減壓提取與常壓提取柴胡揮發(fā)油品質(zhì)比較

薄福民，張 麗，孫 越，楊山景，封安杰，李凌軍

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumChinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]，主產(chǎn)于我國西北和華北地區(qū)，具有疏肝解郁、升舉陽氣、解熱等功效[2]。其主要成分為柴胡皂苷、揮發(fā)油、多糖、黃酮類等[3-4]，柴胡皂苷類與揮發(fā)油是其主要發(fā)揮藥效物質(zhì)[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柴胡揮發(fā)油具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗驚厥等作用，解熱作用強(qiáng)，且用量少[6]，廣泛用于臨床及制備解熱藥(如柴胡注射劑等)。由于柴胡揮發(fā)油主要為小分子物質(zhì)，常溫下性質(zhì)不穩(wěn)定，易揮發(fā)，高溫易氧化，因此不同方法提取的柴胡揮發(fā)油品質(zhì)存在一定差異。

目前，柴胡揮發(fā)油提取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、超臨界流體提取法、微波提取法和超聲提取法等[7]。由于柴胡藥材中揮發(fā)油含量低且水溶性大，工業(yè)方法多采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法，該法雖操作簡單、成本低廉，但由于揮發(fā)油長時(shí)間接觸高溫水，其中熱不穩(wěn)定成分易受熱分解，從而影響揮發(fā)油品質(zhì)，進(jìn)而影響臨床藥效。因此，優(yōu)選柴胡揮發(fā)油的提取技術(shù)，對于提高揮發(fā)油的品質(zhì)具有重要的研究意義。減壓提取是近年發(fā)展起來的較為新穎的一種提取技術(shù)，它通過調(diào)控真空度降低溶劑沸點(diǎn)，保持溶劑低溫沸騰狀態(tài)，動態(tài)提取揮發(fā)油，可有效減少熱敏性成分的破壞，提高有效成分的提取效率[8]，改善揮發(fā)油品質(zhì)。故本文通過對比兩批北柴胡在減壓和常壓條件下提取的揮發(fā)油成分、含量及其藥效，為優(yōu)選柴胡揮發(fā)油的提取工藝研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

SC 920G無線遙控真空泵系統(tǒng)(青島浩賽科技股份有限公司)；7890A/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、6890N氣相色譜儀(美國安捷倫公司)；MS205DU/A天平(十萬分之一，上海屹利科學(xué)儀器有限公司)；正己烷(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；兩批北柴胡藥材均產(chǎn)自山西運(yùn)城，分別購于安徽九合堂國藥有限公司(柴胡A，批號：20200401)和亳州中強(qiáng)中藥飲片有限公司(柴胡B，批號：191101)。

1.2 溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取莰烯9.73 mg于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配成0.973 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取正己醛16.04 mg、庚醛15.70 mg、正辛醛13.30 mg和反式-2,4-癸二烯醛14.44 mg于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，分別配成質(zhì)量濃度依次為1.604、1.570、1.330、1.444 mg/mL的對照品溶液，備用。

柴胡揮發(fā)油供試品溶液：取柴胡藥材100 g，加1 000 mL水，采用水蒸氣蒸餾法提取1 h得蒸餾液，用40 mL正己烷萃取，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水，過濾，通風(fēng)自然揮干至5 mL。精密加入0.4 mL內(nèi)標(biāo)溶液(莰烯)，混勻，定容至10 mL，過0.22 μm微孔濾膜后即得供試品溶液。

柴胡揮發(fā)油樣品液：精密稱取北柴胡藥材2份，每份100 g，加入1 000 mL水，連接真空泵系統(tǒng)，分別常壓(1.0×105Pa)和減壓(0.85×105Pa，蒸餾溫度為91～92 ℃)提取1 h得蒸餾液，再用40 mL正己烷萃取。萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水、抽濾，重復(fù)4次，通風(fēng)自然揮干至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后即得樣品液。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：采用HP-5毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×15 m，0.25 μm)；載氣為氦氣(He)，流量1 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比15∶1，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱升溫程序：初溫50 ℃，以2 ℃/min升至70 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，總分析時(shí)間42 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，連接器溫度280 ℃，溶劑延遲2 min；質(zhì)量掃描范圍m/z33～550，電子倍增器電壓為1 435 V。檢索譜庫為NIST17.L,利用色譜峰面積歸一化法進(jìn)行相對定量。

1.4 氣相色譜條件

HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：初溫50 ℃，以2 ℃/min 升至70 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比15∶1。氣化室溫度250 ℃，檢測器(FID)溫度250 ℃。

1.5 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 藥物制備分別于常壓(1.0×105Pa)和減壓(0.85×105Pa)條件下提取北柴胡揮發(fā)油蒸餾液，用正己烷萃取后脫水濃縮制得精油，備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)按劑量溶于1%的吐溫80(無菌生理鹽水配制)給藥。

