黑果枸杞多酚吸附分離特性及抗氧化性研究

武蕓，王春林，王麗朋，張臘臘，胡浩斌

1(隴東學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 慶陽，745000)2(隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽，745000)

茄科枸杞屬植物黑果枸杞是重要的藥食同源植物[1-2]，果實營養(yǎng)豐富、因其具有抗氧化[3-4]、抗動脈粥樣化[5]、抗炎[6]、抗疲勞[7-8]、增強腸道屏障功能[9]、防治心腦血管疾病[10]、防痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[11]等功效，而成為現(xiàn)階段枸杞栽培與育種的熱點。經(jīng)查閱大量文獻，有關(guān)黑果枸杞的研究多為育種、栽培種植[12-13]，化學(xué)成分多見花青素[14-16]、多糖[17-18]等。多酚是一類含有羥基和苯環(huán)的極性化合物，近年來，由于其在抗炎、抗氧化、抗腫瘤等方面顯示出良好作用而具有廣泛的應(yīng)用前景[19]，成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一，被稱為繼膳食纖維之后的“第七類營養(yǎng)素”[20]。關(guān)于黑果枸杞多酚純化分離研究未見報道。

本文采用靜態(tài)吸附法比較了9種大孔樹脂對黑果枸杞粗多酚的吸附、解吸性能，重點研究了HPD500大孔樹脂對黑果枸杞多酚的吸附的動力學(xué)、熱力學(xué)特性、吸附機理、動態(tài)純化工藝條件，并對純化多酚進行了抗氧化性分析。研究結(jié)果有利于開發(fā)黑果枸杞資源，提高其經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物原料，2018年6月至8月，課題組成員考察并采集于甘肅省民勤縣，經(jīng)隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院副教授馬世榮鑒定。低溫鼓風(fēng)干燥后機械粉碎、0～5 ℃密封保存、備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110831-201605，質(zhì)量分數(shù)90.8%)，購于中國食品藥品鑒定研究所。實驗用大孔樹脂，購于滄州寶恩化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FZ102微型植物試樣粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；BSA224S型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SB-5200DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；800離心機，常州國華電器有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生儀器廠；7230G可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；CHA-S氣浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；精密蠕動泵BT100-2 J/YZ1515x，保定蘭格恒流泵有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠；PHS-3C酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

實驗中所用9種大孔樹脂名稱和性質(zhì)如表1所示，樹脂預(yù)處理方法參考相關(guān)文獻[21]。

1.3.2 黑果枸杞多酚粗提液的制備

以60%(體積分數(shù))乙醇為溶劑，在最佳工藝條件下進行超聲輔助提取，將提取液減壓濃縮至無醇味，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容、搖勻，備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及多酚質(zhì)量濃度的測定

配制9.325～65.276 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用福林酚法[22]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.012 65C+0.025 58(R=0.998 77)，實驗中所測各種測定液多酚濃度均以沒食子酸當(dāng)量計。

采用福林酚法測定實驗中各種測定液(提取液、靜態(tài)吸附前、后溶液、動態(tài)吸附上樣液與洗脫液、純度測定溶液)的多酚濃度，并根據(jù)公式(1)計算相應(yīng)溶液的多酚質(zhì)量濃度Y[22]：

(1)

式中：Y=C0、Ce、Cd、Cg等，表示各種測定液的多酚質(zhì)量濃度，mg GAE/mL；C，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的質(zhì)量濃度，μg/mL；DF，稀釋倍數(shù)；V，各種測定液的總體積，mL。

1.3.4 靜態(tài)吸附解吸實驗

準(zhǔn)確稱取2.0 g不同類型的大孔樹脂于錐形瓶中，分別加入一定濃度的黑果枸杞多酚稀釋液50 mL，在轉(zhuǎn)速 120 r/min，25 ℃下氣浴振蕩24 h，測定并計算吸附前、后溶液中多酚的質(zhì)量濃度。樹脂吸附達到飽和后，用蒸餾水沖洗除去樹脂表面殘余樣品，以50 mL 60%乙醇為溶劑，保持轉(zhuǎn)速120 r/min、25 ℃氣浴振蕩進行解吸，24 h后，測定并計算解吸液中多酚的質(zhì)量濃度，各種大孔樹脂對黑果枸杞多酚的吸附量、吸附率與解吸率計算如公式(2)～公式(4)所示：

