活性污泥法馴化一株好氧反硝化細菌?

楊 達 趙婉寧 陳 越 程有鵬 藍惠霞，2??

(1.青島科技大學環(huán)境與安全工程學院，山東 青島 266042；2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室，福建 莆田 351100)

0 引 言

脫氮是生活廢水處理的重要目標[1-2]，而異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)為生物脫氮技術(shù)提供了新的研究方向.Robertson和 Kuenen[3]最早提出好氧反硝化細菌的存在，近年來，隨著對好氧反硝化的進一步研究，在好氧條件下存在多種具有脫氮能力的菌株.目前已經(jīng)有20多個屬的好氧反硝化菌株被分離出來[4]，如腸桿菌屬(Enterobacter Hormaeche and Edwards)、副球菌(Paracoccus Davis)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes Castellani&Chalmers)、陶厄氏菌屬(Thauera)[5]和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等均能起到脫氮效果.其中惡臭假單胞菌屬于異養(yǎng)菌[6-7]，在有氧條件下以有機物為電子供體，以氧氣(O2)、硝酸根、亞硝酸根為電子受體，還原產(chǎn)生氮氣(N2)，從而起到脫氮作用.

胞菌的脫氮能力是研究者關(guān)注的熱點.張國寧等[8]從好氧反硝化活性污泥系統(tǒng)分離純化得到1株惡臭假單胞菌，研究顯示高重鉻酸鹽需氧量(CODCr)/總氮(TN)能夠反映脫氮效果，從而驗證了有機物的電子供體作用；趙曉宇等[9]的研究顯示從自然界水體中獲得的惡臭假單胞菌株還可制成微生物強化菌劑，用于去除水中有機物，起到凈水效果；張文藝等[10]研究證實從氧化溝活性污泥中分離得到可以同步高效脫氮除磷的惡臭假單胞菌，在厭氧/缺氧(A/A)處理中，硝酸鹽氮去除率可達53.5%.

好氧反硝化菌的存在使得好氧硝化和反硝化在同一構(gòu)筑物中的實現(xiàn)成為可能[11-14].相對于厭氧微生物生長繁殖緩慢，對廢水處理周期長等缺陷，好氧反硝化菌具有生長繁殖速度快、脫氮效率高等優(yōu)點，對廢水具有更好的脫氮效果，利用好氧反硝化菌可在有氧條件下將還原為N2和一氧化二氮(N2O)等氣態(tài)產(chǎn)物[15-16].目前，有關(guān)好氧反硝化菌的研究極大推動了生物脫氮的研究進展，受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注.

在傳統(tǒng)工藝處理廢水過程中，通常存在工藝流程相對復雜、占地面積大、碳源投加量大且硝化過程產(chǎn)生酸、反硝化過程產(chǎn)生堿等缺點，從而導致反硝化效率低.為了彌補傳統(tǒng)處理工藝中缺氧反硝化的不足[17]，本研究以檸檬酸為碳源，采用活性污泥法，通過3個階段馴化廢水中的好氧反硝化菌群[18]，逐步提高廢水中質(zhì)量濃度，以達到富集好氧反硝化細菌的目的.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

分析純無水碳酸鈉(NaCO3)、對氨基苯磺酰胺和硫酸銀(Ag2SO4)購自天津博迪化工股份有限公司；分析純氫氧化鈉(NaOH)購自天津市科密歐化學試劑有限公司；分析純硝酸鈉(NaNO3)、硫酸汞(HgSO4)和分析純鹽酸 N-(1-萘)-乙二胺購自天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；分析純檸檬酸購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；分析純硫酸銨[(NH4)2SO4]購自國藥集團化學試劑有限公司；分析純濃硫酸(H2SO4)購自煙臺遠東精細化工有限公司；分析純重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)和蛋白胨購自天津市鼎盛鑫化工有限公司；定量濾紙購自杭州富陽特種紙業(yè)有限公司；牛肉膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司.

1.2 實驗儀器

采用中國佑科儀器有限公司生產(chǎn)的PHS-3C型pH計測量溶液pH；采用美國HACH公司生產(chǎn)的DRB100型化學需氧量(COD)快速消解儀和DR1010型 COD測定儀進行 CODCr測定；采用上海民橋精密科學儀器有限公司生產(chǎn)的06672型的電子天平稱質(zhì)量；采用上海市新亞凈化器件廠生產(chǎn)的0.22 μm的微孔濾膜過濾出水；采用上海一恒有限公司LRH-150生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)微生物.