1.5.2 分組、造模與給藥SD(Sprague dawley)大鼠，雄性，體質(zhì)量為220～240 g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境3 d，期間早晚各測1次肛溫，第4 d開始實(shí)驗(yàn)，給藥前12 h禁食不禁水，當(dāng)日先測2次大鼠肛溫，選取2次測量溫差在0.5 ℃內(nèi)的大鼠，取其平均值為基礎(chǔ)體溫。隨機(jī)選取6只作為空白對照組，背部皮下注射生理鹽水(5 mL/kg)，其余大鼠注射15%酵母混懸液(5 mL/kg)，致熱4 h后測定大鼠體溫，溫度升高0.8 ℃為造模成功。將造模成功的大鼠按照體溫升高值隨機(jī)分為模型對照組、常壓提取揮發(fā)油組、減壓提取揮發(fā)油組3組，每組6只。減壓提取揮發(fā)油組和常壓提取揮發(fā)油組于致熱后4 h和7 h腹腔注射給藥，每次精油給藥劑量為0.05 mL/kg。

兩批北柴胡提取的揮發(fā)油分別按上述處理進(jìn)行解熱實(shí)驗(yàn)，并于造模4 h后每小時(shí)測定大鼠體溫一次，直至各組大鼠體溫恢復(fù)正常。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取設(shè)備的選擇

實(shí)驗(yàn)中減壓提取采用可遠(yuǎn)程無線控制的SC 920G真空泵系統(tǒng)(可達(dá)到2×102Pa高真空)，該系統(tǒng)可設(shè)置固定壓力值，控制提取環(huán)境的真空度，從而達(dá)到減壓提取的目的，且設(shè)備在提取過程中壓力穩(wěn)定，適用于減壓提取柴胡揮發(fā)油。實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，壓力為1.0×105Pa和0.85×105Pa提取的柴胡揮發(fā)油中指標(biāo)成分的提取率和相對含量均較高，而在0.5×105Pa壓力下提取時(shí)則較低，推測是由于此壓力下提取溫度相對低，醛類物質(zhì)提取不完全所致，經(jīng)優(yōu)化后選擇0.85×105Pa作為減壓提取的壓力參數(shù)。

2.2 GC-MS鑒定結(jié)果與分析

取購自安徽九合堂國藥有限公司(柴胡A)和亳州中強(qiáng)公司(柴胡B)的北柴胡藥材，按照“1.2”方法制成樣品液，分別經(jīng)常壓(1.0×105Pa)和減壓(0.85×105Pa)提取后采用GC-MS分析，再通過NIST17.L譜庫檢索對樣品成分進(jìn)行解析，并利用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對含量，結(jié)果見表1。

表1 柴胡揮發(fā)油成分及相對含量Table 1 Composition and relative content of essential oil from Bupleurum Chinense (%)

(續(xù)表1)

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由表1數(shù)據(jù)可見，減壓(0.85×105Pa)和常壓(1.0×105Pa)提取的柴胡A分別分離鑒定出37、34種揮發(fā)油成分(色譜圖見圖1)，其中壬醛、4-萜烯醇和肉豆蔻醚僅存在減壓提取的揮發(fā)油中；柴胡B分別鑒定出33、35種揮發(fā)油成分，常壓提取的揮發(fā)油中無甲酸辛酯、馬兜鈴?fù)嬖?，4-二甲基庚烷、庚醇、戊基環(huán)戊環(huán)烯酮和異戊二烯氧化物-(1) 4種成分。兩種壓力下提取的柴胡揮發(fā)油存在成分差異，推測是由于常壓提取過程中成分發(fā)生氧化水解反應(yīng)，而減壓提取時(shí)可有效防止該反應(yīng)的發(fā)生[8]，并且減壓提取時(shí)由于溫度低，可保護(hù)柴胡揮發(fā)油中部分熱敏性成分免受破壞，有效防止了在提取過程中揮發(fā)油的變質(zhì)，因此改善了揮發(fā)油的品質(zhì)。

兩批北柴胡提取的揮發(fā)油中己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛含量均較高，這些成分具有解熱抗炎等作用[9-12]，可能為柴胡揮發(fā)油的有效成分，故將其作為考察柴胡揮發(fā)油品質(zhì)的指標(biāo)成分。結(jié)果顯示：柴胡A在不同壓力提取時(shí)，揮發(fā)油中此4種成分的相對含量差異較小。柴胡B在減壓提取時(shí)，反式-2，4-癸二烯醛的相對含量(9.73%)略低于常壓提取(10.96%)，但己醛、庚醛和正辛醛的相對含量(分別為21.28%、11.46%、4.57%)顯著高于常壓提取(分別為15.92%、8.88%、3.75%)，表明柴胡B在減壓條件下提取的揮發(fā)油中藥效成分相對含量高，更適用于制劑和臨床。因此，相比常壓提取，減壓提取可防止部分成分受破壞和提高有效成分的相對含量，對兩批藥材中的揮發(fā)油品質(zhì)有著不同程度的改善。

