綜合線性定量指紋法評(píng)價(jià)退熱解毒注射液融合指紋圖譜研究

章 越，蘭麗麗，鞏丹丹，孫國(guó)祥

(沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

退熱解毒注射液是一種提取自中藥的現(xiàn)代制劑，由金銀花、連翹、牡丹皮、蒲公英、金錢草、柴胡、夏枯草、石膏8味藥材組成，用于病毒性感染、不明原因高熱、急慢性炎癥等，特別適用于抗生素耐藥或過敏患者[1]。由于其療效確切、作用快速、生物利用度高，故廣泛應(yīng)用于臨床。據(jù)報(bào)道，在此次新型冠狀肺炎疫情中，退熱解毒注射液也發(fā)揮了重要的治療作用[2-3]。目前，中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅采用綠原酸含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，已有文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]也多基于1種或幾種有效成分的定量分析進(jìn)行質(zhì)量控制，但對(duì)于成分多樣、機(jī)制復(fù)雜的中藥制劑來說，這種控制模式顯然是不夠完善的。近年來，指紋圖譜技術(shù)由于其整體性、模糊性、可量化等特點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外廣泛接受并收載于各國(guó)藥典及相關(guān)法規(guī)中的中藥質(zhì)控最有效的綜合模式之一[7-9]。但指紋圖譜建立后，如何利用其豐富的化學(xué)信息來全面評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量以及獲取相關(guān)的藥效活性信息極為關(guān)鍵。目前，色譜指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)方法有相關(guān)系數(shù)法、夾角余弦法、Nei系數(shù)法等[10-12]，但均以定性評(píng)價(jià)為主，難以展示樣品的整體化學(xué)成分含量差異。本文通過建立多波長(zhǎng)融合指紋圖譜來全面表征樣品的化學(xué)成分信息，并提出了一種新的相似度評(píng)價(jià)方法——綜合線性指紋法，從整體模式上定性定量評(píng)價(jià)不同批次樣品的質(zhì)量。該方法提供了綜合線性定性相似度(Sl)、綜合線性定量相似度(Pl)和指紋變異系數(shù)(α)3個(gè)主要參數(shù)，可為有效控制藥物質(zhì)量提供有益參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 綜合線性指紋法的理論

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1.2 儀器與試劑

安捷倫1100型液相色譜儀(配在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣裝置)，Agilent Chemstation(Edition C.01.07)網(wǎng)絡(luò)工作站；乙腈和甲醇(色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司)；磷酸(色譜純，天津科密化學(xué)試劑公司)；庚烷磺酸鈉(山東禹城市中美色譜產(chǎn)品廠)；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH，奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)所用去離子水及其他化學(xué)品均為分析純級(jí)。退熱解毒注射液(S1～S10)、退熱解毒中間體(S11～S20)由西安高科陜西金方藥業(yè)有限公司提供；綠原酸(CHA，批號(hào)：110753-201817)、連翹酯苷A(FA，批號(hào)：111810-201606)、丹皮酚(PA，批號(hào)：110708-201407)、柴胡皂苷D(SD，批號(hào)：110778-201711)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 溶液配制

樣品溶液：取退熱解毒注射液適量，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液即得。對(duì)照品溶液：分別稱取綠原酸、連翹酯苷A、丹皮酚、柴胡皂苷D的對(duì)照品適量，精密稱定，加無水甲醇溶解，超聲并定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為160、200、60、200 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.4 色譜條件

COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)色譜柱；流動(dòng)相：A為0.2%磷酸-水(含5 mmol/L庚烷磺酸鈉)溶液，B為乙腈-甲醇(9∶1)；梯度洗脫程序：0～10 min，96%～89%A；10～35 min，89%～80%A；35～45 min,80%～55%A；45～55 min,55%～45%A；55～70 min,45%A。流速1.0 mL/min，柱溫為(35±0.15) ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)為210、254、265、330、360 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜分析

