超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖工藝優(yōu)化及單糖組成、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性分析

江飛鳳，譚曉輝，胡鵬剛*，潘雪梅，閆錦

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽， 550025)2(荔波昌輝食業(yè)有限公司，貴州 荔波， 558400)

柚子是蕓香科植物柚的成熟果實，產(chǎn)于廣東、福建、貴州等地區(qū)。柚子皮是柚子經(jīng)人們食用或加工后剩下的表皮，約占整個柚子質(zhì)量的30%以上。據(jù)研究報道柚子皮中含有多種生理活性成分[1]，如黃酮、多糖、香精油、類檸檬苦素、膳食纖維等[2]，提取的活性成分可用于制藥品及保健食品的開發(fā)[3-4]。據(jù)文獻(xiàn)報道，柚子皮中多糖含量較高[5]，許其亮[6]利用水提法提取柚子皮多糖，多糖得率為8.30%。然而，目前對柚子皮多糖的研究報道比較少，缺少對柚子皮多糖單糖組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗氧化活性等方面研究分析。

多糖是指10個或10個以上單糖通過糖苷鍵縮聚而成的聚合物[7]，主要存在于動植物的體內(nèi)和微生物的細(xì)胞壁中，分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[8]。隨著工業(yè)的發(fā)展，多糖被廣泛應(yīng)用于食品[9]、醫(yī)藥[10]、材料領(lǐng)域[11]。近年來，多糖成了新的研究熱點，主要集中在多糖提取[12]、分離純化[13]、結(jié)構(gòu)分析[14]、抗氧化[15]、免疫活性[16]等方面研究。多糖提取是基于相似相溶原理將多糖從生物體里分離出來的過程。多糖提取方法主要有溶劑提取[17]、超聲波輔助提取[18]、酶解、酸堿提取等方法，但這些提取方法較單一，存在提取率低、耗時長等缺點。超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)是利用微波的電磁能結(jié)合超聲波的機械振蕩效果，可大幅度縮短提取時間，節(jié)約能源并提高得率，目前已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。如梁茜茜[19]采用超聲微波協(xié)同提取燕麥麩皮多糖，與傳統(tǒng)水提法相比，燕麥麩多糖得率從4.3%提高到8.45%；王勝男等[20]采用超聲-微波協(xié)同提取大豆種皮多糖性質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)；蔣新龍等[21]采用超聲波-微波協(xié)同提取棠梨籽油。

本試驗采用超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖，通過響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝條件，并對其單糖組成、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性進(jìn)行研究分析，為柚子皮多糖進(jìn)一步純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性研究及綜合開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚子：2019年11月15日采購于貴州省荔波縣。

無水乙醇，西隴科學(xué)股份公司；NaOH、H2O2，正丁醇，西隴科學(xué)股份公司；氯仿，廣州化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀、CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；FDU-2100型冷凍干燥機，埃朗科技國際貿(mào)易(上海)有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖單因素及響應(yīng)面實驗設(shè)計

1.3.1.1 多糖提取試驗步驟

多糖提取步驟如下：

柚子皮→烘干→粉碎→過40目篩→稱取10 g柚子皮→超聲微波協(xié)同提取→離心(6 000 r/min、10 min)→濃縮(20 mL左右)→醇沉(4倍體積無水乙醇)→靜置(4 ℃下靜置12 h)→離心(6 000 r/min、5 min)→沉淀冷凍干燥→柚子皮多糖

1.3.1.2 多糖得率的計算

多糖得率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m為凍干柚子皮多糖質(zhì)量，g；M為柚子皮質(zhì)量，g。

1.3.1.3 多糖提取單因素試驗

試驗探究微波功率(100、200、300、400、500、600 W)、提取液pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、提取時間(5、10、20、30、40、50 min)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1,mL∶g)對柚子皮多糖得率的影響。重復(fù)3次平行試驗，取其平均值。固定單因素條件為微波功率300 W、提取時間30 min、提取液pH 9.0、液料比40∶1(mL∶g)。