(2)

(3)

(4)

式中：Q，吸附量，mg/g；C0、Ce，吸附起始及終了時吸附液中的多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；W，樹脂質(zhì)量，g；V0，吸附液體積，mL；E，吸附率，%；P，解吸率，%；Cd，解吸終了時解吸液中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd，解吸液體積，mL。

1.3.5 吸附動力學(xué)實驗

稱取2.0 g 處理好的HPD500大孔樹脂于三角瓶中，加入50 mL一定濃度的黑果枸杞多酚稀釋液，以120 r/min的轉(zhuǎn)速下恒溫氣浴振蕩，溫度為25 ℃，每隔30 min取1 mL上清液測定，計算吸附量，以吸附時間為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)繪制靜態(tài)吸附曲線，采用公式(5)、公式(6)描述吸附過程并建立動力學(xué)方程。

1.3.6 吸附熱力學(xué)實驗

準(zhǔn)確稱取5份2.0 g的HPD500大孔樹脂于150 mL三角瓶中，將黑果枸杞多酚提取液稀釋為0.007、0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/mL，各加入50 mL，293 K恒溫振蕩吸附，吸附完成后測定上清液中多酚的質(zhì)量濃度并計算吸附量Qe，繪制1/Qe～1/Ce及l(fā)nQe～lnCe關(guān)系曲線，采用公式(10)和公式(11)進行等溫吸附模型擬合并建立熱力學(xué)方程。303 K、313 K、323 K操作相同。

1.3.7 靜態(tài)吸附所用到的方程

靜態(tài)吸附用到的方程如公式(5)～公式(11)所示：

準(zhǔn)一級動力學(xué)模型

ln(Qe-Qt)=lnQe-K1t

(5)

準(zhǔn)二級動力學(xué)模型

(6)

液膜擴散模型

-ln(1-F)=kt

(7)

顆粒內(nèi)擴散模型

Qt=kt0.5

(8)

化學(xué)反應(yīng)控制模型

1-(1-F)1/3=kt

(9)

Langmuir方程

(10)

Freundlich方程

(11)

式中：Qt、Qe，HPD500樹脂對黑果枸杞多酚t時刻及吸附平衡時的吸附量，mg/g；F=Qt/Qe；Qmax，HPD500樹脂對黑果枸杞多酚的最大吸附量，mg/g；Ce，吸附平衡的多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；K1、K2，動力學(xué)參數(shù)；k，擴散系數(shù)；KL、KF，HPD500樹脂吸附黑果枸杞多酚的熱力學(xué)模型參數(shù)；1/n，樹脂吸附強度。

1.3.8 動態(tài)吸附與解吸工藝參數(shù)的考察

稱取HPD500大孔樹脂15.0 g，濕法裝柱(樹脂柱體積25 mL，高度185 mm)，層析柱規(guī)格為φ13 mm×200 mm，分別考察上樣流速(1.2、2.4、3.6、4.8 BV/h)、上樣體積、pH(2.5、4.5、6.5、8.5、10.5)、上樣液濃度(0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)對吸附率的影響。

完成動態(tài)吸附的基礎(chǔ)上，考察洗脫劑濃度(40%、50%、60%、70%、80%乙醇)和洗脫流速(1.2、2.4、3.6、4.8 BV/h)對解吸率的影響。

1.3.9 黑果枸杞多酚純度測定

將黑果枸杞多酚粗提液及動態(tài)純化后的洗脫液分別在0.05 MPa、48 ℃條件下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去溶劑，避光、25 ℃鼓風(fēng)干燥，得黑果枸杞多酚粗品與精制品，分別準(zhǔn)確稱取0.2 g，少量60%乙醇溶解，蒸餾水分別定容至100 mL，即為測試液，測定多酚濃度，采用公式(12)計算粗多酚與精制多酚的純度:

