微波輔助復合酶法提取北五味子多糖的工藝研究

薛俊禮，呂 洋，楊艷艷，曹雪玲，吉惠杰

吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022

北五味子(SchisandrachinensisBaill.)是一種多年生落葉藤本植物，屬于木蘭科，主要生長在我國的東北地區(qū)。五味子果實作為珍貴的藥用資源，早在《神農本草經(jīng)》中，就已經(jīng)有了對其詳細的介紹和記載[1]。大量研究表明：木脂素、揮發(fā)油和多糖是北五味子最主要的化學成分，其中多糖在保護肝臟[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、促進免疫[5]等方面有著良好的效果。因此，探究高效的現(xiàn)代化提取方法，優(yōu)化工藝參數(shù)，增加多糖的得率，為五味子多糖的工業(yè)化生產提供新技術和路線意義重大。傳統(tǒng)上植物多糖的獲取主要采用加熱回流法[6-7]，該法需要冗長的提取時間、較高的溫度、大量的提取溶劑，且目標成分得率低[8]。

微波因具有較強的穿透能力、較高的加熱效率、對目標成分理想的選擇性萃取能力等顯著優(yōu)勢，在諸多植物主要活性成分的提取領域受到了越來越廣泛的關注[9-10]。酶法破壞細胞壁能力強，藥材中膠質和蛋白易于被水解，細胞內藥理活性成分容易釋放，亦逐漸應用到天然產物的提取領域[11]。因此，作者擬充分利用微波與酶的優(yōu)點，將兩種提取方法有機結合，并通過響應面試驗和正交試驗對工藝參數(shù)進行系統(tǒng)優(yōu)化，確定微波輔助酶法提取多糖的最佳工藝條件；此外，作者用纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的復合酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單一酶，并對3種酶的含量組成進行優(yōu)化，以充分利用酶的特異性和專一性優(yōu)勢，使北五味子多糖得到完全提取，為工業(yè)化生產提供重要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北五味子果實購買于吉林省通化市，其產地為長白山地區(qū)。

無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等試劑均為分析純。果膠酶(酶活20 000 U/g)、纖維素酶(酶活15 000 U/g)：上海藍季科技發(fā)展有限公司；木瓜蛋白酶(酶活50 000 U/g)：北京奧博星生物技術有限責任公司；試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

DZF-6050電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FA-2004A電子分析天平：上海精天電子儀器有限公司；YCYN-J1-3微波爐：上海鄆曹電子科技有限公司； RT-08多功能粉碎機：榮聰精密科技有限公司；722可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司； SHZ-D循環(huán)水式真空泵：河南省鞏義市英峪儀器一廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 北五味子的預處理[12]

將購買的北五味子果實在室溫下晾干，然后用粉碎機粉碎，過篩(80目)，得到均勻的北五味子粉。稱量50.0 g，加入150 mL沸程為60～90 ℃的石油醚，以水浴加熱的方式在90 ℃下回流12 h。除去石油醚萃取液，將藥渣加入300 mL 80%的乙醇溶液中，78 ℃下回流4 h，收集藥渣，即為預處理的五味子，備用。

1.3.2 復合酶組成的優(yōu)化及多糖提取工藝流程

取100 mL圓底燒瓶，依次加入1.0 g 預處理的五味子、 50 mL蒸餾水和一定質量分數(shù)(0.5%、 1.0%、 1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)的單一酶；然后將燒瓶置于50 ℃的恒溫水浴中，安裝好冷凝回流裝置，進行酶解，持續(xù)3 h。所得多糖提取液的混合物離心，收集上清液，燒瓶壁及黏附藥渣用適量二次蒸餾水洗滌2次，洗液與上清液合并，并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至少量體積。攪拌條件下，將無水乙醇加入多糖的濃縮液中至體積分數(shù)達到80%，然后置于4 ℃的冰箱中，沉淀12 h。抽濾、用95%乙醇洗滌沉淀，干燥，即得五味子粗多糖。試驗中分別采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶進行提取，探索不同的酶對提取五味子多糖的影響。

1.3.3 微波輔助酶法提取五味子多糖的工藝流程及條件優(yōu)化

取100 mL平底燒瓶，加入預處理的五味子1.0 g，然后用磨口玻璃塞封口，置于微波爐中，在無溶劑條件下輻射特定時間(2、4、6、8、10、12 min)。微波輻射結束后，取出平底燒瓶，分別加入50 mL特定pH(3、4、5、6、7、8)的檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液和經(jīng)過優(yōu)化的0.05 g復合酶(纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶的質量比為1∶2∶2)。待水浴溫度調至恒溫(25、35、45、55、65、75 ℃)時，浸入上述含有復合酶和五味子的圓底燒瓶，并安裝好回流裝置，持續(xù)一段時間(1、2、3、4、5、6 h)，完成復合酶對微波處理后的五味子的酶解及多糖的萃取。多糖萃取液按照1.3.2所述方法處理，獲得北五味子多糖?？疾煳⒉ㄝ椛鋾r間、提取劑pH值、酶解溫度、酶解時間對五味子多糖得率的影響。