1.3.1.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇影響較顯著的3個單因素:微波功率、提取時間、液料比為響應(yīng)因子，多糖得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件，通過Box-Behnken實驗設(shè)計，進(jìn)行3因素3水平試驗分析。試驗因素及水平見表1。

表1 實驗自變量因素與水平

1.3.2 柚子皮多糖的脫色、脫蛋白

稱取0.5 g的柚子皮多糖，蒸餾水溶解并定容至200 mL，加入30% H2O210 mL，0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9，在40 ℃下加熱攪拌1 h，6 000 r/min離心5 min[22]。上清液中加入100 mL Sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，劇烈振蕩20 min，移入分液漏斗中靜置20 min，棄去中間與下層物質(zhì)，重復(fù)上述操作4次[23]。脫色脫蛋白后的溶液濃縮，透析48 h除鹽及小分子雜質(zhì)，每12 h更換一次蒸餾水，凍干即可獲得柚子皮多糖。

1.3.3 紫外光譜分析

取2 mL脫色脫蛋白后的多糖濃縮液，稀釋6倍，0.22 μm微濾膜過濾處理，以水為空白對照，在200～400 nm范圍內(nèi)紫外光譜掃描，確定多糖樣品特征吸收峰，同時檢測多糖樣品是否存在蛋白質(zhì)及核酸殘留。

1.3.4 分子質(zhì)量測定

將柚子皮多糖配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，0.22 μm微濾膜過濾處理。采用凝膠滲透色譜法測定柚子皮多糖分子質(zhì)量[24]。

1.3.5 單糖組成測定

單糖組成采用1-苯-3-甲-5-吡唑咔柱前衍生化和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時間的比較，確定單糖組成。

(1)多糖水解(多糖中單糖成分)：稱取10 mg多糖樣品于20 mL的鉗口瓶中中,加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸,充N2封管(10 L/min，1 min)，100 ℃烘箱中水解2 h；冷卻后打開蓋，取1 mL出來加入1 mL甲醇后，70 ℃水浴下用N2吹干,如此重復(fù)加甲醇并用N2吹干2次,以去除三氟乙酸;加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解殘渣，為多糖水解液，一定稀釋后衍生測定。(2)游離單糖的提?。悍Q取干樣約0.4 g、濕樣1.5 g于具塞刻度管中，加入10 mL乙醇(80%)，在70 ℃水浴超聲提取30 min；10 000 r/min離心，取濾液用80%乙醇定容至10 mL，然后取2 mL加入試管用氮氣吹干，之后加入1 mL NaOH(0.3 mol/L)溶液充分溶解殘渣，分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中，加400 μL 1-苯-3-甲-5-吡唑咔甲醇溶液，漩渦混勻；于70 ℃水浴中反應(yīng)2 h；取出放置冷卻至室溫；加400 μL HCl(0.3 mol/L)中和至pH 6～7;加水1 200 μL，加入等體積的氯仿，渦旋混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取2次。將水相用0.45 μm微孔膜(水系)過濾后供HPLC進(jìn)樣分析。

色譜條件：色譜柱AGILENT EC-C18(2.7 μm, 2.1 mm×50 mm)；流動相A：20 mmol/L 乙酸銨緩沖液(pH=7.0)；流動相B：乙腈；流速0.4 mL/min；

質(zhì)譜掃描條件：特征離子掃描模式；ESI+噴霧電壓2.0 kV；錐孔電壓30 V;離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣(N2)1 000 L/h；SIR模式檢測離子：481.09,495.1,510.1,511.08,525.06。

1.3.6 掃描電鏡分析

稱取1 mg柚子皮多糖，粘在粘有導(dǎo)電膠布的載物臺上，用吹塵球吹掉多余樣品，噴金，觀察多糖樣品形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.7 紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀測定多糖的有機官能團(tuán)。稱取1 mg柚子皮多糖，采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜掃描分析[25]。樣品測試前進(jìn)行背景掃描去除干擾，500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行空白掃描。

1.3.8 抗氧化活性分析

將柚子皮多糖配制成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的多糖溶液，參考ZENG等[26]的方法，測定柚子皮多糖對DPPH自由基的清除率；參考王新等[27]的方法，測定柚子皮多糖對羥自由基的清除率；參考GOPALAKRISHNAN等[28]的方法，測定柚子皮多糖對2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基的清除率；以上實驗均以VC為陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 柚子皮多糖提取單因素實驗結(jié)果