(12)

式中：w為多酚質(zhì)量純度，mg/g；Cg為粗品及精制品測試液多酚濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；100為溶液體積，mL；m，多酚質(zhì)量，0.2 g；1 000為單位換算系數(shù)。

1.3.10 純化黑果枸杞多酚抗氧化性實驗

(1)羥自由基清除實驗 參考NAGA等[23]報道的方法測定，并采用公式(13)計算黑果枸杞精制多酚及抗壞血酸的羥自由基清除率：

(13)

式中：Ax0、A0、Ax分別是510 nm處樣品本底液、空白對照液及測試液的吸光度。

(2)超氧陰離子自由基清除實驗 將5.9 mL pH=7.4的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液與0.1 mL 60 mmol/L的連苯三酚溶液在10 mL石英比色皿中迅速混合，25 ℃預(yù)熱15 min，以Tris-HCl緩沖溶液為參比，在325 nm處測其吸光度，開始計時，每隔30 s讀取1次數(shù)值A(chǔ)325 nm，至240 s時為止，ΔA0=A325 nm,240 s-A325 nm,30 s。用1 mL樣品溶液與4.9 mL上述Tris-HCl緩沖溶液代替5.9 mL緩沖溶液做相同的實驗，ΔA=A325 nm,240 s-A325 nm,30 s。通過公式(14)計算黑果枸杞精制多酚及抗壞血酸的超氧陰離子自由基清除率：

(14)

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.0 軟件繪圖和擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂篩選結(jié)果

對9種大孔樹脂進行吸附和解吸操作后評價其對黑果枸杞多酚的純化性能，結(jié)果見表1。由表1可知，HPD500是孔徑為5.5～7.5 nm的極性樹脂，對黑果枸杞多酚的吸附率為72.72%、解吸率為84.86%，比較而言，此樹脂對黑果枸杞多酚有良好的吸附和解吸效果，可能與它有較大的比表面積，能提供較多吸附位點有關(guān)。因此，筆者選擇HPD500大孔樹脂進行后續(xù)實驗，以探討其對黑果枸杞多酚的吸附分離特性。

表1 九種大孔樹脂的吸附率與解吸率

2.2 吸附動力學(xué)研究

2.2.1 吸附動力學(xué)曲線

實驗擬合得到的吸附動力學(xué)曲線見圖1。由圖1可知，吸附過程經(jīng)歷了快速吸附(0～300 min)、慢速吸附(300～720 min)、吸附平衡(720～1 440 min)3個階段，吸附速率與吸附劑表面吸附位點與固液兩相吸附質(zhì)的濃度差有關(guān)。

圖1 吸附動力學(xué)曲線

2.2.2 吸附動力學(xué)模型

采用準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型分別描述吸附過程，線性回歸得出動力學(xué)參數(shù)K1、K2、Qe，見表2。

表2 動力學(xué)模型及相關(guān)系數(shù)

根據(jù)表2，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)為0.999 24，平衡吸附量理論值為17.143 8 mg/g，表明準(zhǔn)二級動力學(xué)模型能更好地描述HPD500樹脂對黑果枸杞多酚的吸附過程，吸附過程可能通過共用電子或交換電子完成[24]。

2.2.3 吸附控制機制的分析

相關(guān)文獻顯示，一般大孔樹脂吸附過程由外擴散、液膜擴散、顆粒內(nèi)擴散、吸附質(zhì)與大孔樹脂內(nèi)部活性基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)4個連續(xù)的步驟構(gòu)成[25]?？赏ㄟ^快速混合消除外擴散對吸附速率的影響，因此，考慮后3步的吸附控制情況[26]。

將動力學(xué)實驗數(shù)據(jù)通過公式(7)～公式(9)分別進行線性擬合，結(jié)果見表3，繪制顆粒內(nèi)擴散模型曲線，如圖2所示。

表3 HPD500樹脂對黑果枸杞多酚擴散擬合方程及相關(guān)參數(shù)

