免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的研究進(jìn)展及在中藥中的應(yīng)用展望

趙志高,駱驕陽(yáng)，付延偉，徐媛媛,王長(zhǎng)健,楊世海，楊美華*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

隨著中藥行業(yè)逐漸國(guó)際化，中藥材不僅在中國(guó)受到關(guān)注，在全世界的地位也不斷上升。在中藥材使用量及出口量增加的同時(shí)，其質(zhì)量和安全問(wèn)題也逐漸被重視，其中農(nóng)藥殘留是被關(guān)注的焦點(diǎn)之一。不同國(guó)家和地區(qū)的相關(guān)組織對(duì)農(nóng)藥殘留問(wèn)題高度重視，《中國(guó)藥典》、《歐洲藥典》等對(duì)農(nóng)藥殘留做出了限量規(guī)定[1]。農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的儀器分析技術(shù)有氣相色譜法[2]、液相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-5]等。儀器分析方法具有定量準(zhǔn)確、高分辨的特性，但也存在一定的局限性，比如儀器體積大，檢測(cè)用時(shí)久，費(fèi)用昂貴，難以滿足快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。免疫分析技術(shù)是基于抗體與抗原或半抗原之間的特異性識(shí)別反應(yīng)而建立的一種生物化學(xué)分析法，相比于儀器檢測(cè)，免疫分析在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用更加快捷、經(jīng)濟(jì)，可實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前免疫方法更多地應(yīng)用于環(huán)境和食品檢測(cè)[6-7]領(lǐng)域，在中藥材中的應(yīng)用有很大的發(fā)展空間。本文對(duì)免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，對(duì)比分析了不同免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)免疫分析技術(shù)在中藥農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期為中藥安全用藥提供保障。

1 免疫分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)及特點(diǎn)

免疫分析技術(shù)最初主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，大多用于腫瘤標(biāo)記物篩查和激素類物質(zhì)的檢測(cè)[8-9]，該技術(shù)以抗原抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記達(dá)到信號(hào)檢測(cè)的目的。目前，免疫分析技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域受到重視，如藥物分析[10]、外源污染物分析[11]、文物保護(hù)[12]等領(lǐng)域。

免疫分析技術(shù)作為一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)，近年來(lái)在農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用飛速發(fā)展。免疫分析技術(shù)起初只能進(jìn)行單一組分檢測(cè)，且多為定性分析，隨著新技術(shù)和檢測(cè)儀器的開發(fā)和不斷優(yōu)化，多組分高通量檢測(cè)的免疫分析技術(shù)正在不斷地被開發(fā)應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)半定量或定量分析[13-14]。

2 應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的免疫分析技術(shù)

表1 免疫分析方法的主要類型及初步歸類Table 1 Main types and classification of immunoassay techniques

2.1 放射免疫分析

放射免疫分析(RIA)技術(shù)是將放射性同位素與免疫分析方法相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)采用放射性同位素取代分子中的原子，通過(guò)檢測(cè)放射信號(hào)進(jìn)行分析檢測(cè)，方法靈敏度高，且不易受到干擾，在生物活性物質(zhì)檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。Yamamoto等[38]利用放射免疫法分析并確定了海星中的松弛素樣促性腺肽為第一個(gè)無(wú)脊椎動(dòng)物促性腺激素。Chang等[39]通過(guò)放射免疫分析技術(shù)研究了芍藥中的有效成分芍藥總苷抗關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。RIA的放射性會(huì)對(duì)環(huán)境和人類造成一定的威脅，在農(nóng)藥殘留方面的應(yīng)用存在一定的局限性。隨著科技的發(fā)展，人們逐漸找到替代放射性元素的標(biāo)記物，如熒光標(biāo)記物和酶標(biāo)記物等。