1.3.4 多糖得率的測定

用葡萄糖作為標準物，通過苯酚-硫酸法[5-6]進行分析。以準確配制的葡萄糖質量濃度作為橫坐標， 490 nm處檢測的吸光度作為縱坐標，建立葡萄糖標準曲線。

按照下列公式計算多糖得率：

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

標準曲線及回歸方程見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

在標準曲線的質量濃度區(qū)間(10～70 μg/mL)內，測定的吸光度與標準物的質量濃度呈良好的線性關系。

2.2 復合酶組成的優(yōu)化試驗結果

2.2.1 單因素試驗結果

分別采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶提取五味子多糖，不同酶添加量對多糖得率影響結果見圖2。

圖2 酶添加量對五味子多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on the yield of polysaccharides

由圖2可知，隨著3種酶用量的增加，五味子多糖得率均呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的趨勢。這可能是因為酶用量太高時，溶液體系中的酶分子達到飽和狀態(tài)，從而抑制了五味子多糖的溶出[13]。纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶的最佳添加量分別為1.5%、2.0%、2.0%。因此，將由1.0%～2.0%的纖維素酶、1.5%～2.5%的木瓜蛋白酶和1.5%～2.5%的果膠酶組成的復合酶進行正交試驗優(yōu)化。

2.2.2 正交試驗結果

在探究單一酶用量對多糖得率影響的基礎上，基于L9(34)正交表，設計正交試驗對復合酶的組成進行優(yōu)化，試驗設計和安排見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

復合酶提取五味子多糖的正交試驗結果見表2。

表2 復合酶提取多糖的正交試驗結果Table 2 Orthogonal design for polysaccharide extraction by complex enzymatic method

由表2可知，不同酶對五味子多糖得率影響的主次順序為A>C>B，即纖維素酶>木瓜蛋白酶>果膠酶；最佳組合為A1B2C2，因此，確定復合酶纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶的質量比為1∶2∶2，且復合酶總質量分數(shù)為5%。

2.3 微波輔助復合酶提取五味子多糖的單因素試驗結果

微波輻射時間、提取劑pH值、酶解溫度和酶解時間對五味子多糖得率影響的試驗結果見圖3—圖6。

圖3 微波輻射時間對五味子多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave irradiation time on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

圖4 pH值對五味子多糖得率的影響Fig.4 Effect of pH on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

圖5 酶解溫度對五味子多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

圖6 酶解時間對五味子多糖得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of Schisandra chinensis Baill. polysaccharide

由圖3可知，在輻射的前8 min內，隨著微波輻射時間的持續(xù)延長，五味子多糖得率逐漸增加。后續(xù)進一步延長輻射時間，多糖得率不再發(fā)生明顯的改變。因此，選擇6～10 min進一步優(yōu)化。

由圖4可知，當提取劑的pH值從3變化到5時，五味子多糖的得率逐漸增加；pH值從5變化到8時，多糖得率顯著下降。原因可能是pH值對復合酶的活性影響比較大，過高過低都影響復合酶水解細胞壁的能力，因此，選擇pH 4～6為后續(xù)試驗的優(yōu)化區(qū)間。

由圖5可知，在起始一段時間內，隨著酶解溫度的升高，五味子多糖得率顯著增加；超過55 ℃后，多糖得率反而明顯下降。原因可能是過高的溫度破壞了復合酶的活性，因此，選擇45～65 ℃進一步優(yōu)化。

由圖6可知，當酶解時間從1 h延長到2 h時，五味子多糖得率急劇增加；進一步延長酶解時間，從2 h延長到5 h時，多糖得率幾乎不變。因此，選擇1～3 h進一步優(yōu)化。

2.4 微波輔助復合酶提取多糖的響應面結果分析

2.4.1 模型的建立及顯著性檢驗

為了對試驗工藝進行系統(tǒng)的探究和準確的評價，基于Box-Behnken 中心組合原理[6]，設計響應面優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表3。

表3 微波輔助酶法提取多糖的響應面優(yōu)化試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of RSM for polysaccharide extraction with microwave-assisted enzymatic method

采用Design-Expert 8.0軟件，對試驗工藝條件進行優(yōu)化并分析，結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface Box-Behnken design and results

采用二次多項式逐步回歸擬合法，對表4中29組多糖得率的數(shù)據(jù)進行分析，所得的方程如下：Y=14.32-0.57A-0.06B+0.06C+0.19D+0.05AB+0.06AC-0.12AD-0.22BC-0.14BD-0.12CD-0.43A2-0.09B2-0.18C2-0.04D2。