圖1 退熱解毒注射液和中間體樣品代表指紋圖譜 及對(duì)照品色譜圖Fig.1 Representative fingerprints and chromatograms of the reference substance of Tuire Jiedu injection and intermediate samples

2.1.1 方法學(xué)驗(yàn)證取S1供試品溶液、各對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，通過對(duì)比保留時(shí)間和在線紫外光譜定性，考察系統(tǒng)適用性(圖1)，由于圖中綠原酸峰強(qiáng)度適中且與相鄰峰分離較好，因此選其為參照物峰。精密吸取S1供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，考察方法的精密度。結(jié)果顯示，以綠原酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明系統(tǒng)進(jìn)樣精密度良好；平行制備6份S1供試品溶液，每份平行測(cè)定2次，記錄色譜圖考察方法的重復(fù)性。結(jié)果共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD小于3%，表明方法的重復(fù)性良好；對(duì)同一S1供試品溶液，分別在0、5、10、15、25 h測(cè)定5次，記錄色譜圖，考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果各指紋峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明溶液的穩(wěn)定性良好。由此可見，本研究所建立的分析方法適用于指紋圖譜分析。

2.1.2 五波長(zhǎng)融合指紋圖譜建立眾所周知，同一組分在不同紫外波長(zhǎng)下表現(xiàn)出不同的吸收特性。由于退熱解毒注射液成分復(fù)雜，主要包括有機(jī)酸類、黃酮類、酚類、萜類等。樣品中活性成分綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)在330 nm左右；柴胡皂苷D在254 nm有最大吸收峰；丹皮酚、連翹酯苷A、蘆丁、木犀草苷等分別在274、330、260、360 nm處有吸收。顯然，單一波長(zhǎng)表達(dá)的信息量有限，為了獲得更全面和更真實(shí)的樣本信息，研究采用DAD檢測(cè)器記錄190～400 nm的紫外光譜(圖2)，并根據(jù)圖譜選取化學(xué)成分紫外吸收光譜特征較強(qiáng)的5個(gè)(210、254、265、330、360 nm)波長(zhǎng)，通過融合策略將每個(gè)樣本在5個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的積分信號(hào)融合成一個(gè)統(tǒng)一的色譜指紋圖譜。融合方法的原理與三維光譜沿波長(zhǎng)軸的投影原理一致(圖2)。具體步驟為：整個(gè)色譜圖數(shù)據(jù)包含融合基線和融合峰兩部分；首先，5個(gè)波長(zhǎng)的基線數(shù)據(jù)最大值形成一個(gè)新基線；然后根據(jù)融合基線上的保留時(shí)間對(duì)色譜峰排序，將匹配組內(nèi)不同波長(zhǎng)的最大峰指定為融合峰。融合過程采用孫國(guó)祥課題組開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)4.0”軟件執(zhí)行，當(dāng)融合時(shí)窗為0.2 min時(shí)，有效峰數(shù)目與總峰數(shù)比值達(dá)到最高且每個(gè)峰均具有很高的匹配度，與其他時(shí)間窗相比，可減少雜峰的影響，充分保留有效峰信息。

圖2 多波長(zhǎng)融合指紋圖譜原理示意圖Fig.2 Principle of multi-wavelength fusion fingerprint(min×nm×absorbance)

圖3 20批樣品的HPLC融合指紋圖譜Fig.3 HPLC multi-wavelength fusion fingerprints of 20 batches of sampes

