典型化學(xué)加工條件對不溶性蠶蛹蛋白凝膠特性影響

黎重陽，謝盛莉，馬良,，侯勇，付余，張宇昊,*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶， 400715)2(西南大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院，生物學(xué)研究中心，重慶， 400715)

蠶蛹(silkworm pupa，SP)是蠶蛾科家蠶蛾的蛹，屬于蠶繭抽絲后的副產(chǎn)物，其于1998年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為“可作為普通食品管理的新資源食品”，是第一個被認(rèn)定的昆蟲類食品。我國作為養(yǎng)蠶大國，近年來全國年產(chǎn)蠶蛹量在30萬t以上，約占全世界總產(chǎn)量的80%[1]。蠶蛹蛋白在蠶蛹中占比極高，幾乎是蠶蛹干基中的主要營養(yǎng)物質(zhì)，因此大多研究以蠶蛹蛋白為主體研究對象。呂汶駿等[2]研究發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白中8種必需氨基酸含量占比為49.09%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比為96.43%，高于WHO/FAO提出的參考蛋白模式(8種必需氨基酸含量占比為40%，必需氨基酸與非必需氨基酸之比為60%)；由此可見，蠶蛹蛋白是一種高營養(yǎng)價值的蛋白資源，但由于其含有潛在過敏原，如30K家族蛋白、幾丁質(zhì)酶、卵黃原蛋白、丙糖磷酸異構(gòu)酶等[3]，部分人食用蠶蛹相關(guān)產(chǎn)品后會出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等過敏反應(yīng)，從而限制了蠶蛹在實(shí)際生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。因此，在食品安全的前提下充分開發(fā)利用蠶蛹資源，必須解決蠶蛹蛋白過敏問題。謝盛莉等[4]按照溶解性對蠶蛹蛋白進(jìn)行分級提取，包括水溶性、醇溶性、鹽溶性、堿溶性蛋白和不溶性蛋白，并檢測其中存在的潛在過敏原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白中不溶性蛋白含量高達(dá)53%，在不同種類蠶蛹蛋白中所占比例最高，且過敏原分布顯示，其中僅檢測出3種過敏原，僅占不溶性蛋白9.87%，含量較低，且經(jīng)過多次堿洗處理后理論上可以降低其致敏性，使不溶性蠶蛹蛋白有直接開發(fā)為蛋白產(chǎn)品或者作為改善食品功能性質(zhì)的添加物的可能。

蛋白質(zhì)的功能特性在食品原料的加工利用或儲存過程中起著極其重要的作用，穆利霞等[5]研究表明繅絲后蠶蛹蛋白的乳化活性(25.52 m2/g)和溶解性(氮溶解指數(shù)60.17%)最好；練釗等[6]使用Osborn法分級提取繅絲后的蠶蛹水溶性、鹽溶性、醇溶性以及堿溶性蛋白，并對其功能特性進(jìn)行測定，結(jié)果表明水溶性蛋白的溶解性和保水性最強(qiáng)，鹽溶性蛋白具有良好的持油性，醇溶性蛋白具有良好的乳化活性。由此可見，蠶蛹蛋白具備一定功能特性，且按照溶解性對其進(jìn)行分級提取后可根據(jù)不同功能特性而應(yīng)用于更加廣泛的食品加工領(lǐng)域。

一般動物性不溶性蛋白研究較多集中在凝膠特性方面，在食品加工過程中常見的條件如pH、離子強(qiáng)度、添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG酶)等會對蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生一定影響，但目前關(guān)于蠶蛹中不溶性蛋白的研究報道較少，且其凝膠特性尚無報道。因此，為明確典型食品加工條件對蠶蛹蛋白凝膠特性的影響規(guī)律，實(shí)驗(yàn)以鮮蠶蛹為原料提取不溶性蛋白，對其氨基酸組成進(jìn)行測定，采用不同的pH、離子強(qiáng)度處理蛋白，并添加TG酶，進(jìn)行流變學(xué)以及拉曼光譜學(xué)的分析，以期為進(jìn)一步的蠶蛹蛋白產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮蠶蛹(家蠶實(shí)驗(yàn)品種“夏芳”，25 ℃，桑葉飼養(yǎng)，化蛹后第3天放置于-20 ℃凍存?zhèn)溆?、無水乙醇(99.9%)、HCl、NaCl、十二烷基硫酸鈉、二甲基硅油。所有試劑均為分析純，所有水均為二次蒸餾水。