2.2 酶聯(lián)免疫分析

酶聯(lián)免疫分析(ELISA)是經(jīng)典的免疫分析技術(shù)，也是用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的最主要的免疫分析手段之一。ELISA主要在聚苯乙烯微孔板上進(jìn)行抗原抗體的特異性結(jié)合，根據(jù)反應(yīng)原理的不同，又分為直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法。ELISA在農(nóng)藥殘留分析方面應(yīng)用廣泛，對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯等農(nóng)藥均可進(jìn)行檢測(cè)分析[40]。Okazaki等[41]建立了一種直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，用于蔬菜中百菌清的檢測(cè)，采用百菌清類似物五氯苯酚的羧基衍生物合成百菌清半抗原，并通過(guò)免疫動(dòng)物獲得高靈敏抗體，所建立的方法快速、簡(jiǎn)單，適用于黃瓜、茄子等蔬菜中百菌清含量的測(cè)定。通過(guò)結(jié)合新型仿生材料技術(shù)，ELISA得到進(jìn)一步發(fā)展，Zhang等[6]利用分子印跡聚合物建立了一種基于仿生材料的酶聯(lián)免疫吸附法(BELISA)用于食品藥品中殺蟲劑甲萘威的檢測(cè)，并通過(guò)基于抗體的ELISA方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示BELISA方法穩(wěn)定、可靠，成本更低。仿生材料在ELISA檢測(cè)農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用是一個(gè)新的突破。

酶放大免疫分析(EMIA)技術(shù)是一種均相反應(yīng)體系的酶聯(lián)免疫方法。該方法將酶標(biāo)記于農(nóng)藥上，在同一體系中加入酶標(biāo)記農(nóng)藥、抗體和待測(cè)樣品，酶標(biāo)記農(nóng)藥與待測(cè)樣品中的農(nóng)藥分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，抗體與酶標(biāo)記農(nóng)藥的結(jié)合導(dǎo)致酶的活性中心受到影響，催化活性被抑制，隨后即可根據(jù)反應(yīng)后體系中酶的活性變化計(jì)算農(nóng)藥含量。該技術(shù)在臨床血藥濃度的檢測(cè)中是一種很好的方法[42-43]，但在中藥材農(nóng)藥殘留分析中，由于每一種待測(cè)農(nóng)藥都需要進(jìn)行酶標(biāo)記，故應(yīng)用存在一定的局限性。

2.3 熒光免疫分析

熒光免疫分析(FIA)技術(shù)是將不同的熒光素作為標(biāo)記物修飾在抗原、抗體上進(jìn)行分析檢測(cè)。主要包括熒光偏振免疫技術(shù)(FPIA)、時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)、底物標(biāo)記熒光免疫技術(shù)(SLFIA)和熒光猝滅免疫技術(shù)(FQIA)等。

2.3.1 FPIA分析FPIA是一種在均相反應(yīng)體系進(jìn)行的免疫方法，該技術(shù)將熒光偏振原理與免疫分析結(jié)合，根據(jù)熒光標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合前后偏振值發(fā)生的變化進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析[44]。Liu等[45]使用兩種不同的熒光劑標(biāo)記三唑磷半抗原，建立了一種快速均相的三唑磷農(nóng)藥熒光偏振免疫分析方法，該方法的IC50達(dá)3.62 mg/L。相比其他非均相免疫分析技術(shù)，F(xiàn)PIA反應(yīng)速度快，但靈敏度較低，仍有很大的發(fā)展空間。Wang等[46]將納米技術(shù)與熒光偏振技術(shù)結(jié)合，利用小分子納米抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體對(duì)菊酯類殺蟲劑進(jìn)行檢測(cè)，在FPIA高度依賴分子量的情況下，通過(guò)優(yōu)化，并與常規(guī)抗體對(duì)比，開發(fā)了可以滿足FPIA靈敏度要求的小分子納米抗體，方法更加綠色、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單。