2.1.3 五波長(zhǎng)融合指紋圖譜評(píng)價(jià)利用綜合線性量化指紋法對(duì)20批樣品的五波長(zhǎng)融合指紋圖譜(圖3)進(jìn)行評(píng)價(jià)，參考指紋圖譜由20批樣品的平均值產(chǎn)生。結(jié)果顯示，20批樣品的線性定性相似度Sl值均高于0.970，α值均低于0.1，表明所有樣品中化學(xué)成分的數(shù)量和比例相近。從線性定量相似度Pl%數(shù)據(jù)可見，不同批次樣品間具有顯著性差異，有利于將所有樣本劃分為不同等級(jí)(表2)。10批注射液樣品被分為5個(gè)等級(jí)，其中S8質(zhì)量中等(5級(jí))，S5質(zhì)量良好(4級(jí))，S9質(zhì)量好(3級(jí))，其余樣品質(zhì)量為很好及以上(1級(jí)和2級(jí))。10批中間體樣品被劃分成4個(gè)等級(jí)，其中S12、S14、S18、S20為4級(jí)，S11和S15為3級(jí)，其余樣品劃分成1級(jí)和2級(jí)。S8由于化學(xué)成分總體含量顯著低于參考指紋圖譜(Pl%=70.8)而被評(píng)價(jià)為5級(jí)。不同批次樣品的評(píng)價(jià)等級(jí)不同，可能是由于生產(chǎn)工藝或者原料藥質(zhì)量差異所致。另外，10批注射液樣品的平均定量相似度為91.0%，10批中間體的平均定量相似度為106.8%，可見從中間體制成注射液的工藝過程中，整體化學(xué)成分的含量有所下降，據(jù)此可進(jìn)一步對(duì)其工藝過程進(jìn)行調(diào)整或從原料藥源頭進(jìn)行質(zhì)量控制，從而提升樣品質(zhì)量水平。綜上所述，綜合線性量化指紋法是全面監(jiān)控不同批次樣品質(zhì)量的有力工具。

表2 綜合線性指紋法評(píng)價(jià)20批樣品的質(zhì)量結(jié)果Table 2 Comprehensive linear quantitative fingerprinting method to evaluate the quality and IC50 values of 20 batches of samples

2.2 指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.2.1 方法學(xué)驗(yàn)證取綠原酸、連翹酯苷A、丹皮酚、柴胡皂苷D對(duì)照品適量，分別用甲醇配成6個(gè)不同系列濃度對(duì)照品溶液，平行測(cè)定2次，以對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)平均峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再以10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算定量下限(LOQ)，以S/N=3計(jì)算檢出限(LOD)。另外，平行制備6份已知含量的供試品溶液，分別向其中加入各對(duì)照品溶液適量，按“1.3”方法處理并測(cè)定，計(jì)算各成分回收率。結(jié)果顯示，4個(gè)指標(biāo)成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均不低于0.999 9，LOD和LOQ分別為0.18～10.03、0.58～30.08 μg/mL，平均回收率分別為100%、98.1%、98.6%、97.9%(表3)。由此可見，本方法的準(zhǔn)確度良好，對(duì)高效液相色譜定量分析具有足夠的可靠性和準(zhǔn)確度。

表3 指標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢出限和定量下限結(jié)果Table 3 Linear equations,correlation coefficients,linear ranges,recoveries,LODs and LOQs of 6 markers compounds

2.2.2 指標(biāo)成分定量分析對(duì)20批樣品采用本方法在優(yōu)化條件下進(jìn)行定量分析(表4)，得綠原酸、連翹酯苷A、丹皮酚、柴胡皂苷D的平均含量分別為762.00、249.89、74.73、321.54 μg/mL，其中綠原酸的平均含量最高，丹皮酚的平均含量最低。不同批次樣品4個(gè)指標(biāo)成分的總含量有明顯差異(RSD>12%)，這可能與原料藥產(chǎn)地、采收季節(jié)、制劑生產(chǎn)工藝等差異因素有關(guān)。其中S8總含量明顯低于其他樣品，S20的總含量高于其他樣品，并在指紋圖譜評(píng)價(jià)過程中發(fā)現(xiàn)S8的Pl%最低，而S20的Pl%最高，由此可見指標(biāo)成分定量結(jié)果與指紋圖譜的定量評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。此外，當(dāng)比較同一批次注射液和中間體樣品時(shí)(比如S1和S11，S2和S12等)，可發(fā)現(xiàn)中間體的六指標(biāo)成分含量總和高于對(duì)應(yīng)的注射液樣品，表明在中間體制成注射液的工藝過程中，指標(biāo)成分含量有所下降。