JA3003B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DW-3型數(shù)顯電動攪拌器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋，上海新諾儀器設(shè)備有限公司；Multifuge X3R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；L8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；DHR-1流變儀，美國TA公司；DXR2拉曼光譜儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蠶蛹不溶性蛋白提取

蠶蛹預(yù)處理：蠶蛹解凍，沸水漂洗5 min，料理機(jī)粉碎。70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫脂，除醇溶蛋白(2 h，2次)，10 g/L NaOH除去堿溶性蛋白(2 h，3次)，200目濾布過濾除蛹?xì)?，濾液離心(10 000 r/min，10 min)，用純水多次洗滌蛋白至離心液中性，得到不溶性蛋白。

1.2.2 氨基酸分析

參照國標(biāo)GB 5009.124—2016測定氨基酸。

1.2.3 不同條件處理對蠶蛹不溶性蛋白流變性能以及結(jié)構(gòu)的影響

1.2.3.1 流變性能測定

不同的前處理方式：(1)不同pH處理對蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響(頻率及溫度掃描)：取10 g不溶性蛋白分別置于pH 5.0～8.0的溶液中，4 ℃過夜，離心，室溫平衡30 min后進(jìn)行流變測試。(2)不同鹽濃度對蠶蛹不溶性蛋白流變性能影響(頻率及溫度掃描)：取10 g不溶性蛋白分別加入NaCl，使得鹽質(zhì)量濃度分別為0、10、20、25、35 g/L，攪拌均勻，4 ℃過夜，室溫平衡30 min后進(jìn)行流變測試。(3)TG酶添加對蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響(頻率及溫度掃描)：取10 g不溶性蛋白，加入5% TG酶40 ℃反應(yīng)2 h，4 ℃過夜，次日取出室溫平衡30 min后進(jìn)行流變測試。

參照文獻(xiàn)[7]方法測定蛋白流變性能，并略做修改。測定指標(biāo)為儲能模量(G′)、損失模量(G″)和tanδ值。頻率掃描參數(shù)：溫度25 ℃，應(yīng)變?yōu)?%，頻率范圍為0.01～10 Hz。溫度掃描參數(shù)：將樣品從25 ℃開始以2 ℃/min的升溫速率升溫至80 ℃，5 ℃/min的降溫速率降溫至25 ℃。頻率為0.1 Hz，應(yīng)變1%。

1.2.3.2 拉曼光譜分析

不同前處理方式：(1)不同pH前處理：取10 g不溶性蛋白分別置于pH 5.0～8.0的溶液中，4 ℃過夜，離心，室溫平衡30 min后進(jìn)行拉曼光譜測試。(2)不同鹽濃度前處理：取10 g不溶性蛋白分別加入NaCl，使得鹽質(zhì)量濃度分別為0、10、20、25、35 g/L，攪拌均勻，4 ℃過夜，室溫平衡30 min后進(jìn)行拉曼光譜測試。使用拉曼光譜儀記錄凝膠樣品400～3 050 cm-1的拉曼光譜。測量參數(shù)：激發(fā)波長785 nm；物鏡20×焦距；光闌50 μm狹縫；曝光時間10 s；樣品曝光15次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析，使用單因素方差分析(ANOVA)方法分析數(shù)據(jù)，當(dāng)P<0.05時判定組間存在顯著差異，并使用Origin 9.0軟件作圖。拉曼圖譜處理：拉曼圖譜基線校正、歸屬采用OMINIC軟件，歸一化處理以苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，譜圖的擬合采用Peakfit軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸分析

由表1可以得出，不溶性蛋白質(zhì)氨基酸種類齊全，必需氨基酸/總氨基酸(essential amino acids/total amino acids，E/T)達(dá)到40.27%，符合FAO/WHO推薦模式40%，也符合高質(zhì)量的蛋白質(zhì)E/T比值36%；谷物[8]中的限制性氨基酸賴氨酸含量約為2.5～3.7 g/100g，大豆等[9]油料作物蛋白的限制性氨基酸蛋氨酸含量約為5.5 g/100g。因此，不溶性蠶蛹蛋白是一種營養(yǎng)價值較高的蛋白資源，可作為一種重要的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，添加到谷物制品、大豆蛋白制品中，彌補(bǔ)其限制性氨基酸造成的營養(yǎng)缺陷。