2.3.2 TRFIA分析TRFIA是將熒光壽命較長(zhǎng)的稀土離子螯合物作為抗原或抗體的標(biāo)記物，通過(guò)檢測(cè)時(shí)間延遲后的熒光信號(hào)而開發(fā)的一種免疫分析方法[47]。該方法有效地降低了本底瞬時(shí)熒光的干擾，靈敏度和準(zhǔn)確性較其他熒光免疫法更高。TRFIA在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)中應(yīng)用較多，Rubio等[19]通過(guò)建立的TRFIA同時(shí)分析植物中甲萘酚、甲萘威、多菌靈的含量，結(jié)果幾乎沒(méi)有假陽(yáng)性。

2.3.3 SLFIA分析SLFIA屬于競(jìng)爭(zhēng)型免疫分析方法，其原理是對(duì)免疫反應(yīng)中的抗原或抗體進(jìn)行熒光底物標(biāo)記，此時(shí)的標(biāo)記物不具有熒光。在進(jìn)行SLFIA時(shí)，向反應(yīng)體系中加入水解酶，抗體與抗原的結(jié)合阻礙了水解酶接近熒光底物，導(dǎo)致熒光底物不會(huì)被水解，而未結(jié)合抗原或抗體上的底物則會(huì)被酶水解，釋放熒光，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)現(xiàn)待測(cè)化合物的檢測(cè)[48]。目前該方法的應(yīng)用仍存在一定局限性，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面少有報(bào)道。

曾有人問(wèn)任正非，華為成功的關(guān)鍵是什么？“還是財(cái)務(wù)體系和人力資源體系?！比握堑倪@個(gè)回答被看作是對(duì)孟晚舟的極大肯定。

2.3.4 FQIA分析FQIA將熒光猝滅與免疫技術(shù)相結(jié)合，采用金屬離子螯合物標(biāo)記抗原抗體，基于加入猝滅劑后體系發(fā)生能量轉(zhuǎn)移和熒光信號(hào)減弱的現(xiàn)象[49]進(jìn)行檢測(cè)。由于熒光分子自身存在熒光猝滅效應(yīng)，導(dǎo)致熒光檢測(cè)的靈敏度較低[50]，而直接將熒光猝滅獲得的能量轉(zhuǎn)化為檢測(cè)信號(hào)，則可大大降低熒光損耗和熒光背景的干擾，提高檢測(cè)靈敏度。FQIA技術(shù)目前多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，在農(nóng)藥方面也有部分應(yīng)用，Dahiya等[51]研究了有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的代謝物在不同溶劑中的熒光猝滅作用，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在人體中可能存在多種形態(tài)分布。Sharma等[52]在抑制熒光自猝滅的基礎(chǔ)上建立了一種高敏免疫方法用于檢測(cè)除草劑敵草隆，采用甘油優(yōu)化熒光標(biāo)記物的微環(huán)境，大大提高了反應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性。此類高靈敏的熒光猝滅法在農(nóng)藥殘留等外源污染物分析方面的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

2.4 免疫層析技術(shù)

免疫層析(IC)技術(shù)是一種將抗原與抗體的特異性與層析技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，其原理簡(jiǎn)圖如圖1所示。以待測(cè)物溶液為流動(dòng)相，反應(yīng)后標(biāo)記物在顯色帶聚集顯色，通過(guò)顯色情況進(jìn)行定性定量。標(biāo)記物的靈敏度對(duì)免疫層析技術(shù)十分重要[53]。IC具有操作簡(jiǎn)單、成本低、易攜帶等特點(diǎn)，是一種有極具優(yōu)勢(shì)的快速檢測(cè)技術(shù)[54]。根據(jù)使用的標(biāo)記物不同可將免疫層析技術(shù)分為膠體金免疫技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)、量子點(diǎn)層析技術(shù)、熒光微球?qū)游黾夹g(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)、磁珠免疫層析技術(shù)、適配體層析技術(shù)，統(tǒng)稱為免疫試紙條技術(shù)(IST)。

