黔東南州獼猴桃真菌病害種類(lèi)和病原鑒定

張國(guó)輝，李榮玉，李明，顧煥先，李向陽(yáng)，張文華

(1.凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.凱里市林業(yè)局森林植物防治檢疫站，貴州 凱里 556000)

獼猴桃ActinidiachinensisPlanch，也稱奇異果、藤梨和毛木果等，其果實(shí)含K、Zn、Ca等多種礦物元素和多達(dá)17種人體所需的氨基酸，具極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。中國(guó)是獼猴桃的原產(chǎn)地，可分為野生生長(zhǎng)區(qū)域和人工種植區(qū)域，在現(xiàn)有的獼猴桃人工種植區(qū)域，大多數(shù)品種從野生獼猴桃中挑選培育出來(lái)[2]。野生獼猴桃(wild kiwi fruit)，俗名馬奶果和豬奶果等，生長(zhǎng)在山坡和灌木叢中[3]。野生獼猴桃微量元素的種類(lèi)和含量以及抗氧化的酚類(lèi)物質(zhì)較栽培的獼猴桃品種豐富，蔣天智等對(duì)野生獼猴桃微量元素研究的結(jié)果表明，野生獼猴桃含有多種有益微量元素且不含重金屬元素Ni、Cd、Pb[4-5]。野生獼猴桃果實(shí)除鮮食外，也可加工成各種食品和飲料，如果汁、果凍、果脯、果酒和果醬等；此外，其嫩葉和嫩梢可加工成保健茶，根、藤和葉可入藥，花可供提取香料。因此，野生獼猴桃具有加工開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[6]。紅心獼猴桃是早熟紅心品種，也是藥食兩用的珍稀品種，經(jīng)常食用其鮮果對(duì)人體有保健、補(bǔ)血養(yǎng)顏和排毒防癌的功效，其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含維生素和多種礦物質(zhì)及18種氨基酸，被譽(yù)為“人間仙果”、“果中之王”和“維C之王”，因其微量元素中的含鈣量為果中之首，是中老年人良好的補(bǔ)鈣劑。此外，在醫(yī)療保健上，紅心獼猴桃對(duì)高血壓、心腦血管病、肝炎、癌癥和維C缺乏癥等都有醫(yī)治作用和輔助療效[7-9]。目前，紅心獼猴桃種植已成為適生區(qū)農(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)，但由于不少果農(nóng)缺乏紅心獼猴桃的病害知識(shí)和科學(xué)的防控技術(shù)，果園病害日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了紅心獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。已報(bào)道的栽培獼猴桃病害有褐斑病[10-14]、根結(jié)線蟲(chóng)病[15-18]、炭疽病[19-22]、細(xì)菌性葉枯病[23-26]、軟腐病[27-28]、根腐病[29]、黑斑病[30]和黃化病[31-34]等，國(guó)內(nèi)尚無(wú)野生獼猴桃病害的研究報(bào)道。為了解貴州省黔東南州野生獼猴桃和紅心獼猴桃產(chǎn)區(qū)的病害種類(lèi)及其病原真菌種類(lèi)，筆者在該產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病害種類(lèi)調(diào)查和室內(nèi)病原分離鑒定，以期為后期的病害防治提供科技支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 儀器有超凈工作臺(tái)、移植針、剪刀、鑷子、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、電磁爐、微波爐等。試劑有0.1%升汞溶液、75%乙醇、無(wú)菌水和工業(yè)酒精。供試培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g，切片加水煮沸20 min，過(guò)濾，取濾液定容至1 000 mL，加入蔗糖17 g，瓊脂17 g，加熱溶解，高溫滅菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病害標(biāo)本采集和癥狀觀察 2019年10月—2020年5月在貴州省黔東南州凱里市下司鎮(zhèn)隆堡村和黔東南州黃平縣岑花村半坡組的紅心獼猴桃種植基地，田間隨機(jī)抽取若干行采集病株，同時(shí)在基地周邊采集野生獼猴病株。觀察并描述野生獼猴桃和紅心獼猴桃發(fā)病部位病斑(病果)的形態(tài)、顏色及危害程度等，同時(shí)對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行拍照。記錄病害的發(fā)生癥狀，并采集新鮮標(biāo)本于凱里市林業(yè)局檢驗(yàn)檢疫站做病原分離和鑒定。