蛋白凝膠作用與本身的氨基酸分布有關(guān)，蛋白凝膠的形成與疏水性氨基酸有關(guān)，氨基酸中的非極性片段之間的疏水相互作用可以讓蛋白之間結(jié)合緊密。蛋白質(zhì)中疏水氨基酸的比率會影響凝膠的形成，當(dāng)?shù)鞍字械氖杷园被岢^31.5%時，有可能形成不透明的凝結(jié)型凝膠，非極性氨基酸殘基低于31.5%時的蛋白質(zhì)則形成半透明或透明型凝膠。疏水相互作用對凝膠形成有重要作用。由表1可得蠶蛹不溶性蛋白中的疏水性氨基酸比例約為40%，理論上在一定條件下有可能形成不透明的凝結(jié)凝膠[10-11]。

表1 不溶性蛋白氨基酸分析

2.2 不同pH處理對蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響

儲能模量G′也稱彈性模量，反映蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成情況，代表樣品的彈性特征；耗能模量G″也稱黏性模量，代表樣品的黏性特征[12]。損耗角正切tanδ是G″與G′模量的比值，黏性模量(G″)小于彈性模量(G′)，tanδ<1，表明凝膠體系中彈性占主導(dǎo)地位[13]，反之則表示黏性占主導(dǎo)地位。tanδ值越高則表明樣品組分越黏稠或彈性越低，tanδ值越小，表明樣品彈性越高[14]；當(dāng)G′值明顯大于G″值時，tanδ越小，表明該體系屬于弱凝膠體系[15]。

蛋白在加工過程中其凝膠特性受外界條件溫度、pH、離子強(qiáng)度等影響，pH的變化會引起蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)及分子間作用力發(fā)生變化。食品中體系一般為弱酸性或弱堿性，故選擇pH 5.0～8.0為模擬加工體系，對蠶蛹蛋白處理后對其流變性能進(jìn)行測定。由圖1-a、圖1-b可以看出，在pH 5.0～8.0，隨著頻率的增加，G′和G″模量出現(xiàn)上升趨勢，這表明頻率的增加導(dǎo)致了蛋白分子內(nèi)作用力增強(qiáng)。在相同的振蕩頻率下，pH 6.0時G′和G″值相對最高，表明pH 6.0時蛋白分子間的相互作用較強(qiáng)，有利于蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，凝膠性能較好；pH 8.0時G′和G″值相對最低，表明此條件下蛋白相互作用相對較弱，凝膠性能較差。與WESTPHALEN等[16]研究結(jié)果類似，隨著pH值的增加豬肉肌球蛋白的G′值逐漸減小，其原因可能是隨著pH的變化，蛋白質(zhì)分子間的作用力發(fā)生了變化，導(dǎo)致凝膠性能發(fā)生變化。圖1-c顯示，隨著頻率的增加，tanδ值出現(xiàn)下降趨勢，這表明蛋白凝膠體系彈性進(jìn)一步增強(qiáng)，tanδ值的變化與蛋白鍵間的弛豫行為有關(guān)[17]，在頻率0～1 Hz tanδ出現(xiàn)極大值可能是與初始凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的部分松散[10]以及蛋白鍵持續(xù)作用時間相對較短有關(guān)[18]。在1～10 Hz頻率范圍內(nèi)，pH 8.0時tanδ最小，此時體系彈性最好，但在該掃描模式下蛋白樣品的tanδ<1，蛋白的彈性模量(G′)明顯大于黏性模量(G″)，表明蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系在pH 5.0～8.0是一種弱凝膠。

a-G′;b-G″;c-tanδ

由圖2-a、圖2-b可以看出，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的G′和G″值總體呈現(xiàn)下降趨勢。溫度升高導(dǎo)致蛋白模量急劇下降，可能是由以下原因引起的[19]：(1)隨著溫度的升高，部分蛋白分子間作用受到破壞，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺少支撐而變得松散；(2)蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能使得凝膠網(wǎng)絡(luò)的完整性受到破壞，導(dǎo)致蛋白的黏彈性下降。而出現(xiàn)平臺期的原因可能是高溫下的蛋白凝膠之間的作用力達(dá)到了短暫的平衡。tanδ值下降，說明總體而言高溫下更有利于體現(xiàn)蠶蛹蛋白的彈性，原因是高溫下構(gòu)象轉(zhuǎn)變，蛋白分子黏性受到的破壞更強(qiáng)。tanδ值出現(xiàn)快速下降趨勢，表明隨著溫度升高固體性質(zhì)增強(qiáng)以及流體性質(zhì)減弱。整個凝膠體系tanδ<1，表明該模式下蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系仍為弱凝膠體系。