IST作為一種相對(duì)新穎且應(yīng)用廣泛的分析技術(shù)，近年來(lái)的發(fā)展十分迅速，起初的IST只能進(jìn)行定性分析，目前該技術(shù)已可進(jìn)行半定量或定量分析。Hua等[55]采用基于膠體金抗體探針的免疫層析技術(shù)對(duì)水樣中甲基毒死蜱進(jìn)行定性和半定量分析，甲基毒死蜱在50～12 150 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，所有反應(yīng)在10 min內(nèi)即可完成，方法簡(jiǎn)單快速。IST不僅可用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)等痕量分析，也可應(yīng)用于中藥材常量分析，Duan等[56]建立了一種試紙條技術(shù)用于雷公藤甲素的含量檢測(cè)；Zou等[57]嘗試將量子點(diǎn)試紙條結(jié)合到傳感器上檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥毒死蜱，該方法可在15 min內(nèi)完成檢測(cè)，快速且定量準(zhǔn)確；Wang等[58]將雙量子點(diǎn)與高活性納米材料結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了雙納米材料的信號(hào)放大，該方法已應(yīng)用于3種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，是一種高靈敏的可視免疫層析技術(shù)。

基于甲基對(duì)硫磷和吡蟲啉兩種農(nóng)藥發(fā)光信號(hào)出峰時(shí)間的差異，Shu等[59]建立了一種時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光免疫層析方法對(duì)兩者進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，方法對(duì)甲基對(duì)硫磷和吡蟲啉的線性范圍均為0.1～250 ng/mL，檢出限均為0.06 ng/mL，線性和靈敏度良好，并成功用于甘草和當(dāng)歸等實(shí)際樣品的檢測(cè)。Zhang等[60]將磁性材料和納米材料結(jié)合作為標(biāo)記物，制備了一種基于磁致熒光猝滅的可視化免疫層析試紙條，并對(duì)兩種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果證明該方法抗干擾能力強(qiáng)、特異性和靈敏度高。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，目前IST不僅可進(jìn)行單一農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，多組分農(nóng)殘測(cè)定的免疫分析技術(shù)也不斷被報(bào)道。Tang等[61]結(jié)合時(shí)間分辨熒光與試紙條免疫層析技術(shù)建立了一種同時(shí)檢測(cè)農(nóng)藥殘留和真菌毒素的新方法，并用于谷物中黃曲霉毒素和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)。Li等[62]將表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)與免疫分析方法相結(jié)合，用于兩種擬除蟲菊酯農(nóng)藥氯氰菊酯和順式氰戊菊酯的檢測(cè)，通過(guò)抗原和抗體的特異性結(jié)合，將已標(biāo)記金納米顆粒的抗體固定在免疫試紙條的結(jié)合墊上，同時(shí)以兩種農(nóng)藥抗原在硝酸纖維素膜上包被兩條檢測(cè)線，在層析過(guò)程中，供試液中的目標(biāo)農(nóng)藥與檢測(cè)線上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金納米顆粒標(biāo)記的抗體位點(diǎn)，以達(dá)到雙重檢測(cè)的目的。該方法對(duì)氯氰菊酯和順式氰戊菊酯的檢出限分別為2.3×10-4、2.6×10-5ng/mL，其靈敏度是酶聯(lián)免疫分析法和熒光免疫分析法的3～4倍。

適配體層析技術(shù)采用非抗體物質(zhì)作為“化學(xué)抗體”，如將從體外篩選出的單鏈寡聚核苷酸序列作為核苷酸適配體，該適配體對(duì)靶物質(zhì)識(shí)別性高、親和力強(qiáng)。以適配體代替抗體與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，省去了抗體制備步驟，且更加經(jīng)濟(jì)，同時(shí)可以避免一些結(jié)構(gòu)相似化合物存在交叉反應(yīng)的情況[63]。