根據(jù)EWA等的研究成果，如果顆粒內(nèi)擴散模型為唯一控制步驟，模型擬合得到的結(jié)果應(yīng)為1條曲線，而且經(jīng)過原點[27]。由圖2可以看出，顆粒內(nèi)擴散模型曲線近似為2條相交且不經(jīng)過坐標(biāo)原點的直線，所以不是唯一控制步驟，表3中3種模型的相關(guān)系數(shù)均大于0.9小于1，順序為：化學(xué)反應(yīng)模型>液膜擴散>顆粒內(nèi)擴散，說明化學(xué)反應(yīng)模型對吸附過程控制顯著且受其余二者影響。

圖2 HPD500大孔樹脂吸附黑果枸杞多酚的顆粒內(nèi)擴散模型動力學(xué)曲線

2.3 吸附熱力學(xué)研究

2.3.1 靜態(tài)吸附等溫線

將靜態(tài)等溫實驗所得1/Qe～1/Ce及l(fā)nQe～lnCe關(guān)系分別進行線性擬合，根據(jù)Langmuir方程和Freundlich方程計算模型參數(shù)，結(jié)果如表4、表5所示。

表4 Langmuir熱力學(xué)方程及相關(guān)系數(shù)

表5 Freundlich熱力學(xué)方程及相關(guān)系數(shù)

根據(jù)表4、表5，Langmuir方程較Freundlich方程更好地描述了吸附過程，R2均大于0.99。293～323 K的吸附等溫線表明平衡吸附量隨溫度的升高而減小，Langmuir方程擬合參數(shù)KL、qm隨溫度的變化情況與此相符。

2.3.2 靜態(tài)吸附熱力學(xué)參數(shù)

吸附自由能變ΔG通過Gibbs方程(15)計算[28]：

(15)

式中：X，平衡溶液中吸附質(zhì)的摩爾分數(shù)；Q，吸附量；T，熱力學(xué)溫度，K。

若吸附等溫線符合Langmuir，ΔG采用公式(16)計算，其中K為Langmuir方程中的模型參數(shù)KL，R是氣體常數(shù)[8.314 J/(mol·K)]。

ΔG=RTlnK

(16)

吸附焓變ΔH及吸附熵變ΔS采用Gibbs-Helmholtz方程[29]得到，如公式(17)所示，結(jié)果見表6。

ΔS=(ΔHΔG)/T

(17)

由表6可知，ΔG<0，ΔH<0，ΔS<0說明HPD500大孔樹脂吸附黑果枸杞多酚可自發(fā)進行且為放熱熵減過程，降低溫度可增強吸附效果、提高吸附率。

2.4 動態(tài)吸附、解吸工藝參數(shù)

2.4.1 上樣流速和上樣體積

按“1.3.8”中的方法分別以1.2、2.4、3.6、4.8 BV/h的上樣流速上樣，其泄漏點(流出液濃度達到上樣濃度的10%)分別為240 mL(9.6 BV)，200 mL(8.0 BV)，160 mL(6.4 BV)，110 mL(4.4 BV)可見到達泄漏點時的上樣量隨上樣流速的增大逐漸減小，結(jié)果見圖3。由于上樣速度過快，黑果枸杞多酚與樹脂接觸時間較短，導(dǎo)致吸附率較低，上樣速度過慢，多酚與樹脂充分接觸，實驗循環(huán)周期延長，綜合考慮，選取上樣流速為2.4 BV/h為宜，上樣量8.0 BV。

圖3 不同流速的吸附泄漏曲線

2.4.2 上樣pH

按“1.3.8”中的方法考察pH對吸附率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，HPD500樹脂對黑果枸杞多酚的吸附率在酸性條件較高且變化幅度不大，黑果枸杞粗多酚樣品原液pH為6.5，綜合考慮實驗中保持黑果枸杞多酚原液pH。

圖4 上樣液pH對吸附率的影響

2.4.3 上樣濃度

上樣濃度對吸附率的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，吸附率隨上樣濃度的增加先增大后減小，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度增至0.8 mg/mL時，吸附率達到了最大值94.29%，原因是上樣液濃度較低時，吸附推動力小，吸附速率小，相同時間內(nèi)導(dǎo)致吸附率較小，上樣濃度增大，上樣液中雜質(zhì)也隨之增多，與多酚形成競爭吸附、從而影響吸附效果。因此，選擇0.8 mg/mL為適宜的上樣濃度。