G′和G″值在不同pH下發(fā)生變化的原因是pH變化會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力受到了影響，從而引起了蛋白凝膠性能發(fā)生變化。可以根據(jù)在不同的pH下蛋白結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化來推測流變學(xué)特性發(fā)生改變的原因。

a-G′;b-G″;c-tanδ

2.3 不同pH處理對蠶蛹不溶性蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖3 不同pH條件下的拉曼譜圖

酰胺I帶拉曼特征峰的結(jié)構(gòu)普遍歸屬[23]分為：α-螺旋結(jié)構(gòu)對應(yīng)范圍為1 645～1 658 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)對應(yīng)范圍為1 665～1 680 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對應(yīng)范圍為1 640～1 644 cm-1與1 681～1 690 cm-1；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對應(yīng)范圍為1 659～1 664 cm-1。通常利用酰胺Ⅰ帶或者酰胺Ⅲ帶檢測蛋白質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)，根據(jù)拉曼原始數(shù)據(jù)擬合蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的相對含量，本研究利用酰胺Ⅰ帶并根據(jù)ALIX等[24]的方法分析不同pH處理后蛋白質(zhì)樣品中的α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量。

如圖4所示，α-螺旋相對含量在pH 5.0～8.0隨著pH的增大而增大，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則狀態(tài)的相對含量在此范圍內(nèi)減少，表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)隨著pH的增大有序化度增加[25]。根據(jù)以上流變學(xué)結(jié)果顯示，無論是頻率掃描還是溫度掃描，pH 8.0時樣品的G′和G″模量相對較低，可能說明不溶性蠶蛹蛋白結(jié)構(gòu)有序化不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成和蛋白質(zhì)間的相互作用有關(guān)，進(jìn)一步通過微環(huán)境分析蛋白質(zhì)間相互作用變化趨勢。

圖4 不同pH條件下的二級結(jié)構(gòu)相對含量

760 cm-1附近的拉曼光譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，可用于研究色氨酸殘基的疏水性微環(huán)境的變化，當(dāng)色氨酸殘基從被包埋態(tài)疏水微環(huán)境變成被暴露態(tài)極性環(huán)境時，760 cm-1附近的峰強(qiáng)度可能下降[26]。如圖5所示，在pH 6.0時的I760歸一化強(qiáng)度達(dá)到一個極大值，說明更多的色氨酸殘基沒有暴露在表面，可能是蛋白質(zhì)內(nèi)部更多的疏水作用形成而導(dǎo)致的疏水基團(tuán)包埋，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，pH 6.0時G′和G″模量較高，可能說明分子內(nèi)部疏水作用的形成，更有利于蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。當(dāng)色氨酸殘基趨于暴露時，可能導(dǎo)致蛋白內(nèi)部疏水相互作用降低，不利于蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，G′和G″值出現(xiàn)降低趨勢。

酪氨酸的特征雙峰(850/830)是酪氨酸殘基上對位取代苯環(huán)的振動引起的[27]，其雙峰比值(I850/I830)可作為微環(huán)境及酚羥基上氫鍵的探針以及酪氨酸組分埋藏和暴露的程度[28]，當(dāng)I850/I830的比值為1.25～1.40時，表明此時酪氨酸殘基完全暴露于分子表面；當(dāng)比值為0.3～0.5時，酪氨酸殘基完全包埋而藏于分子內(nèi)部；當(dāng)比值為0.7時，酪氨酸殘基此時處于電離狀態(tài)[29]。由圖5可得，在pH 5.0～6.0,I850/I830比值均大于1，pH 6.0時I850/I830比值相對最低，此時酪氨酸暴露最少。酪氨酸作為氫鍵的供體[30]，酪氨酸暴露減少說明分子間氫鍵作用減少，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，pH 6.0時G′和G″模量較高，此時氫鍵作用較弱，因此推測過多的氫鍵形成可能不利于不溶性蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成。

在動物性蛋白中，肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠過程中疏水作用和二硫鍵的形成起到重要作用[15]，而膠原蛋白類凝膠形成過程中氫鍵起到更重要的作用[31]，維系不溶性蠶蛹蛋白凝膠特性的可能主要是疏水作用，由此可見，其凝膠維系方式可能與肌原纖維蛋白更加接近。