由圖1-A可知，微波功率為100～300 W時，柚子皮多糖得率隨著微波功率的增大而增大，當(dāng)微波功率為300 W時，多糖得率達(dá)到最大。隨著功率的進(jìn)一步增大，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是超聲波本身具有一定的空化作用，空化作用會產(chǎn)生高溫高壓，這時微波功率過高會引起壓力過大，破壞多糖結(jié)構(gòu)，同時微波功率過高會使溶劑溫度迅速上升，溶劑發(fā)生揮發(fā)，導(dǎo)致多糖不能充分的溶于溶劑中，出現(xiàn)得率降低[29-30]。試驗微波功率選擇為300 W。

A-微波功率;B-提取液pH;C-提取時間;D-液料比

由圖1-B可知，提取液pH在7.5～9.0時，多糖得率隨著pH的增大而增大，在pH 9.0時，多糖得率達(dá)到最大，隨后呈現(xiàn)平緩狀態(tài)。試驗提取液pH選擇為9.0。

由圖1-C可知，提取時間在10～30 min時，多糖得率隨著時間的延長而增大；時間在30～50 min時，多糖得率出現(xiàn)輕微增大，隨后呈下降趨勢，原因可能是長時間在高溫高壓狀態(tài)下，少部分多糖出現(xiàn)降解。其次隨著時間延長提取液黏度增大，導(dǎo)致多糖溶出受黏度影響溶出速度減慢[31]。試驗提取時間選擇30 min。

由圖1-D可知，液料比在10∶1～40∶1 (mL∶g)時，多糖得率隨著液料比增大而增大，在液料比為40∶1時，多糖得率達(dá)到最大。隨著液料比的進(jìn)一步增大，多糖得率出現(xiàn)輕微下降。原因可能是溶劑的增加導(dǎo)致溶液離心次數(shù)增加，增加了多糖的掛壁幾率，出現(xiàn)損耗增加，從而影響多糖得率。試驗液料比選擇為40∶1 (mL∶g)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立和方差分析

在柚子皮多糖提取單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇影響較顯著的單因素：微波功率、提取時間、液料比為響應(yīng)因子，多糖得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2、表3中的試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，得到回歸方程：

Y=10.29+0.10A+0.26B-0.28C+0.21AB+0.087AC-0.070BC-0.078A2-0.56B2-0.97C2

表2 超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

根據(jù)實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表3可知，該模型中F值為97.52，P<0.000 1，達(dá)到極顯著水平。失擬項的P>0.05，失擬項差異不顯著，表明該回歸方程對試驗擬合程度較好。對回歸方程的顯著性進(jìn)行檢驗分析表明，超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖工藝條件中微波功率A、提取時間B、液料比C及二次項B2、C2分別對柚子皮多糖得率影響顯著；交互項AB對柚子皮多糖得率影響較顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，模型回歸系數(shù)R2=0.992 1，校正決定系數(shù)R2=0.981 9。因此該模型對超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖得率的分析和預(yù)測是可靠的。

表3 回歸方程方差分析及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

響應(yīng)面圖是運用圖形技術(shù)將函數(shù)關(guān)系顯示出來，便于直接觀察各個變量試驗值與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩兩變量間的交互作用。由圖2可以看出，各因素交互作用對柚子皮多糖得率的影響。響應(yīng)面值Y隨著各因素的增加先達(dá)到最高點再逐漸減小，若曲線越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，此因素的交互作用對柚子皮多糖得率的影響越大;反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對響應(yīng)值的影響就越小。由圖2可知提取時間和液料比對柚子皮多糖得率的影響最大，表3回歸分析結(jié)果也與此相吻合，提取時間和液料比的P<0.000 1，均達(dá)到極顯著水平。由回歸方程中得到超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖的最佳工藝條件為：微波功率400 W、提取時間34.32 min、液料比38.82∶1 (mL∶g)，在此條件下理論最大得率為10.43%。