圖5 上樣液濃度對吸附率的影響

2.4.4 洗脫劑濃度

以上述得到的較佳動態(tài)吸附條件對黑果枸杞多酚粗提液進行吸附并計算吸附量，固定洗脫速率為2.4 BV/h，考察洗脫劑濃度(體積分數(shù))對解吸率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 洗脫劑體積分數(shù)對解吸率的影響

由圖6可知，隨著洗脫劑濃度的增加，解吸率先增大后減小且變化速率較快、曲線較陡峭，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為60%時，此時洗脫劑與黑果枸杞多酚極性相似使解吸率達到最大值87.75%。因此，洗脫劑選用60%乙醇。

2.4.5 洗脫劑流速

60%乙醇不同洗脫流速下的洗脫曲線見圖7。由圖7可以看出，在4種流速下，多酚洗脫流出液區(qū)間約為10～150 mL時，流出130 mL后樹脂中的多酚量極少，因此，選用10～130 mL為純化多酚流出液收集區(qū)間，計算10～130 mL不同洗脫劑流速下獲得的多酚洗脫量，發(fā)現(xiàn)流速為2.4 BV/h時多酚的洗脫量最大，為123.06 mg，且峰較集中、沒有明顯拖尾現(xiàn)象。因此確定2.4 BV/h為洗脫流速。

圖7 動態(tài)洗脫曲線

2.5 HPD500大孔樹脂對黑果枸杞多酚純化效果檢驗

黑果枸杞多酚純化前后純度測定結(jié)果如表7所示。由表7可以看出，經(jīng)過HPD500大孔樹脂分離純化后，純度提高了2.36倍，表明HPD500大孔樹脂對黑果枸杞多酚有較好的純化作用，能夠?qū)崿F(xiàn)成分的富集。

表7 純化前后總多酚的純度

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 羥自由基清除能力

羥自由基清除實驗結(jié)果見圖8。由圖8可以看出，羥自由基清除率隨黑果枸杞多酚和抗壞血酸濃度的增大而增大，通過清除率-濃度回歸曲線計算黑果枸杞多酚及抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度分別是1.309 0、5.642 0 mg/mL，可見，黑果枸杞多酚對羥自由基的清除能力強于抗壞血酸。

圖8 黑果枸杞多酚及抗壞血酸的羥自由基清除能力

2.6.2 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基的清除實驗結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，黑果枸杞多酚質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL、抗壞血酸質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL時，二者清除率均達到了100%，通過清除率-濃度回歸曲線計算黑果枸杞多酚及抗壞血酸的半數(shù)抑制濃度IC50分別是0.070 8、0.007 26 mg/mL，可見黑果枸杞多酚對超氧陰離子自由基的清除作用弱于抗壞血酸。

圖9 黑果枸杞多酚及抗壞血酸的超氧陰離子自由基清除能力 scavenging force of Lycium ruthenicum polyphenols and ascorbic acid

3 結(jié)論

通過對9種大孔樹脂吸附分離效果的考察，確定了HPD500為黑果枸杞粗多酚較佳的分離樹脂。準(zhǔn)二級動力學(xué)模型能很好地描述了HPD500樹脂對黑果枸杞多酚的吸附過程(R2>0.99)，動力學(xué)參數(shù)為K2=0.020 2；吸附熱力學(xué)實驗表明，吸附過程符合Langmuir方程(R2>0.99)，且為自發(fā)放熱過程。

HPD500樹脂動態(tài)純化黑果枸杞多酚的較佳工藝條件為：8 BV質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的黑果枸杞粗提液為上樣液，上樣流速為2.4 BV/h，60%(體積分數(shù))的乙醇溶液以2.4 BV/h流速洗脫，用量6 BV，純度較純化前提高了2.36倍。

黑果枸杞多酚有較強的羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力，可作為潛在的抗氧化劑來源。