1.3 污泥馴化

以檸檬酸作為碳源，(NH4)2SO4為氮源進行馴化實驗.在 1 L的廢水中加入 80.1 mg檸檬酸、17.1 mg KH2PO4、16.5 mg(NH4)2SO4，使溶液中碳(C)、氮(N)和磷(P)元素的物質(zhì)的量(n)比為nC∶nN∶nP=100 ∶5∶1.此時溶液 CODCr質(zhì)量濃度為300 mg/L，加固體NaOH調(diào)溶液酸堿度至pH 7.

污泥馴化分為3個階段.第1階段，加入2.0 mg NaNO3使體系中質(zhì)量濃度為20 mg/L，馴化時間為第1～6天；第2階段，加入4.0 mg NaNO3，使體系中質(zhì)量濃度為40 mg/L，馴化時間為第7～18天；第3階段，加入 7.0 mg NaNO3，使體系中質(zhì)量濃度為 70 mg/L，馴化時間為第 19～30天.實驗重復進行30次.

1.4 出水指標測量

(1)溶液酸堿度測量.每天固定時間取10 mL的出水測量溶液pH.

(2)CODCr去除率測量.抽取20 mL的進出水，使用0.22 μm的濾膜過濾2～3次，直至溶液過濾澄清備用.取80.0 mg HgSO4置于消解管中，加入3 mL消解液和2 mL上述水樣后搖勻，采用CODCr快速消解儀在165℃下消解2 h，冷卻后測定CODCr去除率.

1.5 污泥指標測量

根據(jù)《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥泥質(zhì):GB/T 24188—2009》[19]的方法進行污泥指標測量，測定第2和3個階段馴化結(jié)束后污泥指標參數(shù).

(1)混合液懸浮固體量ρ(MLSS)測量.將4個定量濾紙在103～105℃ 的烘箱中烘干2.0 h，在干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱質(zhì)量(m0).使用干燥后的定量濾紙分別過濾100 mL水樣.過濾后，將濾紙放入103～105℃的烘箱中烘干2.0 h，在干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后再次稱質(zhì)量(m1).則該水樣的ρ(MLSS)=(m1-m0)/V，其中V為樣品的體積，V=100 mL.

(2)30 min污泥沉降比φ(SV30)測量.取100 mL攪拌均勻的污泥水放于量筒中，靜置30 min后，讀取污泥的體積 (V1)，計算污泥體積比，即得到φ(SV30)=V1/100.

(3)污泥體積指數(shù)(sludge volume index，ISV)測量.ISV=φ(SV30)/ρ(MLSS).

(4)胞外多糖質(zhì)量分數(shù)w(PS)測量.采用苯酚硫酸法測定樣品中的 PS[20]，測定不同質(zhì)量濃度(10～100 mg/L)甘露糖標準溶液在490 nm波長處的光密度值(OD)，繪制OD與w(PS)質(zhì)量分數(shù)標準曲線.每天固定時間取5 mL的出水測量溶液的OD，根據(jù)標準曲線計算實際w(PS).

1.6 菌種篩選與鑒定

采用四區(qū)劃線法進行菌種分離，對分離純化后的優(yōu)勢菌進行篩選.用玻璃棒將馴化后穩(wěn)定的好氧活性污泥攪勻，接種環(huán)經(jīng)高溫滅菌冷卻至室溫后，用接種環(huán)蘸取少量好氧活性污泥，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h.采用16SrRNA技術(shù)進行鑒定獲得的菌株.

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以平均值表示.采用origin軟件進行數(shù)據(jù)處理和曲線制作.

2 結(jié) 果

2.1 出水指標情況

圖1 3個馴化階段出水指標的變化曲線(a)pH；(b)CODCr去除率；(c)-N 去除率

2.2 污泥指標測定

OD與w(PS)標準曲線為y=0.003 4x-0.030 1，R2=0.993 6.第 2個階段馴化結(jié)束后，ρ(MLSS)=4.53 g/L，φ(SV30) =25.2%，ISV=55.6 mL/g，w(PS)=25 mg/g；第 3個階段馴化結(jié)束后，ρ(MLSS)=4.70 g/L，φ(SV30)=23.8%，ISV=50.6 mL/g，w(PS)=44 mg/g.

