桃花精油生物活性分析及護膚效果初探?

孫嘉晨 黃 宇 王 娜 丁 眾 高洪坤 張 恒，2??

(1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2.青島科技大學生態(tài)化工國家重點實驗室培育基地，山東 青島 266042)

0 引 言

皮膚的白凈程度與皮膚內(nèi)黑色素的多少有很大的關(guān)系，黑色素是由黑色素細胞產(chǎn)生后逐漸向角質(zhì)細胞、表皮細胞和角質(zhì)層轉(zhuǎn)移，最后隨角質(zhì)層的脫落而排泄，以此影響皮膚的顏色或形成色斑[1].酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)是人體調(diào)控黑色素生成的限速酶.生物化學方法對皮膚的美白是通過抑制TYR活性以抑制黑色素的生成，阻斷其生成過程中的信號通路和加快表皮細胞代謝速度等途徑，達到肌膚美白的效果[2].

研究顯示，皮膚的老化與自由基的氧化作用有較大關(guān)聯(lián)[3].人體內(nèi)的自由基分為外源性和內(nèi)源性2類，外源性自由基由生活環(huán)境產(chǎn)生，內(nèi)源性自由基是細胞在正常代謝過程中產(chǎn)生.而自由基在奪取電子的過程中會對細胞結(jié)構(gòu)造成破壞，甚至使其喪失原有的功能，導致皮膚衰老.生物化學方法延緩皮膚的衰老是通過對自由基的清除，以有效地減輕其對細胞的破壞，從而實現(xiàn)抗衰老的目的[4-5].人體內(nèi)的自由基包括超氧陰離子自由基羥基自由基(·OH)、羧基自由基(ROO·)、脂氧基自由基、一氧化氮自由基(NO·)和硝基自由基(·ONOO—)6種.其中，·OH因其具有強氧化能力，能與大多數(shù)有機物發(fā)生自由基鏈反應的特性而備受重視.因此，目前對氧化能力的探究多以·OH作為重要研究對象.譚冰等[6]提取廣西茉莉花葉的總黃酮，研究顯示其對·OH有很好的清除作用；吳冬青等[7]研究了9種藥用植物花的提取物，并根據(jù)其對·OH清除能力進行了排序；袁建梅等[8]對桃花多酚進行了提取，并證實了其對·OH和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基具有較強的清除能力.

植物精油是萃取植物特有的芳香物質(zhì)，由一百至上千種成分構(gòu)成，主要含有醇類、醛類、酸類、酚類、丙酮類和萜烯類等[9]，具有抗菌保健和美容養(yǎng)顏等功效，目前多應用于化妝品領(lǐng)域[9-10].與化學方法合成的大分子類活性物質(zhì)相比，將植物精油添加入化妝品中，更有助于皮膚吸收和增加化妝品的美容、潤膚等功效[11]，且具有環(huán)保安全等特點[12].劉杰超等[13]研究顯示桃花中的多酚和黃酮具有優(yōu)越的抗氧化性能；王英鋒等[14]證實了半枝蓮中黃酮成分提取的可能性；郭彩珍等[15]證實了桃花多糖具有抗氧化性能；耿明江等[16]對桃花精油的提取工藝進行了探討，并總結(jié)出了最佳優(yōu)選提取工藝，為本實驗的進行提供了有力的依據(jù).

目前，桃花作為天然生物質(zhì)資源，相關(guān)護膚產(chǎn)品在市面上較少.經(jīng)諸多研究表明，其對自由基與TYR有一定的清除和抑制作用.在此基礎(chǔ)上，本研究采用已優(yōu)化的工藝提取桃花精油[17]，制成面霜，通過對照實驗，分析不同狀態(tài)的桃花提取物對TYR的抑制作用和·OH的清除能力，同時對桃花精油和面霜的效果進行考察，并征集志愿者進行桃花面霜效果試用，以更全面地了解桃花提取物對皮膚的美容效果.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

維生素C(C6H8O6)、日化級甘油(C3H8O3)、環(huán)聚二甲基硅氧烷、Peg-8硬脂酸酯(C34H68O10)、丁二醇(C4H10O2)、硬脂醇(C18H38O)、杏仁油、透明質(zhì)酸鈉(C14H22NNaO11)、黃原膠(C8H14Cl2N2O2)、海藻糖(C12H22O11)和山梨酸鉀(C6H7KO2)均購自山東優(yōu)索化工科技有限公司；分析純鄰二氮菲(C12H8N2·H2O)購自天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；分析純的無水乙醇(C2H5OH)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)購自國藥集團化學試劑有限公司；分析純硫酸亞鐵(FeSO4)購自上海埃彼化學試劑有限公司；分析純的30%過氧化氫(H2O2)和磷酸氫二鈉(Na2HPO4)購自天津市鼎盛鑫化工有限公司；分析純磷酸二氫鉀(KH2PO4)購自天津市北辰方正試劑廠；分析純左旋多巴購自上海恒遠生物科技有限公司.實驗所用水(H2O)均為蒸餾水.實驗咖啡因為自制.新鮮土豆購自生活超市.