2.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLISA)是將免疫分析的特異性與化學(xué)發(fā)光的高靈敏性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)采用發(fā)光劑或催化劑等化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記抗原或抗體，在進(jìn)行免疫分析時(shí)，通過(guò)測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行待測(cè)物的定量分析[64]。根據(jù)標(biāo)記對(duì)象的不同，CLISA可分為化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析[65]。CLISA方法特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度相對(duì)較快，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且費(fèi)用較低，但需要尋找合適的發(fā)光標(biāo)記物。所用發(fā)光劑的種類主要分為魯米諾類、二氧雜環(huán)丁烷類、吖啶酯類和過(guò)氧化草酸酯類等。程燕[66]建立了一種化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱，結(jié)果表明CLISA比ELISA具有更高的靈敏度，同時(shí)線性范圍較寬，適用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)是將化學(xué)發(fā)光與酶聯(lián)免疫分析法相結(jié)合的技術(shù)，相比于常規(guī)CLISA，該技術(shù)可更大程度地提高反應(yīng)靈敏度。鄒茹冰等[7]基于同時(shí)識(shí)別對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷和殺螟硫磷3種農(nóng)藥的寬譜特異性抗體，建立了一種同時(shí)檢測(cè)這3種農(nóng)藥的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法，對(duì)3種農(nóng)藥的IC50分別為5.43、1.34、1.24 μg/kg，方法線性和靈敏度良好，可用于水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

電化學(xué)發(fā)光免疫(ECLIA) 是一項(xiàng)基于電化學(xué)反應(yīng)引起化學(xué)發(fā)光而進(jìn)行分析檢測(cè)的新型技術(shù)[67]。相對(duì)于CLISA，該技術(shù)可控性更強(qiáng)，靈敏度更高，更加經(jīng)濟(jì)。單云等[68]利用石墨烯標(biāo)記抗原，在納米晶膜上建立了一種檢測(cè)蔬菜中噻蟲啉的電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，抗原與納米晶膜表面的抗體結(jié)合后，具有良好導(dǎo)電性的石墨烯可引起納米晶膜發(fā)光，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。該方法對(duì)噻蟲啉的檢測(cè)范圍為0.1～10 pg/mL，線性良好且檢出限遠(yuǎn)低于歐洲藥典的最低限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 mg/kg[69]，在中藥材檢測(cè)中的應(yīng)用前景十分廣闊。

2.6 毛細(xì)管電泳免疫分析

毛細(xì)管電泳免疫分析(CEIA)將毛細(xì)管電泳技術(shù)與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，具備良好的特異性和分離效率，可進(jìn)行多組分同時(shí)分析[70]。該技術(shù)中的免疫反應(yīng)在毛細(xì)管電泳柱前或柱內(nèi)進(jìn)行，并通過(guò)毛細(xì)管電泳將抗原、抗體與抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行分離，然后進(jìn)行定量分析。

CEIA為均相反應(yīng)體系，省去了繁瑣的洗滌和分離步驟，分析速度相對(duì)較快。同時(shí)，由于毛細(xì)管分離不同抗原抗體結(jié)合物的遷移時(shí)間不同，降低了免疫分析中的假陽(yáng)性率。張燦等[30]采用毛細(xì)管電泳免疫分析法檢測(cè)了氨基甲酸酯類農(nóng)藥西維因，儀器平衡時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間共需35 min，相比酶聯(lián)免疫分析法耗時(shí)短，同時(shí)需要的抗體相對(duì)較少。Zhang等[71]將金屬納米材料作為分析結(jié)合物，實(shí)現(xiàn)了CEIA信號(hào)的放大，提高了方法的分辨率和靈敏度，增強(qiáng)了CEIA在農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)中的實(shí)用性。

圖2 便攜式免疫芯片系統(tǒng)[76]Fig.2 Portable immune chip system[76]