1.2.2 病原菌的分離純化和病原鑒定 應(yīng)用組織分離法對(duì)野生獼猴桃和紅心獼猴桃的病葉和病果進(jìn)行病原菌分離，即用剪刀切取病組織3塊，先在0.1%升汞溶液中浸泡2～3 min，再放于75%乙醇浸泡2～3 s，用鑷子夾取病組織呈“品”字形放于PSA固體培養(yǎng)基中，最后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)5～7 d。用移植針對(duì)長(zhǎng)成的菌落進(jìn)行2次純化，直至獲得純培養(yǎng)。取純化后的菌落中央部分的菌絲放于載玻片上，在顯微鏡下對(duì)病原菌的形態(tài)特征進(jìn)行鏡檢拍照，同時(shí)測(cè)量記錄菌絲和孢子大小。采用核糖體rDNA-ITS(Internal transcribed spacer)區(qū)序列分析法進(jìn)行DNA測(cè)序，將ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) BLAST比對(duì)，使用MEGA4.0軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，最后結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察對(duì)致病菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1.3 病原回接 將純化后的4種病原真菌(膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum、變紅鐮刀菌Fusariumincarnatum和互隔交鏈孢霉Alternariaalternata)先在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，把無(wú)菌水洗下的孢子液配制成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液，采用針刺法回接在野生獼猴桃、紅心獼猴桃的葉片(果實(shí))上。噴霧接種孢子懸浮液，或用打孔器打出直徑為5 mm菌絲塊，接種在針刺后的葉片(果實(shí))部位。待葉片(果實(shí))產(chǎn)生病斑后，再采用組織分離法對(duì)病斑進(jìn)行分離和純化，并將分離到的病原菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅心獼猴桃葉片軟腐病 葉片發(fā)病部位多由葉緣開(kāi)始變灰褐卷曲，少數(shù)病斑位于葉脈間，呈水浸狀病斑，后期變成黑色(圖1A)。發(fā)病部位變薄，略透明(圖1B)。PSA平板上，菌落初期呈圓形，白色，絨毛狀，菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌落背面呈淡橙黃色(圖1C)，后期菌落產(chǎn)生紅褐色色素，菌落背面觀呈紅褐色(圖1D)。分生孢子梗呈粗短狀或膨大稍彎曲的小分枝(圖1E)，大型分生孢子呈鐮刀形，稍彎曲，兩端略尖，易脫落。大型分生孢子的隔膜多為4至5個(gè)，少數(shù)為3個(gè)，分隔明顯，大小為(21.08～35.28)μm×(3.54～6.19)μm(圖1F)。ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，結(jié)合分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果，菌株與Fusariumincarnatum聚為一類(lèi)，支持率為100%(圖2)，結(jié)合形態(tài)學(xué)確定該致病菌為變紅鐮刀菌Fusariumincarnatum。

圖1 紅心獼猴桃葉片軟腐病的病葉及病原真菌變紅鐮刀菌Fusarium incarnatumFig.1 The infected leaf of the soft rot disease on cultivated species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

圖2 病原真菌變紅鐮刀菌Fusarium incarnatum的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The molecular evolution tree of Fusarium incarnatum

2.2 紅心獼猴桃褐斑病 病斑發(fā)生于葉片，初期呈水漬狀暗綠色小斑，后期病斑沿葉緣或向內(nèi)擴(kuò)展，形成不規(guī)則的褐色病斑。貴州省黔東南州的梅雨季節(jié)里，在多雨高濕條件下，病情擴(kuò)展迅速，嚴(yán)重時(shí)病斑逐漸由褐色變黑色并引起霉?fàn)€。正常氣候下，褐斑病的病斑邊緣呈深褐色，中央顏色略淺(圖3A)。病原菌的分生孢子梗褐色，粗壯，單生，有隔膜。孢子鏈生或單生，卵形、倒梨形或倒棍棒形，大小為(22.50～42.08)μm ×(8.62～13.59)μm，呈褐色，橫隔3～4個(gè)，斜隔1～4個(gè)，分隔處略縊縮(圖3B)。ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，結(jié)合分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果，菌株與Alternariaalternata聚為一類(lèi)，支持率100%(圖4)，結(jié)合形態(tài)學(xué)確定該致病菌為互隔交鏈孢霉Alternariaalternata。