1.2 實驗儀器

采用北京普析通用儀器有限責任公司生產(chǎn)的TU-1810型紫外-可見光分光光度計測定溶液吸光度；采用上海司樂儀器有限公司生產(chǎn)的HD2010W型臥式高速均質(zhì)機進行樣品攪拌.

1.3 桃花精油制備

采用無水乙醇提取工藝提取桃花精油[17].使用濾紙包扎1.0 g干燥小瓣桃花粉末進行抽提，控制索氏抽提器提取溫度為80～90℃，抽提6 h，無水乙醇在抽提器中循環(huán)不少于每小時4次.抽提完畢后將所得溶液濃縮至30.00 mL，即得到桃花精油.

1.4 桃花面霜制備[18]

稱取5.0 g環(huán)聚二甲基硅氧烷、6.0 g Peg-8硬脂酸酯、7.0 g硬脂醇和2.0 g黃原膠逐次加入燒杯中，于40℃攪拌溶解于20.0 g甘油中，再逐次加入5.0 g丁二醇、8.0 g杏仁油和3.0 g透明質(zhì)酸鈉，使用高速均質(zhì)機攪拌均勻；再加入35.00 mL H2O、1.0 g海藻糖、2.0 g山梨酸鉀、5.0 g桃花精油、0.3 g咖啡因及0.7 g EDTA-2Na，40℃水浴加熱，持續(xù)攪拌至完全溶解，放至室溫后得到桃花精油質(zhì)量分數(shù)為5.0%的100.0 g桃花面霜.

1.5 溶液配制

(1)維生素C溶液配制.將0.1 g維生素 C加入100.00 mL水中，攪拌溶解，配置成1.0 g/L維生素C水溶液.

(2)磷酸鹽(PBS)緩沖液配制.稱取 28.4 g Na2HPO4與27.2 g KH2PO4分別配置成1.00 L 0.2 mol/L的 Na2HPO4與 KH2PO4溶液.使用670.0 g 0.2 mol/L Na2HPO4溶液與330.0 g 0.2 mol/L KH2PO4溶液配制得PBS緩沖液.

1.6 TYR活性抑制率測定

將土豆去皮切塊，稱取10.0 g土豆在-20℃冷凍過夜，按照質(zhì)量體積比為1∶1加入10.00 mL PBS緩沖液，研磨成勻漿狀態(tài)，過濾，收集濾液，-4℃冷凍，在離心半徑3 cm，4 000 r/min離心15 min.收集上清液即為TYR提取液，冰浴保存待用.

向試管中分別加入0.50 mL桃花精油、0.50 mL PBS緩沖液、2.00 mL 16.0 mmol/L左旋多巴溶液和2.00 mL H2O，35℃溫育10 min后，加入0.50 mL TYR提取液，反應14 min.從反應開始，每間隔2 min測量反應液在吸收波長為475 nm時溶液的吸光度(At).用維生素C作為對照組.將上述步驟中的桃花精油換成等體積維生素C重復實驗，得到維生素 C溶液吸光度隨時間變化曲線.由曲線斜率即可求得酶活力[19].計算公式為酶活力 =(At-A0)/14，式中At表示在t時測得的吸光度值，A0表示初始測得的吸光度值.

桃花精油對TYR活性抑制率測量，利用反應結(jié)束時溶液的吸光度進行計算.上述步驟可得到樣品的吸光度(A樣)；將上述步驟中桃花精油和左旋多巴溶液換為等體積H2O，測量得到背景溶液吸光度(A背景)；將上述步驟中桃花精油分別換為等體積H2O，得到空白樣品的吸光度(A空白)；將上述步驟中左旋多巴溶液換為等體積H2O，得到樣品背景的吸光度(A基底).TYR活性抑制率(K)計算公式為[19-20]

將實際樣品桃花精油分別換為等體積維生素C和桃花面霜，重復操作，可得到不同實際樣品的K.所有實驗重復3次.

1.7 ·OH清除能力測定

通過紫外-可見光吸光光度法間接檢測體系中芬頓(Fenton)反應·OH量的變化[10].(1)在試管中依次加入1.00 mL 750.0 μmol/L的鄰二氮菲溶液、2.00 mL PBS緩沖液和1.00 mL H2O，充分混勻后加入1.00 mL 750.0 μmol/L的 FeSO4溶液，混勻后加入1.00 mL 0.01%H2O2溶液，37℃下水浴反應1 h，測量吸收波長為536 nm時溶液的吸光度，記為背景吸光度(AP)；(2)將步驟(1)中H2O2溶液換成等體積 H2O，測量吸光度，為水的吸光度(AB)；(3)將步驟(2)中 1.00 mL H2O分別換成 1.00、1.25、1.50、1.75和 2.00 mL桃花精油、桃花面霜和維生素C，分別測得不同添加量時不同樣品吸光度值(AS).重復3次.不同添加量時不同樣品對·OH清除率(d)計算公式為

1.8 桃花面霜試用問卷調(diào)查

通過線上及線下的方式征集100名志愿者進行桃花面霜樣品試用，試用人群可分為男性、女性，青年、中年人等群體.其中，18～20、21～35和36～50歲試用者所占比例分別為10.00%、75.00%和15.00%.

