仿生型復(fù)合補(bǔ)片在大鼠腹壁缺損中的應(yīng)用研究*

王憲朋，鄭曉霞，孫淑萌，英永，李文明，王勤，劉陽(yáng)，尹弢

(山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

1 引 言

腹部外傷、腫瘤切除、組織感染等均會(huì)造成腹壁缺損[1-2]，進(jìn)而導(dǎo)致腹壁疝的發(fā)生。自Lichtenstein提出“無(wú)張力疝修補(bǔ)術(shù)”概念后[3]，補(bǔ)片材料迎來(lái)飛速發(fā)展[4-5]。然而，補(bǔ)片置入腹腔后，有與腔內(nèi)臟器發(fā)生粘連的可能，甚至?xí)l(fā)較嚴(yán)重的并發(fā)癥[6-7]。人工合成補(bǔ)片因價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛[8-10]，在臨床使用中具有顯著優(yōu)勢(shì)，但上市產(chǎn)品均存在過(guò)量瘢痕增生、粘連和術(shù)后慢性疼痛等缺陷[11-12]。為降低補(bǔ)片植入導(dǎo)致的粘連程度，本研究以一種仿生型復(fù)合補(bǔ)片為試驗(yàn)組與對(duì)照組聚丙烯網(wǎng)補(bǔ)片的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，評(píng)價(jià)臟器與腹壁修復(fù)區(qū)域的粘連優(yōu)良率及新生血管生長(zhǎng)、腹膜修復(fù)等情況。

2 材料和方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

健康SD大鼠，SPF級(jí)，10只，訂購(gòu)體重160～180 g，試驗(yàn)時(shí)體重200 g左右，動(dòng)物合格證號(hào)為37009200020173，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，飼養(yǎng)于萬(wàn)級(jí)屏障環(huán)境中。

聚丙烯網(wǎng)補(bǔ)片，日照天一生物醫(yī)療科技有限公司；仿生型復(fù)合補(bǔ)片，自制；SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫組化試劑盒，上海瑞齊生物科技有限公司；Rabbit Anti-CD31單抗、DAB染色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；戊巴比妥鈉，25 g/瓶，德國(guó)默克公司；注射用青霉素鈉，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；生理鹽水若干。

熒光顯微鏡，Ni-U，日本尼康公司；石蠟切片機(jī)，RM2245，德國(guó)徠卡公司。

2.2 建立大鼠腹壁缺損模型

大鼠禁食12 h后，用1%戊巴比妥鈉溶液行腹腔注射麻醉，腹部脫毛，常規(guī)消毒鋪巾，取腹部正中位置切開皮膚及皮下組織，將皮下組織及深層筋膜鈍性分離，肌層顯露后切除掉兩側(cè)的腹壁肌肉及腹膜，在腹壁上形成1個(gè)約1 cm×1 cm的方形缺損，腹壁缺損模型建立完成。使用生理鹽水對(duì)腹腔進(jìn)行沖洗，將殘余液體吸凈后放置補(bǔ)片。對(duì)照組使用傳統(tǒng)聚丙烯網(wǎng)補(bǔ)片，試驗(yàn)組使用仿生型復(fù)合補(bǔ)片，使用5-0絲線將補(bǔ)片固定于腹壁缺損肌肉邊緣，然后用4-0絲線將皮下組織及皮膚間斷縫合，無(wú)菌紗布對(duì)切口覆蓋。尾部標(biāo)記后單籠飼養(yǎng)。術(shù)后青霉素抗炎3 d，觀察一般情況。

術(shù)后4周處死動(dòng)物，開腹觀察試驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)面粘連情況并評(píng)分，觀察創(chuàng)面愈合情況。同時(shí)取缺損部位2 cm進(jìn)行組織學(xué)觀察。

2.3 評(píng)價(jià)方法

2.3.1大體觀察 術(shù)后每天肉眼觀察試驗(yàn)大鼠的狀態(tài)，包括缺損部位是否出現(xiàn)局部炎癥、傷口裂開、感染等情況。

2.3.2粘連情況 參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心發(fā)布的《腹腔內(nèi)置疝修補(bǔ)補(bǔ)片動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[13]，選用粘連強(qiáng)度、粘連面積為量化指標(biāo)，評(píng)價(jià)補(bǔ)片植入4周后與腹腔內(nèi)組織器官的粘連情況，進(jìn)而對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的量化得分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