表4 4個(gè)成分的定量結(jié)果Table 4 Quantitative results of 4 components ρ/(μg·mL-1)

(續(xù)表4)

圖4 指標(biāo)定量結(jié)果與五波長(zhǎng)下指紋圖譜定量結(jié)果 的相關(guān)性研究Fig.4 Correlation study between index quantitative results and fingerprint quantitative

2.2.3 指標(biāo)成分定量結(jié)果與指紋圖譜定量參數(shù)的相關(guān)性由20批樣品的指紋圖譜評(píng)價(jià)結(jié)果可知，樣品質(zhì)量等級(jí)差異主要來源于Pl%，說明Pl%在指紋圖譜評(píng)價(jià)中起重要作用。為進(jìn)一步探索指標(biāo)成分定量結(jié)果和指紋圖譜定量評(píng)價(jià)之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)以每個(gè)樣本4個(gè)成分的含量總和P4c為縱坐標(biāo)，以不同波長(zhǎng)下的定量相似度(Pl%-fusion,Pl%-210 nm,Pl%-254 nm，Pl%-265 nm,Pl%-330 nm,Pl%-360 nm)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(圖4)，得到的相關(guān)系數(shù)(r2)均高于0.84，特別是Pl-fusion和P4c之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.896 4，這表明指紋圖譜的定量評(píng)價(jià)與多組分的定量分析間具有較好的相關(guān)性。對(duì)于大多數(shù)中藥來說，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏常使其定量分析變得困難，而綜合線性量化指紋法能夠全面反映樣品中的共有指紋峰含量信息，是一種簡(jiǎn)便、快速的潛在替代方法。

3 結(jié) 論

本文基于退熱解毒注射液樣品不同化學(xué)成分的紫外吸收特征，選取具有特征性和互補(bǔ)性的5個(gè)波長(zhǎng)(210、254、265、330、360 nm)下的色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)融合，得到的融合指紋圖譜能夠避免單一波長(zhǎng)下信息的缺失，更加全面和真實(shí)地反映樣品質(zhì)量。并首次提出了綜合線性指紋圖譜評(píng)價(jià)方法，該方法科學(xué)地提供了綜合線性定性相似度(Sl)、綜合線性定量相似度(Pl%)和指紋變異系數(shù)(α)3個(gè)評(píng)價(jià)參數(shù)，并成功地將其應(yīng)用于樣品指紋圖譜的整體定性和定量評(píng)價(jià)。所有樣品均顯示相似的Sl(>0.970)和α(<0.1)；但Pl%展現(xiàn)了明顯的變化，說明不同批次樣品之間整體化學(xué)成分的含量具有一定差異。此外，Pl%與所研究的4種指標(biāo)化合物的含量高度相關(guān)，說明綜合線性指紋法可替代指標(biāo)成分用于復(fù)雜系統(tǒng)的定量分析。與傳統(tǒng)的相似度方法比較，綜合線性指紋法對(duì)于中藥的質(zhì)量控制更加嚴(yán)格，有助于規(guī)范中藥質(zhì)量生產(chǎn)，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該方法也可作為原料藥投料生產(chǎn)、制劑工藝過程中的質(zhì)量監(jiān)控手段，為生產(chǎn)實(shí)踐和臨床治療提供有力的參考和指導(dǎo)。但由于條件限制，本研究?jī)H選擇了具有代表性的5個(gè)波長(zhǎng)，為了更加充分地提取樣品三維原始數(shù)據(jù)信息，進(jìn)一步的光譜色譜整體分析是需要的。隨著計(jì)算機(jī)的不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)處理方法的不斷完善，全波長(zhǎng)范圍DAD數(shù)據(jù)融合技術(shù)對(duì)于中藥質(zhì)量分析將更具有意義。本研究中五波長(zhǎng)的融合雖然不能代表所有樣品原始信息，但可以展現(xiàn)不同批次間樣品的質(zhì)量差異，為將來的研究工作提供初步探索。