圖3 紅心獼猴桃褐斑病的病葉和病原真菌互隔交鏈孢霉Alternaria alternataFig.3 The infected leaf of brown spot disease on cultivated species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

圖4 病原真菌互隔交鏈孢霉Alternaria alternate的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The molecular evolution tree of Alternaria alternate

2.3 紅心獼猴桃果實(shí)炭疽病 炭疽病癥狀不僅僅發(fā)生在野生獼猴桃的葉片上，還會(huì)出現(xiàn)在紅心獼猴桃的果實(shí)上。果實(shí)受害后呈水漬狀，病斑圓形，褐色或深褐色，病斑中央略凹陷，邊緣清晰，病斑可擴(kuò)大到整個(gè)果面的1/3以上(圖5A)。病原菌的分生孢子梭形，大小為(8.85～15.98)μm×(2.60～4.19)μm，兩端圓形或一端銳尖，無(wú)色，單胞，內(nèi)含兩個(gè)油球(圖5B)。

圖5 紅心獼猴桃果實(shí)炭疽病的病果和病原真菌尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatumFig.5 The infected fruit of anthrax disease on cultivated species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，結(jié)合分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果，菌株與Colletotrichumacutatum聚為一類(lèi)，支持率為100%(圖6)，結(jié)合形態(tài)學(xué)確定該致病菌為尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum。

圖6 病原真菌尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.6 The molecular evolution tree of Colletotrichum acutatum

2.4 野生獼猴桃炭疽病 野生獼猴桃炭疽病主要以結(jié)果初期至落葉時(shí)危害較為嚴(yán)重。危害葉片可引起葉斑，發(fā)病部位主要在葉緣和葉脈間。葉緣略向葉背卷縮，病斑的病健處交界明顯，病斑中間為灰白色至褐色，邊緣深褐色，病斑受葉脈限制，呈不規(guī)則形，數(shù)個(gè)病斑連接成不規(guī)則灰褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)形成穿孔(圖7A)。病原菌的分生孢子呈圓柱形或近橢圓形，單胞，無(wú)色，大小為(13.61～22.58)μm×(3.86～4.20)μm，孢子內(nèi)有兩個(gè)油球(圖7B)。ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，結(jié)合分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果，菌株與Colletotrichumgloeosporioides聚為一類(lèi)，支持率為100%(圖8)。結(jié)合形態(tài)學(xué)確定該致病菌為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，野生獼猴桃炭疽病為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

圖7 野生獼猴桃炭疽病的病葉及病原真菌膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioidesFig.7 The infected leaf of anthrax disease on wild species of Actinidia chinensis and pathogenic fungus

圖8 病原真菌膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.8 The molecular evolution tree of Colletotrichum gloeosporioides

2.5 病原回接 將配制好的孢子懸浮液經(jīng)針刺法接種于紅心獼猴桃和野生獼猴桃的葉片(果實(shí))上，孢子懸浮液接種5 d后，4種病原真菌均可導(dǎo)致葉片和果實(shí)發(fā)病，再采用組織分離法分離病斑(病果)上的病原菌并進(jìn)行顯微鑒定，結(jié)果表明再次分離的菌株與接種的病原菌菌株相同(圖9)，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌株為野生獼猴桃或紅心獼猴桃葉部(果實(shí))病害的致病菌。

3 結(jié)論與討論

大多數(shù)栽培獼猴桃品種都是從野生獼猴桃中挑選培育出來(lái)的，如紅心獼猴桃是紅肉獼猴桃的變種，是從野生中華獼猴桃培育出來(lái)的。在本次調(diào)查研究中，人工種植的紅心獼猴桃的病害種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于野生的獼猴桃，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的野生獼猴桃病害種類(lèi)目前只限于葉部，且僅對(duì)其果實(shí)產(chǎn)生輕微危害，而人工栽培紅心獼猴桃的病害種類(lèi)和數(shù)量都較多，且葉果均能發(fā)病，對(duì)紅心獼猴桃果實(shí)的生長(zhǎng)和成熟都構(gòu)成威脅。如，獼猴桃果實(shí)炭疽病可通過(guò)對(duì)細(xì)胞壁的破壞增大Vc損失率[35]。