圖5 不同pH條件下的歸一化強(qiáng)度

2.4 不同鹽濃度處理對蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響

除了pH的影響外，離子強(qiáng)度會引起蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)及分子間作用力發(fā)生變化，從而引起蛋白凝膠性質(zhì)發(fā)生變化。依據(jù)肉糜蛋白類制品加工過程中常用鹽濃度，探究不同鹽濃度處理后蛋白質(zhì)的G′、G″值和tanδ值的變化情況，進(jìn)行頻率掃描后的變化如上圖所示。由圖6-a、圖6-b可以看出，隨著頻率的增加，不同鹽濃度條件下的G′和G″值呈現(xiàn)增加趨勢，在相同的振蕩頻率下，低鹽質(zhì)量濃度(10～20 g/L)的G′值小于對照組，與BERGROS等[32]類似，鹽的加入影響了羅非魚蛋白凝膠的G′值，鹽處理后的蛋白G′值明顯低于未加鹽處理的蛋白；中高鹽濃度(25～35 g/L)的G′值高于對照組，可能是鹽影響了蛋白分子間的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性發(fā)生變化。在鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時，體系的G′和G″值相對最高，表明此條件下蛋白質(zhì)分子間的相互作用較強(qiáng)，此時有利于蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，流變性能較好。由圖6-c可以看出，tanδ值隨著頻率的增加出現(xiàn)下降趨勢，tanδ值的下降表明樣品彈性增強(qiáng)。在1～10 Hz，對照組的tanδ最小，此時體系彈性最好，經(jīng)過鹽處理后蛋白體系彈性下降。在鹽質(zhì)量濃度為0～35 g/L時，所有體系的G′值明顯大于G″值，tanδ值分布在0.12～0.24，表明蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系屬于弱凝膠體系。

由圖7-a、圖7-b可以看出，隨著溫度的升高，不同鹽質(zhì)量濃度(0～35 g/L)處理后蛋白的G′和G″值總體呈現(xiàn)下降趨勢，G′值在25～70 ℃出現(xiàn)快速下降的趨勢，70 ℃后出現(xiàn)一個相對平穩(wěn)的平臺期；G″值在25～70 ℃出現(xiàn)快速下降的趨勢，70 ℃后出現(xiàn)一個較小的下降趨勢；在相同掃描溫度下，在鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時的G′和G″值最高，此條件下蛋白質(zhì)分子間的相互作用較強(qiáng)，有利于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，流變性能較好；由圖7-c可以看出，tanδ值總體呈現(xiàn)下降趨勢，隨著溫度的升高，tanδ值在25～40 ℃時呈現(xiàn)先緩慢下降趨勢，40 ℃之后出現(xiàn)快速下降的趨勢。該掃描模式下tanδ值曲線分布密集，tanδ值總體分布范圍在0.12～0.24，G′明顯大于G″值，表明蠶蛹不溶性蛋白凝膠體系屬于弱凝膠體系。

G′和G″值在不同鹽濃度下發(fā)生變化的原因是離子濃度的變化可能會引起蛋白結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致蛋白內(nèi)部分子間維持凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力受到影響，從而引起了蛋白凝膠性能發(fā)生變化?？梢愿鶕?jù)在不同的鹽濃度下蛋白結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化來推測流變學(xué)特性發(fā)生改變的原因。

a-G′;b-G″;c-tanδ

2.5 不同鹽濃度處理對蠶蛹不溶性蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖8為不同鹽質(zhì)量濃度(0～35 g/L)處理后蛋白樣品的拉曼光譜曲線。不同鹽濃度處理后的拉曼光譜圖基本一致，利用酰胺Ⅰ帶并根據(jù)ALIX等[24]的方法分析不同鹽濃度處理后蛋白樣品中的α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量。

圖8 不同鹽濃度條件下的拉曼譜圖

如圖9所示，在鹽質(zhì)量濃度為0～35 g/L時，α-螺旋和β-折疊的相對含量變化不明顯，α-螺旋和β-折疊的相對含量均分布在65%～75%，表明此條件下的蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定有序。

圖9 不同鹽濃度條件下的二級結(jié)構(gòu)相對含量

如圖10所示，在鹽質(zhì)量濃度范圍為0～35 g/L，鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時，I760強(qiáng)度達(dá)到一個極大值，色氨酸趨于包埋，說明此時更多的色氨酸殘基沒有暴露在表面，可能是蛋白內(nèi)部更多的疏水作用形成而導(dǎo)致的疏水基團(tuán)包埋，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，鹽質(zhì)量濃度35 g/L時G′和G″模量較高，可能說明分子內(nèi)部疏水作用的形成，更有利于蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。當(dāng)色氨酸殘基趨于暴露時，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水相互作用降低，不利于蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，G′和G″值出現(xiàn)降低趨勢。