圖1 常壓(A)和減壓(B)提取柴胡A揮發(fā)油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile oil extracted from the Bupleurum A by atmospheric pressure(A) and decompression conditions(B) the peak numbers 1-52 are the same as those inTable 1

2.3 GC法考察揮發(fā)油成分含量

2.3.1 方法學(xué)考察精密吸取己醛、庚醛、正辛醛、反式-2，4-癸二烯醛對照品溶液0.05、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.2 mL，用正己烷定容至5 mL，制成5個(gè)不同濃度的對照品與內(nèi)標(biāo)混合溶液，在“1.4”條件下測定，以各化合物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：4種化合物在一定濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 9。取12份已知含量的柴胡樣品，按指標(biāo)成分分為4組，每組分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2”方法提取制備柴胡揮發(fā)油加標(biāo)供試品溶液，在優(yōu)化條件下測定，得4種指標(biāo)成分的平均回收率為97.4%～99.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.5%～3.3%，表明方法的精密度及重復(fù)性良好。

2.3.2 樣品測定稱取柴胡A、B藥材各兩份，每份100 g，連接真空控制系統(tǒng)，按“1.2”方法分別進(jìn)行常壓(1.0×105Pa)、減壓(0.85×105Pa，蒸餾溫度為91～92 ℃)提取，得4份供試品溶液，再用GC法測定己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，兩批北柴胡藥材在減壓提取時(shí)，己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛的提取量均高于常壓提取，表明減壓提取可以提高有效成分的提取率，這也較好地解決柴胡原料利用率低的問題。

表2 柴胡揮發(fā)油成分含量Table 2 Contents of essential oil of Bupleurum Chinense m/mg

2.4 柴胡揮發(fā)油對發(fā)熱大鼠的解熱作用

2.4.1 發(fā)熱模型的選擇干酵母發(fā)熱模型是通過引起注射部位的局部急性炎癥，導(dǎo)致出現(xiàn)全身性發(fā)熱反應(yīng)，是最常用的發(fā)熱模型之一[13]，其致熱成分主要為全菌及莢膜多糖、蛋白質(zhì)，發(fā)熱初起可見短暫性體溫降低，之后體溫旋即升高，至體溫高峰階段進(jìn)入平臺期，維持?jǐn)?shù)小時(shí)后體溫回落，對解熱效果探索的相關(guān)實(shí)驗(yàn)具有獨(dú)特優(yōu)勢[14]，是評價(jià)中藥提取物以及中藥復(fù)方解熱作用最常用的模型[15]。因此本研究采用干酵母誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型，模型熱勢相對較高且持久，適合考察柴胡揮發(fā)油的解熱作用。

2.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇本實(shí)驗(yàn)按隨機(jī)化原則將受試大鼠隨機(jī)分配到不同水平組，各組接受不同的處理，通過比較單個(gè)處理因素各個(gè)水平組間的均數(shù)差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義來分析處理因素的效應(yīng)。這種設(shè)計(jì)僅涉及一個(gè)處理因素，但該因素有兩個(gè)或多個(gè)水平，因此又稱為單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)算每只動物各時(shí)間點(diǎn)體溫與致熱前基礎(chǔ)體溫的差值作為體溫增高值，各組體溫增高值數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析兩批柴胡的解熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，與空白組相比，模型組在致熱5～11 h內(nèi)體溫升高顯著(P<0.01)，表明造模成功；常壓給藥組與減壓給藥組大鼠在致熱5～10 h內(nèi)解熱作用明顯，說明常壓提取和減壓提取的柴胡揮發(fā)油均具有較強(qiáng)的解熱作用。在致熱10 h時(shí)，柴胡A采用減壓提取的揮發(fā)油解熱效果(P<0.01)與常壓提取的揮發(fā)油解熱效果(P<0.05)具有顯著性差異(P<0.01)，柴胡B采用減壓提取的揮發(fā)油解熱效果(P<0.01)比常壓提取(P<0.05)更為顯著，表明兩批柴胡在減壓條件下提取的揮發(fā)油解熱藥效均優(yōu)于常壓提取。

表3 柴胡揮發(fā)油對發(fā)熱大鼠模型體溫的影響Table 3 Effect of volatile oil from Bupleurum Chinense on body temperature of febrile rat model

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS法分析了北柴胡在不同壓力下提取的揮發(fā)油成分及其相對含量，采用GC法建立了己醛、庚醛、正辛醛和反式-2，4-癸二烯醛的含量測定方法，測定不同壓力下?lián)]發(fā)油成分的提取效率，并制備干酵母發(fā)熱大鼠模型考察了不同壓力下提取的柴胡揮發(fā)油解熱效果。結(jié)果表明，減壓提取能有效減少熱敏性成分被破壞，提高有效成分的提取效率，提取的柴胡揮發(fā)油具有更顯著的藥效，品質(zhì)優(yōu)于常壓提取。同時(shí)，減壓提取可有效解決柴胡原料利用率低的問題，因此是一種較為理想的柴胡揮發(fā)油提取技術(shù)。