2.7 免疫芯片

免疫芯片是將高特異性的免疫反應(yīng)與電子芯片技術(shù)相結(jié)合的一種高通量、高特異性的新型生物檢測(cè)技術(shù)[72]，又稱抗體芯片[73]?？贵w芯片技術(shù)主要采用微陣列點(diǎn)樣法將抗原抗體固定于玻片、硅膠板或多孔板上，使其高度集成，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)。該技術(shù)對(duì)大分子化合物和小分子化合物檢測(cè)均適用，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用最為廣泛[74]。相比于傳統(tǒng)免疫分析方法，免疫芯片的主要優(yōu)勢(shì)在于多組分同時(shí)分析和靈活便攜，且樣品用量少[75]。Lan等[31]設(shè)計(jì)了一種免疫芯片用于農(nóng)藥殘留的多組分免疫測(cè)定，該方法將抗原固定在硝酸纖維素膜上，并通過(guò)納米金進(jìn)行標(biāo)記和信號(hào)放大以提高靈敏度，對(duì)7種農(nóng)藥進(jìn)行同時(shí)分析檢測(cè)，檢出限為0.02～6.45 ng/mL，方法穩(wěn)定性良好且靈敏度得到很大提高。將免疫芯片進(jìn)一步優(yōu)化，可使檢測(cè)更加方便快捷，Lee等[76]利用表面等離子共振免疫芯片和簡(jiǎn)單的便攜式成像器，對(duì)吡蟲啉農(nóng)藥進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)器由廉價(jià)的發(fā)光二極管、窄帶濾波器和智能手機(jī)組成，原理見圖2。當(dāng)分析物置于芯片表面，光譜圖像的最亮點(diǎn)被轉(zhuǎn)移，分析物定性和半定量分析可以通過(guò)裸眼或智能手機(jī)觀察芯片上斑點(diǎn)的移動(dòng)來(lái)進(jìn)行。該方法同時(shí)檢測(cè)不同濃度的吡蟲啉農(nóng)藥的視覺(jué)檢出限約為1 ng/mL，并可通過(guò)智能手機(jī)對(duì)圖像進(jìn)一步處理，提高檢測(cè)靈敏度。這種便攜式感應(yīng)平臺(tái)具有多種優(yōu)勢(shì)，如可進(jìn)行半定量和定性分析，成本較低且可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等。但作為一項(xiàng)功能強(qiáng)大、靈活、便攜的新型產(chǎn)品，其價(jià)格仍然昂貴，在實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)方面的實(shí)用性有待提高。

2.8 免疫傳感器

免疫傳感器是將高特異性的免疫分析技術(shù)與高靈敏性的傳感器技術(shù)相結(jié)合的一種免疫分析技術(shù)。該技術(shù)以抗原抗體作為識(shí)別系統(tǒng)，傳感器作為信號(hào)放大系統(tǒng)，提高了免疫分析的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了免疫分析技術(shù)的定量分析和自動(dòng)化操作，同時(shí)免疫分析傳感器正不斷向著更加快速、簡(jiǎn)單、方便的方向發(fā)展[77]。

Maja等[78]開發(fā)了量子點(diǎn)和熒光共振能量相結(jié)合的新型納米免疫傳感器，其功能更加卓越，熒光探針亮度更高，檢測(cè)更加靈敏，多組分檢測(cè)時(shí)不同量子點(diǎn)可從一個(gè)光源激發(fā)而不產(chǎn)生發(fā)射信號(hào)重疊，結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。Patta等[79]發(fā)明了一種新型免疫傳感器用于檢測(cè)三嗪類農(nóng)藥莠去津，方法將使用靜電防氧化錳納米纖維的電化學(xué)檢測(cè)與免疫傳感器結(jié)合，進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的莠去津農(nóng)藥殘留分析，該方法性能優(yōu)越、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，定量限達(dá)0.22×10-21g/mL。Du等[37]首次將生物條形碼技術(shù)結(jié)合免疫分析技術(shù)用于農(nóng)藥三唑磷的檢測(cè)，條形碼結(jié)合微孔板用于信號(hào)放大，定量限達(dá)1.96×10-2ng/mL。崔雪妍等[80]將生物條形碼技術(shù)與免疫分析技術(shù)結(jié)合用于水果中毒死蜱的檢測(cè)，通過(guò)生物條形碼及互補(bǔ)DNA修飾的金納米顆粒偶聯(lián)抗原，并結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)構(gòu)建了新型生物傳感器，通過(guò)PCR進(jìn)行信號(hào)放大，該方法的靈敏度得到提高，定量限為0.27 ng/mL。雖然生物條形碼技術(shù)結(jié)合免疫分析的方法更加靈敏、快速，但材料制備過(guò)程復(fù)雜以及特殊耗材昂貴等因素一定程度上阻礙了該方法的普及應(yīng)用。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，目前部分免疫分析方法的靈敏度和穩(wěn)定性可媲美儀器分析技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)相對(duì)快速、便捷，有著良好的發(fā)展前景[81]。