2.3 菌種的篩選與鑒定

經(jīng)菌種篩選，本研究最終獲得1株優(yōu)勢菌，該優(yōu)勢菌菌落偏小、半透明呈米白色，近圓形且邊緣不整齊.經(jīng)鑒定，并與國家生物信息中心的序列數(shù)據(jù)庫進行核苷酸序列比對[21]，為好氧反硝化菌的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，匹配指數(shù)為100%.

3 討 論

在3個階段馴化過程中，每個階段 CODCr和去除率均呈現(xiàn)逐漸升高并趨于穩(wěn)定的變化趨勢.當前一個階段馴化結(jié)束進入下一階段時，由于溶液的質(zhì)量濃度突然提高，CODCr和去除率顯著下降，這是因為質(zhì)量濃度突然增加，一部分微生物由于不適應(yīng)高質(zhì)量濃度環(huán)境而死亡或處于休眠狀態(tài)[24]，致使 CODCr和去除率顯著降低.連續(xù)培養(yǎng)數(shù)天后，不適應(yīng)高質(zhì)量濃度的環(huán)境的微生物逐漸死亡，而存活的微生物在適應(yīng)了高質(zhì)量濃度的環(huán)境后，開始增殖，此時溶液的CODCr和去除率開始上升.隨著連續(xù)馴化的進行，能夠適應(yīng)更高質(zhì)量濃度環(huán)境的異養(yǎng)好氧菌和好氧反硝化菌成為污泥系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種，其對廢水中有機物的利用也相應(yīng)增強，CODCr的去除率也逐漸升高.結(jié)果顯示第3個階段馴化結(jié)束后，CODCr最大去除率顯著高于前2個階段，而去除率明顯低于前2個階段.這是因為這個階段的質(zhì)量濃度太高，而實驗過程中沒有及時補充碳源，造成碳源含量相對較低，碳源的不足限制了好氧反硝化細菌的正常生理代謝[25]，進而導致去除率低于前2個階段.

第2和3個階段馴化結(jié)束后，ρ(MLSS)變化很小，說明污泥活性變化不大，這是因為第3個階段中碳源與的質(zhì)量濃度不匹配，導致微生物的正常生理代謝與增長繁殖受限，造成污泥ρ(MLSS)變化不大.第2和3個階段馴化結(jié)束后，第3個階段馴化結(jié)束后測定得到的φ(SV30)和ISV值，與第2個階段相比，在一定程度上降低，表明隨著馴化過程的不斷進行，污泥沉降性能增強，出水濁度降低.與第2個階段馴化結(jié)束相比，第3個階段馴化結(jié)束后w(PS)值增加到1.8倍，這表明連續(xù)馴化使PS含量升高.PS類物質(zhì)多數(shù)含有羥基(—OH)和羧基(—COOH)基團，能提升污泥的親水性；PS會將環(huán)境中的營養(yǎng)成分富集，通過胞外酶降解成小分子后吸收到細胞內(nèi)，還可以抵御殺菌劑和有毒物質(zhì)對細胞的危害[26-27]；PS的增加有利于細菌富集、吸收營養(yǎng)成分，有利于膠菌團相互凝聚在一起，調(diào)節(jié)生物膜表面的黏附，防止環(huán)境中的有害物質(zhì)對細菌的破壞.

與其他研究不同，本研究經(jīng)過3個階段的連續(xù)馴化后，只得到1株菌株，說明連續(xù)馴化有助于進行單一菌株篩選.這可能是因為經(jīng)過長期馴化，適合馴化環(huán)境的微生物被篩選出來，并且不斷生長繁殖，使惡臭假單胞菌成為其中的優(yōu)勢菌屬.

4 結(jié)束語

本研究以檸檬酸為碳源，經(jīng)連續(xù)馴化活性污泥后，富集得到1株好氧反硝化細菌，且整個馴化過程中 CODCr和最大去除率可達92.3%和91.9%.然而與CODCr最大去除率相對應(yīng)的實驗階段，對應(yīng)的最大去除率僅59.1%，這是因為第3個階段中碳源與的質(zhì)量濃度不匹配，導致微生物的正常生理代謝與增長繁殖受限，導致的最大去除率受限.因此在下一步的實驗中，本研究將優(yōu)化連續(xù)馴化階段污泥中的碳源，以得到更高的 CODCr和最大去除率與提升污泥品質(zhì).