2.2.3 驗證試驗

根據(jù)操作可行性調(diào)整為：微波功率400 W，提取時間34 min，液料比39∶1 (mL∶g)。進(jìn)行3次重復(fù)試驗，測得實際得率為10.41%。實際值與理論值較為接近。表明該回歸模型能夠很好地反映微波功率、提取時間、液料比對柚子皮多糖得率的影響，證明了該方法研究超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖的可行性。此試驗結(jié)果比許其亮[6]柚子皮多糖提取得率較高，其多糖得率提高了2.11%，比較明顯的優(yōu)點是本試驗很大程度地縮短了提取時間、增加了多糖得率。

A-提取時間與微波功率交互作用；B-液料比與微波功率交互作用；C-液料比與提取時間交互作用

2.3 柚子皮多糖的脫色、脫蛋白

柚子皮多糖經(jīng)30%H2O2脫色，Sevage法脫蛋白，得到澄清透明多糖溶液，濃縮、透析、凍干得柚子皮多糖。

2.4 紫外光譜分析

由圖3可知，柚子皮多糖在200 nm附近有顯著的紫外吸收，表明柚子皮多糖在200 nm附近件有吸收峰，而在260 nm、280 nm處無明顯吸收峰，表明不存在蛋白質(zhì)及核酸殘留，是一種較純的多糖[32]。

圖3 柚子皮多糖紫外吸收光譜圖

2.5 柚子皮多糖的分子質(zhì)量測定

分子質(zhì)量是多糖的重要結(jié)構(gòu)指標(biāo)，影響多糖的理化和生物學(xué)性質(zhì)。采用凝膠滲透色譜法對柚子皮多糖分子質(zhì)量進(jìn)行檢測，測試數(shù)據(jù)表明，柚子皮多糖平均分子質(zhì)量為2.4×104Da。

2.6 單糖組成分析

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時間的比較分析確定單糖組成。柚子皮多糖單糖組成結(jié)果如表4、圖4所示。由圖4、表4可知，柚子皮多糖是一種酸性雜多糖，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為0.502∶0.960∶0.295∶6.331∶40.673∶10.732∶7.923，其中葡萄糖含量最高。

表4 柚子皮多糖的單糖組成

A-混合標(biāo)準(zhǔn)品;B-柚子皮多糖

2.7 掃描電鏡分析

柚子皮多糖的微觀結(jié)構(gòu)見圖5。由圖5可見，柚子皮多糖主要為不規(guī)則碎片結(jié)構(gòu)，伴有小的不規(guī)則顆粒，碎片表面粗糙，呈片狀，結(jié)構(gòu)緊密，相互緊靠。所得多糖呈不規(guī)則形狀，表明柚子皮多糖具有非晶態(tài)結(jié)構(gòu)。掃描電鏡圖表明，在超聲-微波協(xié)同提取情況下，柚子皮多糖結(jié)構(gòu)保持完整。

2.8 紅外光譜分析

紅外光譜圖在多糖結(jié)構(gòu)分析方面主要用于官能團(tuán)的確定、吡喃糖和呋喃糖的區(qū)別，以及主要取代基的鑒定等。根據(jù)紅外光譜圖的特征峰的出峰位置和形狀可以推測多糖結(jié)構(gòu)的一些特征[16]。由圖6可知，柚子皮多糖在4 000～500 cm-1區(qū)有多糖類物質(zhì)的一般特征吸收。在3 422 cm-1處出現(xiàn)的寬而強的吸收峰是—OH的O—H伸縮振動吸收峰[33]；在2 926 cm-1左右的吸收峰是由于CH3或CH2的弱C—H鍵的伸縮振動所致[34]；在1 619 cm-1處的弱吸收峰為結(jié)合水的多糖水合振動吸收峰；1 419 cm-1處的弱吸收峰為烷基的C—H變角度振動吸收峰；1 074 cm-1處的弱吸收峰為吡喃糖苷環(huán)骨架的C—O可變角度振動吸收峰，說明分子中存在C—O—H和C—O—C結(jié)構(gòu)[35]；在772 cm-1處出現(xiàn)的微弱吸收峰推測其含有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[36]。

