抗CTLA-4及抗PD-1治療可能會是MUM患者的有效治療方案[33-34]。通過血液標(biāo)記物可預(yù)測接受免疫檢查點阻斷治療的MUM患者的存活率。正常的血清乳酸脫氫酶和C反應(yīng)蛋白水平以及高的相對嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)有助于確定預(yù)后較好的患者[35]。UM中已獲批的免疫療法的局限性主要體現(xiàn)在基于組織學(xué)和起源部位的傳統(tǒng)腫瘤分類系統(tǒng)上。超越這些限制的關(guān)鍵可能在于更深入地理解腫瘤細(xì)胞突變機制、微環(huán)境和與每種腫瘤類型相關(guān)的免疫原性的作用，以及推進更多的生物標(biāo)記物研究[36]。

結(jié)膜黑色素瘤(CM)及結(jié)膜鱗狀細(xì)胞癌(SCC)均屬于原發(fā)性結(jié)膜惡性腫瘤。目前已證明，雖然大多數(shù)CM細(xì)胞系不表達(dá)PD-L1，但I(xiàn)NF-γ刺激可促使其表達(dá)上調(diào)[37]；而有近半數(shù)的SCC表達(dá)PD-L1[38]。這些研究結(jié)果提示，阻斷PD-1/PD-L1信號通路可能成為CM和SCC的治療方法。

2.4 代謝病相關(guān)眼病糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一。其中視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞(RPCs)的丟失是早期DR的重要標(biāo)志之一[39-40]。研究發(fā)現(xiàn)，RPCs可通過PD-L1和IL-10的介導(dǎo)抑制早期DR中活化T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，而高糖可顯著損害RPCs的T細(xì)胞抑制活性，從而導(dǎo)致DR的發(fā)生[41]。在嚴(yán)重的增生型DR中，PD-1可通過介導(dǎo)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與疾病的進展[42]。由此推測，PD-1/PD-L1信號通路可能參與DR的發(fā)生發(fā)展。

甲狀腺相關(guān)性眼病(TAO)是一種自身免疫性疾病。有研究發(fā)現(xiàn)TAO患者PD-1陽性的CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的頻率、絕對計數(shù)均明顯高于健康對照者，提示PD-1可能參與TAO的發(fā)病機制[43]。而基因多態(tài)性的研究卻沒有得出非常明確的結(jié)論。針對英國高加索人群的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1基因(PDCD1)+2375 SNP 可能與TAO的發(fā)生有關(guān)，+6799 SNP 基因型可能具有較弱的保護作用[44]。在中國臺灣省開展的TAO與CTLA-4的SNP相關(guān)性研究提示，CTLA-4的rs733618和rs16840252可能是具有種族特異性的TAO潛在的標(biāo)記[45]。但對中國香港地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然CTLA-4上3個SNP和AT的重復(fù)長度可能與兒童Graves病易感性相關(guān)，但與TAO的發(fā)生無相關(guān)性[46]。因此，PD-1和CTLA-4在TAO中作用及其機制仍需更多的研究和數(shù)據(jù)進行探討和支持。

3 應(yīng)用CTLA-4及PD-1/PD-L1抑制劑治療后出現(xiàn)的眼部相關(guān)不良反應(yīng)

免疫檢查點抑制劑(ICIs)的應(yīng)用是近10年來腫瘤治療中最重要的進展之一，但其在使用過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)卻不容忽視。接受ICIs治療的患者會發(fā)生許多免疫相關(guān)不良事件，其中與眼部相關(guān)的免疫不良事件較為罕見，所報道的眼部免疫不良事件發(fā)生率占總免疫不良事件發(fā)生率不足1%[47]。目前美國藥品與食品管理局批準(zhǔn)的ICIs共7種，其中包括CTLA-4抑制劑Ipilimumab，PD-1抑制劑Pembrolizumab、Nivolumab、Cymplimab和PD-L1抑制劑Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab。應(yīng)用CTLA-4抑制劑Ipilimumab后，相關(guān)眼部不良事件主要有脈絡(luò)膜新生血管膜、結(jié)膜炎、葡萄膜炎[48-49]。其次是PD-1抑制劑Pembrolizumab，相關(guān)眼部不良事件主要有累及瞳孔的動眼神經(jīng)麻痹、干眼、葡萄膜炎[50]。有研究報道約10.3%的患者在使用Ipilimumab治療后出現(xiàn)眼部相關(guān)免疫不良事件，其中 4.3% 為葡萄膜炎，而使用Pembrolizumab治療后葡萄膜炎發(fā)生率為1.0%～1.5%[51]。Nivolumab相關(guān)眼部不良事件主要有外展神經(jīng)及面神經(jīng)麻痹、結(jié)膜炎、角膜移植免疫排斥反應(yīng)、干眼、葡萄膜炎[52]，其中有病例報道顯示可出現(xiàn)VKH綜合征樣的葡萄膜炎[53-54]。近來也有報道提示使用Nivolumab單一治療可能會導(dǎo)致眼底彌漫性色素減少和原有脈絡(luò)膜痣的消退[55]。而使用抗PD-L1抗體治療的患者可能會出現(xiàn)視神經(jīng)炎和垂體功能減退，因此使用期間應(yīng)考慮包括視神經(jīng)炎在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[56]。目前使用ICIs治療期間是否需要進行常規(guī)眼科檢查尚無共識，但對于使用可能導(dǎo)致眼部不良反應(yīng)的ICIs時，建議對在開始治療前及在使用過程中出現(xiàn)眼部相關(guān)不良事件的患者進行基礎(chǔ)眼科檢查[57]。當(dāng)ICIs治療后出現(xiàn)眼部炎癥時，大多數(shù)情況下可選用皮質(zhì)類固醇作為初始治療，根據(jù)受累部位的不同可選擇局部滴眼、局部注射或全身給藥[58]。然而想要更精準(zhǔn)地明確ICIs的適應(yīng)證以及如何更有效地應(yīng)對或避免使用ICIs后出現(xiàn)的眼部不良反應(yīng)，仍需大量的觀察和研究。

4 展望

大量研究已證明PD-1信號通路和CTLA-4在眼科多種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，特別是參與了免疫相關(guān)性眼病和UM的發(fā)病機制。因此，深入探明眼部疾病與PD-1通路和CTLA-4的相互關(guān)系將有助于人們進一步完善有關(guān)眼組織生理病理的認(rèn)識，為此類疾病的治療提供新的依據(jù)和方案。目前與PD-1通路和CTLA-4相關(guān)的ICIs治療腫瘤已取得了令人矚目的成績。在不斷推進相關(guān)免疫檢查點研究來為眼部相關(guān)疾病的治療提供新方案的同時，探討是否有其他眼部相關(guān)疾病的發(fā)病涉及免疫檢查點分子的改變，以及如何規(guī)避或減少使用ICIs后眼部相關(guān)免疫不良事件的發(fā)生，可能會是今后研究的熱點。