在免疫分析原理的基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)行了拓展延伸，Tang等[82]提出了一種新型的檢測(cè)策略，將量子點(diǎn)與經(jīng)過(guò)氨基修飾的核苷酸偶聯(lián)，并使偶聯(lián)物與有機(jī)磷農(nóng)藥的DNA適配體特異性結(jié)合，隨后利用激光誘導(dǎo)的毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析檢測(cè)。目前已成功用于氧化樂(lè)果、甲拌磷、丙溴磷和水胺硫磷的測(cè)定。該方法通過(guò)改變DNA適配體序列的類型即可實(shí)現(xiàn)其與不同農(nóng)藥的特異性結(jié)合，有望成為農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的常用方法。

3 免疫方法在中藥材農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

不同的免疫方法在應(yīng)用領(lǐng)域和操作特點(diǎn)上優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，相輔相成，可以更好地發(fā)揮免疫分析方法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)。本文對(duì)近年來(lái)報(bào)道的一些免疫技術(shù)的特性及應(yīng)用進(jìn)行歸納總結(jié)，結(jié)果見表2。通過(guò)對(duì)分析的樣品的種類進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境和食品樣本中免疫分析技術(shù)有著更廣泛的應(yīng)用，如谷物、蔬菜和飲用水等。而在基質(zhì)較為復(fù)雜的中藥材中的應(yīng)用較少，但對(duì)于“藥食同源”的枸杞、人參和甘草等的研究仍有相關(guān)報(bào)道。通過(guò)對(duì)檢出限的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，ELISA、IST、CLEIA和FQIA等方法的檢出限相對(duì)較高，而免疫芯片和免疫傳感器方法的檢出限低，甚至達(dá)到皮克級(jí)以下，有著更高的靈敏度。對(duì)比分析方法的使用特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)不同分析方法在定性和定量分析中各有優(yōu)勢(shì)，如常用的經(jīng)典定量分析方法主要包括ELISA、CLEIA和FPIA等，定性研究則常采用IST技術(shù)。隨著檢測(cè)儀器配套使用的逐步推廣，一些定性研究方法如IST技術(shù)在定量檢測(cè)中逐漸大放異彩。從農(nóng)藥檢測(cè)品種來(lái)看，針對(duì)單一品種而開發(fā)的免疫分析技術(shù)逐漸被多農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)技術(shù)所替代，免疫芯片和生物傳感器技術(shù)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

表2 免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用Table 2 Application of immunoassay in pesticide detection

(續(xù)表2)