圖6 柚子皮多糖的紅外吸收光譜圖

2.9 抗氧化活性分析

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基是為數(shù)不多的穩(wěn)定的有機氮自由基之一，它可以接受電子或氫自由基成為穩(wěn)定的分子[37]。清除穩(wěn)定DPPH自由基的模型被廣泛用于評估天然化合物的自由基清除能力[38]。由圖7可知，柚子皮多糖對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基的清除能力具有劑量依賴關(guān)系，隨著柚子皮多糖質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大。其中，柚子皮多糖對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基半抑制濃度IC50分別為0.34、1.57、1.86 mg/mL；VC對DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基的半抑制濃度IC50分別為0.11、0.12、0.10 mg/mL。圖7-A中，DPPH自由基清除率在柚子皮多糖質(zhì)量濃度為0.0～0.4 mg/mL時明顯上升，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，清除率達(dá)到最大值55.58%，而標(biāo)準(zhǔn)品VC對DPPH自由基的清除率高達(dá)92.60%。

A-DPPH自由基；B-羥自由基；C-ABTS自由基

羥自由基是一種反應(yīng)性極強的化學(xué)分子，在各種自由基物種中具有最強的損傷作用，能很容易地穿過細(xì)胞膜，與多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷或細(xì)胞死亡，是造成氧化傷害的主要原因。一般來說，在這3種活性氧分子中，DPPH自由基和ABTS自由基是室溫下穩(wěn)定的自由基，而羥自由基被認(rèn)為是最具活性的自由基。羥自由基也被認(rèn)為是最有害的自由基，因此，清除羥自由基對保護(hù)生命系統(tǒng)非常重要[39]。如圖7-B所示，在質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg/mL后，增長趨勢較為平緩，在1 mg/mL時標(biāo)準(zhǔn)品VC對羥自由基的清除率高達(dá)92.35%，柚子皮多糖對羥自由基清除率達(dá)到最大值46.32%。在植物多糖清除羥自由基實驗中，濃度為21.1 mg/mL的槐根多糖清除羥自由基的活性為74.02%[39]，2.5 mg/mL鐵皮石斛多糖清除羥自由基的活性為75.34%[14]，0.3 mg/mL苦瓜多糖清除羥自由基的活性為63.92%[40]，均表明植物多糖具有開發(fā)作為天然抗氧化劑的前景。

ABTS自由基測定法也是一種快速評估多糖抗氧化能力的方法，多糖可向不穩(wěn)定的ABTS陽離子自由基提供一個電子和氫原子以形成穩(wěn)定的ABTS自由基，且在734 nm處可檢測到藍(lán)綠色ABTS自由基溶液的顏色還原[41]。如圖7-C所示，在質(zhì)量濃度0.8 mg/mL的柚子皮多糖中，清除ABTS自由基的活性最大值為40.25%。標(biāo)準(zhǔn)品VC對羥自由基的清除率達(dá)98.70%?？梢?，柚子皮多糖對DPPH自由基的清除能力均強于對羥自由基和ABTS自由基的清除能力。其清除自由基能力的差異可能是由于其特殊的結(jié)構(gòu)，其抗氧化機理與多糖結(jié)構(gòu)的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

超聲-微波協(xié)同提取柚子皮多糖，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝為：微波功率400 W，提取時間34 min，液料比39∶1(mL∶g)，提取液pH 9.0，多糖得率為10.41%。柚子皮多糖平均分子質(zhì)量為2.4×104Da，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成的酸性雜多糖，摩爾比為0.502∶0.960∶0.295∶6.331∶40.673∶10.732∶7.923，主要為不規(guī)則碎片結(jié)構(gòu)，伴有小的不規(guī)則顆粒，碎片表面粗糙，所得多糖呈不規(guī)則形狀，表明柚子皮多糖具有非晶態(tài)結(jié)構(gòu)，為吡喃型糖苷環(huán)骨架，具有較好的自由基清除能力，對DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基的半抑制濃度IC50分別為0.34、1.57、1.86 mg/mL。