本研究中，野生獼猴桃炭疽病和紅心獼猴桃葉片軟腐病均為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。目前各地報(bào)道的獼猴桃炭疽病中，病原菌具多樣性。浙江省泰順縣和貴州省六盤(pán)水市的獼猴桃炭疽病由膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和博寧炭疽菌Colletotrichumboninense所致[14，20]。江西奉新縣獼猴桃果梗炭疽病的病原菌為隔孢叢殼菌Glomerellaseptospora[21]。本研究表明，黔東南州的野生獼猴桃炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，而紅心獼猴桃炭疽病的病原菌為尖孢炭疽菌Colletotrichumacutatum，同一地區(qū)，炭疽菌的病原也有可能不同。紅心獼猴桃葉片軟腐病的病原真菌為變紅鐮刀菌Fusariumincarnatum，鐮刀菌可引起植物的各類(lèi)腐爛病，如根腐、花腐、莖腐、莖基腐和穗腐等，可造成作物萎蔫死亡，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，軟腐病是生產(chǎn)上防治最難的重要病害之一。目前已有研究結(jié)果表明，貴長(zhǎng)獼猴桃的腐爛果中分離到的是小新殼梭孢菌Neofusicoccumparvum、擬莖點(diǎn)霉Phomopsissp.和尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum，其中小新殼梭孢菌和擬莖點(diǎn)霉是貴長(zhǎng)獼猴桃腐爛的主要病原菌[36]。Fusariumsolani是腐生性較強(qiáng)的真菌，屬于次生寄生菌，可加重廣東省和平縣的獼猴桃根腐病發(fā)生[29]。通過(guò)‘秦美’獼猴桃貯藏期病原真菌的鑒定發(fā)現(xiàn)，三線鐮刀菌Fusariumtricinctum也不是優(yōu)勢(shì)病原菌[37]。質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的銀杏葉提取液對(duì)鐮刀菌屬的抑制率達(dá)到98.3%[38]。大蒜素對(duì)獼猴桃果實(shí)主要致病菌層出鐮刀菌Fusariumproliferatum菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度(EC50)為1 048.63 mg/L[39]。獼猴桃褐斑病是獼猴桃生長(zhǎng)期最嚴(yán)重的葉部病害之一，對(duì)產(chǎn)量和鮮果品質(zhì)影響很大。黔東南州紅心獼猴桃褐斑病的病原菌為互隔交鏈孢霉Alternariaalternata。獼猴桃褐斑病在葉片和果實(shí)上均可發(fā)病，且貫穿于獼猴桃整個(gè)生長(zhǎng)季，給地方產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了較大的危害[10-11]。值得一提的是，在現(xiàn)已發(fā)表的文章里，獼猴桃黑斑病和獼猴桃褐斑病的命名雖不同但病原相同，如奉新縣獼猴桃黑斑病的病原為Alternariaalternata[40]，與褐斑病的病原相同，只是病害名稱有差異，根據(jù)病原菌鑒定結(jié)果，2種病害的病原菌實(shí)際上為同一種病原菌Alternariaalternata。2017—2018年，中國(guó)科學(xué)院武漢植物園獼猴桃種質(zhì)資源與育種學(xué)科組對(duì)貴州省六盤(pán)水市、浙江省溫州市泰順縣及云南省屏邊縣獼猴桃病蟲(chóng)害情況進(jìn)行了周年調(diào)研。在獼猴桃病害鑒定過(guò)程中，首次發(fā)現(xiàn)細(xì)極鏈格孢菌菌株Alternariatenuissima可導(dǎo)致褐斑病癥狀，球黑孢菌株Nigrospora sphaerica導(dǎo)致軟腐病癥狀，Didymellaglomerata菌株為黑斑病的致病菌[30]，為獼猴桃病害命名有了一個(gè)明確的說(shuō)明。