由圖10可得，在鹽質(zhì)量濃度范圍0～35 g/L內(nèi)，鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時I850/I830比值最小，此時酪氨酸暴露最少，酪氨酸作為氫鍵的供體，酪氨酸暴露減少說明分子間氫鍵作用減少，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，此時G′和G″模量較高，氫鍵作用較弱，因此推測過多的氫鍵形成可能不利于不溶性蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成。當(dāng)酪氨酸暴露增多時，不利于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成，可能導(dǎo)致流變學(xué)特性變差，G′和G″值出現(xiàn)降低趨勢。

圖10 不同鹽濃度條件下的歸一化強(qiáng)度

2.6 TG酶處理對蠶蛹不溶性蛋白流變性能的影響

TG酶是一種催化蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈中谷氨胺殘基與賴氨酸之間形成ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸共價鍵的蛋白酶，通常用于蛋白質(zhì)凝膠特性的改善[33]。由圖11-a～圖11-c可以看出，隨著頻率增大，蛋白體系的G′和G″值總體呈現(xiàn)上升趨勢；由圖11-d～圖11-f可以看出，隨著溫度的升高，蛋白體系的G′和G″值總體呈現(xiàn)下降趨勢。無論是頻率掃描還是溫度掃描，蛋白凝膠體系的黏性模量(G″)始終小于彈性模量(G′)，tanδ值<1，表明蠶蛹不溶性蛋白質(zhì)凝膠仍是彈性占主導(dǎo)地位的弱凝膠體系。加入TG酶處理后的蛋白體系的G′和G″模量明顯增大，黏彈性增強(qiáng)，表明TG酶的添加可有效改善蠶蛹不溶性蛋白的凝膠特性。

在典型加工條件下，不溶性蠶蛹蛋白呈現(xiàn)弱凝膠特性，而TG酶可以顯著增強(qiáng)其凝膠特性，這表明在TG酶交聯(lián)條件下，不溶性蠶蛹蛋白具有開發(fā)凝膠類蛋白質(zhì)制品或作為在其中添加使用的可行性。

a-G′;b-G″;c-tanδ

3 結(jié)論

(1)不溶性蠶蛹蛋白中必需氨基酸含量40%，是一種營養(yǎng)價值較高的蛋白質(zhì)資源，且疏水性氨基酸比例達(dá)到40%，有蛋白質(zhì)分子間通過疏水作用力形成不透明凝膠的可能。

(2)不溶性蠶蛹蛋白經(jīng)過不同的pH和不同鹽濃度處理后，經(jīng)過流變學(xué)頻率掃描和溫度掃描顯示，在pH 6.0、鹽質(zhì)量濃度為35 g/L時，不溶性蛋白體系的G′值和G″值最高，黏彈性最好；在pH 5.0～8.0、鹽質(zhì)量濃度為0～35 g/L時，不溶性蛋白質(zhì)凝膠體系的G′值明顯大于G″值，tanδ<1，表明不溶性蛋白質(zhì)凝膠是一種弱凝膠。拉曼光譜學(xué)顯示，pH增大會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序化增多，但不利于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的形成，不溶性蛋白體系的G′值和G″值在pH 8.0時最低。色氨酸的暴露與疏水相互作用有關(guān)，色氨酸在pH 6.0及鹽質(zhì)量濃度35 g/L時趨于包埋態(tài)，分子內(nèi)部疏水作用的形成，更有利于蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，此時G′值和G″值最高。當(dāng)色氨酸殘基趨于暴露時，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水相互作用降低，不利于蠶蛹蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。酪氨酸的暴露與氫鍵作用力有關(guān)，酪氨酸在pH 6.0時及鹽質(zhì)量濃度35 g/L暴露最少，說明分子間氫鍵作用減少，結(jié)合流變學(xué)結(jié)果，推測過多的氫鍵形成可能不利于不溶性蠶蛹蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的形成。疏水相互作用和氫鍵可能是影響蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的的關(guān)鍵作用力，蛋白微環(huán)境發(fā)生變化時，維持蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力也會發(fā)生變化，流變學(xué)特征的G′值和G″值發(fā)生變化。

(3)加入TG酶處理后的蛋白體系的G′和G″模量明顯增大，黏彈性增強(qiáng)，表明TG酶的添加可改善不溶性蛋白的凝膠特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為不溶性蠶蛹蛋白質(zhì)的加工提供一定的理論參考。