4 總結(jié)與展望

4.1 免疫分析技術(shù)檢測(cè)農(nóng)藥殘留的優(yōu)勢(shì)與主要瓶頸

免疫分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)為靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面同樣如此。常用的免疫分析方法，如酶聯(lián)免疫法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，免疫層析試紙條技術(shù)則操作簡(jiǎn)單快速，兩者均便于推廣和普及，同時(shí)也是目前免疫分析技術(shù)中應(yīng)用最廣、最貼近人們生活的免疫分析技術(shù)。另外，免疫分析新技術(shù)的開發(fā)或經(jīng)典免疫分析技術(shù)與新技術(shù)的結(jié)合，如免疫技術(shù)與電化學(xué)、光學(xué)、物理學(xué)等其他領(lǐng)域的結(jié)合應(yīng)用等，不僅大幅提高了檢測(cè)效率，還實(shí)現(xiàn)了高通量和超敏檢測(cè)。新型的標(biāo)記材料和信號(hào)放大系統(tǒng)，使得檢測(cè)靈敏度大大提高，多數(shù)免疫分析方法不僅可以達(dá)到定性分析要求，還可以進(jìn)行半定量以及定量分析。還有部分方法不需要標(biāo)記物即可進(jìn)行高靈敏的快速檢測(cè)，如免疫傳感器中的電化學(xué)傳感器和表面等離子共振傳感器，都是目前研究的熱點(diǎn)。

然而免疫分析技術(shù)的發(fā)展還存在著一些局限性和瓶頸，如ELISA需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間，免疫試紙條的準(zhǔn)確性和靈敏度偏低，目前仍多用于半定量或定性檢測(cè)[55]。而高靈敏度和高通量的新型方法功能強(qiáng)大、檢測(cè)快速，但樣品中復(fù)雜的基質(zhì)干擾問(wèn)題影響著免疫方法的開發(fā)，前期需投入大量精力，對(duì)分析方法進(jìn)行針對(duì)性地開發(fā)，實(shí)驗(yàn)消耗較大，如化學(xué)發(fā)光免疫分析中發(fā)光劑的選擇和制備、免疫芯片的集成和制備，表面等離子共振免疫傳感器的制備，大量的抗原抗體消耗等[31,66,76]，使得優(yōu)越的功能和經(jīng)濟(jì)成本仍難以兼顧，尚需進(jìn)一步改善。

目前免疫分析新方法的研究更多的是追求更高的靈敏度和便攜性，研究和制備過(guò)程投入大、成本高，多數(shù)研究對(duì)方法的抗干擾性和實(shí)際樣品檢測(cè)方面的探索較為薄弱，若要真正應(yīng)用于不同種類的基質(zhì)檢測(cè)仍需加強(qiáng)前期基礎(chǔ)研究工作。

4.2 免疫分析方法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用前景

免疫分析技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸廣泛，在農(nóng)藥殘留分析方面已有出色的成績(jī)，并主要應(yīng)用于食品以及環(huán)境樣品中農(nóng)藥殘留的分析檢測(cè)，且對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥的研究較多，其次為氨基甲酸酯類，其他類型農(nóng)藥的研究相對(duì)較少。目前免疫分析方法正向著多元化發(fā)展，其在實(shí)驗(yàn)室和市場(chǎng)檢測(cè)方面具有較大的潛力。超高的靈敏度是目前新型免疫方法的發(fā)展趨勢(shì)，然而，在進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)時(shí)，方法的穩(wěn)定性以及對(duì)檢測(cè)對(duì)象的通用性同樣重要。

中藥基質(zhì)不同于水樣和食品基質(zhì)，其成分相對(duì)復(fù)雜，往往含有皂苷、萜類、黃酮類、色素等組分，加之中藥材炮制過(guò)程中可能產(chǎn)生新的成分，產(chǎn)生基質(zhì)干擾的可能性更大。復(fù)雜的基質(zhì)對(duì)于抗原抗體反應(yīng)體系以及最后的信號(hào)檢測(cè)等過(guò)程都有很大影響，這對(duì)免疫分析技術(shù)的開發(fā)是一個(gè)挑戰(zhàn)。樣品的前處理是目前解決中藥材基質(zhì)干擾問(wèn)題的主要手段，同時(shí)，隨著免疫分析技術(shù)的發(fā)展，多種免疫分析技術(shù)靈敏度的提高，使得檢測(cè)樣品可以根據(jù)農(nóng)藥限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋，以降低基質(zhì)干擾[83]。免疫分析技術(shù)正不斷地向著更加快速、高效、高靈敏的方向發(fā)展，有望為中藥材中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供更多手段。