桃花面霜使用方法:皮膚清洗潔凈后取適量產(chǎn)品涂勻于部分皮膚表面，試用期限為10 d.為保證實驗的準確性，在試用進行期間，所有志愿者均停用其他化妝品.

試用結(jié)束后，所有志愿者填寫對桃花面霜試用效果的問卷調(diào)查.問卷內(nèi)容的設(shè)計主要是根據(jù)日常護膚品所具有的滋潤、美白、去皺和祛痘等功效展開.問卷調(diào)查主要采用多項選擇題型，作答以志愿者的個人感官評價為準.

1.9 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 TYR活性抑制率

不同時間不同樣品對TYR活性變化曲線如圖1所示.在0～14 min，所有樣品溶液的TYR酶活力隨時間變化呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系.在樣品使用量為0.50 mL時，H2O、維生素 C、桃花精油和桃花面霜作用下，TYR活力值分別為 30.89、8.02、22.15和26.99 Abs/min；當使用量為 0.50 mL時，反應14 min后，維生素 C、桃花精油和桃花面霜對 TYR活性抑制率分別為74.09%、28.33%和12.90%.

圖1 不同樣品對酪氨酸酶活力隨時間變化曲線

2.2 ·OH清除能力

不同用量時，反應1 h后各樣品對·OH的清除率曲線如圖2所示.在樣品體積為1.25 mL時，維生素C、桃花精油和桃花面霜對·OH的清除率基本趨于平衡.在樣品用量為1.25 mL時，維生素 C、精油和面霜對·OH的清除率分別為41.99%、18.31%和7.59%.

圖2 不同用量時各樣品對羥基自由基的清除率

2.3 問卷調(diào)查結(jié)果

本次共發(fā)放和收回問卷100份，問卷有效率為100%.調(diào)查結(jié)果顯示:46.00%的試用者表示涂抹該產(chǎn)品感到滋潤，36.00%的試用者表示使用該產(chǎn)品感受到了美白效果，29.00%的試用者認為其對皺紋及痘痘有一定祛除功效，5.00%和2.00%的試用者認為該產(chǎn)品有其他效果和無效果.

3 討 論

維生素C為強還原劑，其對TYR活性的抑制性極大.本研究以維生素C作為TYR抑制力的判斷基準衡量桃花精油和桃花面霜對TYR的抑制水平.由TYR活性抑制和·OH清除實驗可知，桃花精油與桃花面霜均對TYR具有一定的活性抑制作用，同時對·OH具有一定的清除能力；將不同樣品對TYR活性抑制率和清除率按大小排序為:維生素C、桃花精油、桃花面霜.說明雖然與同等水平的維生素 C相比，桃花精油和桃花面霜對TYR的抑制率和對·OH的清除率較低，但桃花精油和桃花面霜具備一定的抑制TYR活性和清除·OH的功效，同時證明添加了桃花活性提取物的化妝品存在一定的美白和抗衰老功效.

調(diào)查結(jié)果表明使用桃花面霜后，46.00%的志愿者認為桃花面霜護膚作用明顯，試用產(chǎn)品有護膚功效.調(diào)查中，所有樣本未出現(xiàn)過敏反應，表明本試用品致敏概率較低.本研究雖然只進行了TYR活性抑制和·OH清除實驗，表明桃花提取物具有美白和抗衰老功效，而志愿者試用后的問卷調(diào)查結(jié)果顯示，試用產(chǎn)品除具有皮膚美白和祛皺效果，還具有滋潤和祛痘作用.這是因為采用無水乙醇提取的桃花有效成分很多，本課題組前期已通過氣相色譜質(zhì)譜(GCMS)儀分析了桃花精油中的成分，表明桃花精油中至少含有20種以上物質(zhì)，包含黃酮和多酚等有效成分[17].研究表明，黃酮類物質(zhì)能夠阻止過氧化物對皮膚的破壞，減少了皮膚中蛋白質(zhì)的變性和破壞[3]，從而使皮膚的屏障功能發(fā)揮作用，達到志愿者所體驗到的皮膚美白、祛皺、滋潤和祛痘效果.而維生素C在護膚的功效主要表現(xiàn)在美白和抗衰老，而沒有研究表明其具有祛痘效果.因此，這也間接表明桃花提取物的護膚功能更多樣.

4 結(jié)束語

本文研究了桃花提取物對TYR的抑制作用和對·OH的清除能力，從理論實驗層面證實桃花提取物具有一定的皮膚美白和抗氧化作用.將其制成桃花面霜后進行試用和問卷調(diào)查，結(jié)果表明試用品對皮膚的美白、祛皺、滋潤和祛痘效果較為顯著.然而，在實驗調(diào)查的過程中，仍有可能存在志愿者試用產(chǎn)品時間較短和問卷設(shè)計粗糙等問題.在下一步，將以桃花精油其他方面的保健效果為方向，擴大研究層面，探索桃花作為天然生物質(zhì)能給人所帶來的更多益處.