以試驗(yàn)動(dòng)物的粘連綜合情況為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)補(bǔ)片與臟器之間的粘連情況，粘連情況綜合評(píng)價(jià)優(yōu)或良即為臨床可接受的粘連情況。以粘連情況評(píng)分為優(yōu)或良的例數(shù)在總例數(shù)中的百分比為粘連情況優(yōu)良率，見(jiàn)式(1)。

粘連情況優(yōu)良率=

(1)

2.3.3病理檢查 取修補(bǔ)區(qū)域腹膜組織，用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，厚度5 μm。分別進(jìn)行HE染色和Masson染色，于光鏡下觀察修復(fù)組織成纖維細(xì)胞的增殖效果，觀察缺損部位膠原的形成。

CD31免疫組化染色：4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，抗原修復(fù)，3%去離子水孵育15～20 min。加入試劑A室溫避光孵育20 min后，添加PBS適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次3 min；添加試劑B室溫避光孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；添加試劑C室溫避光孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；顯色劑顯色；蘇木素復(fù)染3 min，分化后自來(lái)水沖洗。脫水后，將切片由二甲苯中取出晾干，中性樹膠封片后，顯微鏡鏡檢，收集圖像。以CD31免疫組化染色結(jié)果評(píng)價(jià)新生毛細(xì)血管長(zhǎng)入情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 大體觀察

術(shù)后縫合部位出現(xiàn)紅腫，3 d后紅腫現(xiàn)象逐漸消失，試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物縫合區(qū)域均未出現(xiàn)局部炎癥、明顯隆起、傷口裂開、感染等情況。

3.2 粘連情況

選用粘連強(qiáng)度和粘連面積兩個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)補(bǔ)片與腹腔內(nèi)臟器的粘連程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。以粘連強(qiáng)度評(píng)分和粘連面積評(píng)分為依據(jù)，將粘連情況綜合評(píng)價(jià)分為優(yōu)、良、中、差四個(gè)等級(jí)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。試驗(yàn)組4只動(dòng)物僅有1處輕微粘連，一拉即開，粘連強(qiáng)度評(píng)分為1分，粘連面積占補(bǔ)片與組織接觸總面積25%以下，粘連面積評(píng)分為1分。由表2可知，試驗(yàn)組4只動(dòng)物的粘連情況綜合評(píng)價(jià)為優(yōu)；試驗(yàn)組1只動(dòng)物無(wú)粘連發(fā)生，粘連情況綜合評(píng)價(jià)為優(yōu)。試驗(yàn)組粘連情況優(yōu)良率為100%。對(duì)照組3只動(dòng)物有多處粘連，尚能分離，粘連強(qiáng)度評(píng)分為2分，粘連面積占補(bǔ)片與組織接觸總面積30%左右，粘連面積評(píng)分為2分。由表2可知，對(duì)照組3只動(dòng)物的粘連情況綜合評(píng)價(jià)為良；對(duì)照組2只動(dòng)物有多處粘連，較難分離，粘連強(qiáng)度評(píng)分為3分，粘連面積占補(bǔ)片與組織接觸總面積40%左右，粘連面積評(píng)分為2分，粘連情況綜合評(píng)價(jià)為中。試驗(yàn)組粘連情況優(yōu)良率為60%。

表1 粘連情況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 粘連情況綜合評(píng)價(jià)表

補(bǔ)片植入4周后，試驗(yàn)組和對(duì)照組的粘連程度差異較明顯，試驗(yàn)組和對(duì)照組腹腔內(nèi)粘連情況觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，試驗(yàn)組補(bǔ)片與腹腔內(nèi)臟器幾乎無(wú)粘連發(fā)生，而對(duì)照組動(dòng)物腹腔內(nèi)臟器與補(bǔ)片之間的粘連情況較明顯。由此可見(jiàn)，仿生型復(fù)合補(bǔ)片較傳統(tǒng)聚丙烯網(wǎng)補(bǔ)片具有優(yōu)異的防粘連效果。這可能是因?yàn)?，仿生型?fù)合補(bǔ)片是由靜電紡絲層、親水層及支撐層構(gòu)成，靜電紡絲層起物理屏障作用的同時(shí)，親水層中的親水性材料為組織修復(fù)細(xì)胞提供更有利的生長(zhǎng)和遷移環(huán)境[14]，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的適度增殖，加速腹膜化，從而有效抑制損傷部位和相鄰臟器之間粘連的發(fā)生。