通過對方差和相關系數(shù)進行分析，可以對試驗的優(yōu)化模型進行準確的評價，統(tǒng)計結果見表5。

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

由表5可知，該模型的F=14.44，P<0.000 1，表明試驗所選用的二次多項模型極其顯著。在所有影響因素中，A、D、A2、C2的P值小于0.05，而酶解時間和微波輻射時間對多糖的提取有極顯著的影響；方程的交互項BC的P<0.05，表明酶解溫度和溶液pH值的交互作用對五味子多糖的提取影響很顯著，其余因素間的交互作用影響不顯著。本試驗失擬項的F=1.29，P>0.05，說明由于誤差造成的方程擬合缺陷無顯著性影響，數(shù)據(jù)中沒有異常點，模型適當，不需要引入更高次數(shù)的項；回歸方程的R2=93.52%，表明本試驗中93.52%的數(shù)據(jù)可以用該模型來解釋，微波輔助復合酶法提取北五味子多糖用此模型分析，可取得較為理想試驗結果。

2.4.2 提取工藝的響應曲面分析

為了更直觀地表示各因素及其交互作用對多糖得率的影響，可將酶解時間、pH值、提取溫度和微波輻射時間4個因素中的兩個固定在零水平，考察其余兩個因素對多糖得率的影響，結果見圖7。

由圖7a—7c可知，當酶解溫度、微波輻射時間和pH值3個因素取值相同時，在A因素方向，曲線變化明顯較陡，多糖得率隨著酶解時間的變化顯著改變，表明酶解時間對五味子多糖的得率影響極為顯著；由圖7c、圖7e、圖7f可知，固定酶解時間、pH值、酶解溫度，隨著微波輻射時間的改變，多糖得率發(fā)生明顯的改變，表明微波輻射時間對多糖得率的影響較顯著；分析圖7a—7f可知，酶解溫度與pH值對多糖得率的影響較小，表現(xiàn)為隨著該因素水平的改變，響應曲線變化較平緩。響應面分析試驗結果與回歸模型的方差分析試驗結果一致，進一步表明了響應面優(yōu)化模型能準確預測試驗結果。

圖7 各因素交互作用對多糖得率的響應面分析Fig.7 Response surface plots of different parameters interactions on the yield of polysaccharide

2.4.3 工藝條件優(yōu)化

通過 Design-Expert 8.0軟件對試驗因素水平的分析，得到最佳工藝參數(shù)：酶解時間1.2 h，酶解溫度58 ℃，微波輻射時間10 min，pH 4.0，此時五味子多糖得率14.92%。在此參數(shù)下平行操作3次試驗，五味子多糖的平均得率為14.87%，與響應面所優(yōu)化模型的理論預測值很接近，表明試驗所采用的響應面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確度高。

2.5 不同方法提取五味子多糖的比較

為了對試驗建立的提取技術進行準確評價，筆者亦采用其他現(xiàn)代技術和傳統(tǒng)的回流法提取了北五味子多糖。根據(jù)文獻報道的最佳工藝參數(shù)，分別通過微波輔助技術[14]、超聲波法[15]、回流法[7]和纖維素酶法[16]4種方法提取多糖，每個方法平行試驗3次，結果見表6。

表6 不同方法提取多糖的比較Table 6 Comparison of different methods for polysaccharide extraction

由表6可知,采用的5種提取方法中，北五味子多糖的得率呈現(xiàn)一定的差別，由高到低的順序依次為微波輔助酶法>纖維素酶法>微波輔助熱水回流法>超聲波輔助法>傳統(tǒng)熱水回流法。此外，不同提取技術所需工藝參數(shù)各不相同：傳統(tǒng)熱水回流法提取溫度最高，且耗費時間最多，提取長達5 h；纖維素酶法所需時間僅次于回流法，需要3 h；超聲波法需3次提取，累計時間低于纖維素酶法；微波輔助法提取時間最短，僅需7 min便可完成提取。整體分析，與單一酶法提取技術比較，微波輔助復合酶法的提取時間較短，提取溫度適中，且多糖得率明顯提高，取得了較理想的提取效果。

將微波輔助復合酶法應用到了北五味子多糖的提取領域，該技術結合了微波輔助法和復合酶法的優(yōu)點。通過先微波處理后復合酶的酶解作用，細胞破壁能力得到進一步加強，溶劑分子對藥材基體的滲透和待提取成分的溶劑化急劇加速，顯著促進了目標成分從細胞到提取溶劑中的傳質作用。該技術相對于傳統(tǒng)的熱水回流法和單一酶提取法，不僅耗費時間短，而且目標成分得率高，是一種很有前景的多糖提取技術。

3 結論

探索了微波輔助復合酶萃取北五味子多糖的工藝條件。首先采用正交優(yōu)化試驗確定了復合酶由1%纖維素酶、2%木瓜蛋白酶和2%的果膠酶組成；然后設計響應面優(yōu)化試驗對微波輔助復合酶萃取法的工藝進行了優(yōu)化，確定最佳參數(shù)：酶解時間1.2 h，酶解溫度58 ℃，微波輻射時間10 min，pH 4.0。在此工藝下，五味子多糖平均得率為14.87%。與超聲波輔助法、纖維素酶法和熱水回流法3種提取技術相比，該新方法提取時間較短，能耗低，多糖得率高。微波輔助酶法充分結合了微波和復合酶兩種提取方法的優(yōu)點，細胞破壁能力強，目標成分擴散容易，傳質快，且操作簡單，能耗低，為工業(yè)化大量生產北五味子多糖提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。