圖1 試驗(yàn)動(dòng)物腹腔內(nèi)粘連情況

3.3 病理檢查

對(duì)腹壁缺損部位的組織切片進(jìn)行HE染色，并在光鏡下觀察其病理情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中，試驗(yàn)組和對(duì)照組在低倍鏡下(HE×20)均可觀察到腹膜及腹膜下組織內(nèi)已有肉芽組織形成，腹膜下組織內(nèi)含多灶性大小不等的樣品，未降解樣品周圍被纖維組織包裹。高倍鏡下(HE×100)可見(jiàn)腹膜下組織內(nèi)肉芽組織形成，組織內(nèi)含多灶性大小不等的樣品，樣品未完全降解，周圍被纖維結(jié)締組織包裹，并有多核巨細(xì)胞形成。HE染色結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對(duì)照組的成纖維細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，缺損部位肉芽組織均已形成。

圖2 試驗(yàn)動(dòng)物腹壁缺損部位HE染色結(jié)果

采用MASSON染色方法對(duì)腹壁缺損部位的膠原纖維進(jìn)行表征，試驗(yàn)組和對(duì)照組的MASSON染色結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，試驗(yàn)組腹膜下組織內(nèi)含多灶性大小不等的樣品，樣品未完全降解，周圍被纖維結(jié)締組織包裹，組織內(nèi)膠原纖維藍(lán)染。對(duì)照組腹膜下組織內(nèi)含未完全降解的樣品，樣品周圍被纖維結(jié)締組織包裹，組織內(nèi)膠原纖維藍(lán)染。MASSON染色結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對(duì)照組缺損腹膜部位已有大量膠原生成，形成較為致密的纖維結(jié)締組織。

圖3 試驗(yàn)動(dòng)物腹壁缺損部位MASSON染色結(jié)果(HE×100)

免疫組化法檢測(cè)缺損部位組織CD31蛋白的表達(dá)，反映新生血管生成情況，試驗(yàn)組和對(duì)照組的CD31免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，試驗(yàn)組的腹膜下組織內(nèi)有肉芽組織形成，組織內(nèi)含未完全降解的樣品，樣品周圍肉芽組織內(nèi)含多量棕染的新生血管。而對(duì)照組中，肉芽組織內(nèi)含少量棕染的新生血管。由此可見(jiàn)，試驗(yàn)組的新生血管情況優(yōu)于對(duì)照組。

圖4 試驗(yàn)動(dòng)物腹壁缺損部位CD31免疫組化染色結(jié)果(HE×100)

缺損部位的膠原和新生血管生成情況可反映新生腹膜情況。相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組能夠更好地促進(jìn)缺損部位的修復(fù)，加速新生腹膜的形成。這可能是因?yàn)榉律蛷?fù)合補(bǔ)片具有優(yōu)異的防粘連效果，抑制了成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，從而為缺損部位間皮細(xì)胞、血管等的生長(zhǎng)提供優(yōu)良的修復(fù)環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究考察了仿生型復(fù)合補(bǔ)片及聚丙烯網(wǎng)補(bǔ)片植入4周后臟器與腹壁缺損區(qū)域的粘連情況及腹壁缺損部位的修復(fù)情況。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的粘連情況優(yōu)良率顯著優(yōu)于對(duì)照組。病理檢查結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的成纖維細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，缺損部位肉芽組織形成，兩組均有新生膠原纖維和血管，但試驗(yàn)組的新生血管多于對(duì)照組，表明試驗(yàn)組缺損部位腹膜重新生長(zhǎng)情況優(yōu)于對(duì)照組。說(shuō)明仿生型復(fù)合補(bǔ)片在修復(fù)缺損腹壁的同時(shí)，還具有較好的防粘連效果。