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    豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法及其引物

    2021-01-27 04:02:24
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2020年21期
    關(guān)鍵詞:定量特異性試劑盒

    冷超糧/南陽理工學(xué)院 473000

    1 研究背景

    豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是豬的一種急性、高度接觸性的傳染性病毒。它引起的豬瘟(Classical swine fever,CSF),臨床上主要表現(xiàn)為稽留高熱、皮膚和粘膜有大量出血點以及白細胞減少癥等。CSF被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和我國農(nóng)業(yè)部列為一類動物傳染病。各年齡段、各類型豬均易感。因其流行廣,發(fā)病率及死亡率高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。近年來,多種CSFV新亞型變異毒株不斷出現(xiàn),給該病的防控帶來了更為嚴峻的挑戰(zhàn)。因此,建立快速、靈敏、成本低又操作方便的檢測方法十分必要。本實驗將建立新型豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。

    2 實驗方法和步驟

    2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)實驗室保存的CSFV毒株HNC1NS5B的基因序列,比對GenBank中CSFV各亞型代表株,Shimen(AF092448)、HCLV(AF091507)、Brescia(AF091661)、Paderborn(GQ902941)、Alfort(J04358)、Zj0801(FJ529205)和JSZL(KT119352)的5‘NTR序列,設(shè)計特異性引物,擴增目的片段大小為98bp,引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成;

    上游引物QCSFV-F,序列為:CCCTCCAGCGACGGCCG;

    下游引物QCSFV-R,序列為:ACTTAGACCACCCAGGGAG;

    2.2 5‘NTR基因的克隆

    2.2.1 待PK-15細胞長到單層約90%密度時,將培養(yǎng)基棄去并用PBS溶液洗滌2次,按照MOI: 0.5的量將CSFV HNC1病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中,并補充無血清的DMEM培養(yǎng)基至5mL,將培養(yǎng)瓶放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4~5d,然后將培養(yǎng)瓶放入-80℃冰箱,反復(fù)凍融3次后將病毒液取出,以9000g離心5min,取上清-80℃保存?zhèn)溆?。病毒RNA提取按照北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書,取200μL已離心的病毒液上清進行總RNA提取。

    2.2.2 按照北京全式金生物技術(shù)有限公司TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄,總cDNA樣品保存至-80℃?zhèn)溆?。按照北京全式金生物技術(shù)公司Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity (HiFI)試劑盒說明書進行PCR。PCR反應(yīng)體系 為 20μL:10×HiFi Buffer I:2μL;2.5mM dNTPs:2μL;QCSFV-F:1μL(終濃度為 0.1μM);QCSFV-R:1μ( 終濃度為 0.1μM)L;HiFi DNA polymerase:0.5μL;cDNA:1μL;ddH2O: 12.5μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5min,再以35個循環(huán)進行PCR擴增,擴增條件為95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,最后再72℃延伸10min。

    PCR擴增完成后,取10μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳確定,鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物用OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒純化回收,然后克隆到pMD18-T載體,并轉(zhuǎn)化到DH5α平板,挑取陽性克隆,并進行測序鑒定。

    2.3 標(biāo)準曲線的建立 用OMEGA Plasmid Mini Kit I試劑盒提取重組質(zhì)粒,然后用紫外分光光度計定量。將計算好拷貝數(shù)的標(biāo)準DNA模板以10倍系列稀釋標(biāo)準品,稀釋為終濃度在4.49×102~108copies/μL。定量RT-PCR反應(yīng)體系為25μL:SYBR?Premix Ex Taq(2×):12.5μL;QCSFV-F:1μL(終濃度為 0.1μM);QCSFV-R:1μL(終濃度為 0.1μM);DNA模板:2μL;ddH2O: 8.5μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 10min,再以39個循環(huán)進行PCR擴增,擴增條件為95℃變性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s,最后再先降到65℃持續(xù)5s,再升到95℃,再增加0.5℃結(jié)束,用以來繪制溶解曲線。儀器使用BIO-RAD CFX96TM Real Time System。

    2.4 敏感性、特異性、重復(fù)性試驗

    2.4.1 利用普通PCR和本實驗建立的熒光定量RT-PCR檢測方法分別檢測100~107TC ID50/m L不同模板量的病毒液,比較兩種方法檢測的敏感性。

    2.4.2 利用本實驗建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法,分別檢測CSFV HNC1株、PRRSV、PRV、PEDV 和PCV2。進行特異性試驗。

    2.4.3 取拷貝數(shù)為 105copies/μL、106copies/μL、107copies/μL的模板分別進行5次批內(nèi)和批間重復(fù)試驗,以驗證 CSFV 熒光定量RT-PCR檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

    2.5 臨床樣品的檢測 臨床組織樣品(肺、脾、腎和淋巴結(jié)等),經(jīng)勻漿后離心取上清或血清樣品,按照前述的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)方法進行檢測。根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果和標(biāo)準曲線計算樣品中病毒的含量。熒光定量PCR儀會自動顯示樣品的濃度。

    3 結(jié)果判斷

    3.1 5‘NTR基因的克隆 以 CSFV HNC1cDNA 為模板,利用自行設(shè)計的引物,PCR 擴增 5‘NTR基因片段,PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測,與 DNA Marker 比較,結(jié)果顯示在98bp 有特異性 DNA 條帶,鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物(見圖1)。

    圖1 CSFV HNC1 5‘NTR基因的PCR擴增

    3.2 標(biāo)準曲線的建立 對樣品進行熒光定量RT-PCR檢測,使用儀器BIO-RAD CFX96TM Real Time System,繪制溶解曲線。在稀釋的線性濃度范圍內(nèi),模板量與對應(yīng)的Ct值之間線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.998。Ct值分別為32.78、28.84、24.83、21.05、17.28、14.03和 9.49,標(biāo)準曲線的斜率為 -3.780,截距為42.686,直線方程為y=-3.780x+42.686(圖2)。

    圖2 熒光定量RT-PCR檢測CSFV的擴增曲線(A)和標(biāo)準曲線(B)

    3.3 敏感性試驗 普通PCR最低能檢測到105TCID50病毒液(圖3),而該方法能檢測的最低模板量為101TCID50病毒液(圖4),比普通PCR檢測方法敏感10000倍。

    圖3 普通RT-PCR檢測CSFV敏感性試驗結(jié)果

    圖4 熒光定量RT-PCR檢測CSFV敏感性試驗結(jié)果

    3.4 特異性試驗 利用本實驗建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法,檢測只有CSFV HNC1株檢測結(jié)果為陽性,其他對照樣品檢測結(jié)果均為陰性(圖5)

    圖5 熒光定量RT-PCR檢測CSFV特異性試驗結(jié)果

    3.5 重復(fù)性試驗 取拷貝數(shù)為 105copies/μL、106copies/μL、107copies/μL的模板分別進行5次批內(nèi)和批間重復(fù)試驗,結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)均小于1%,批間變異系數(shù)均小于2%,說明該方法具有較好的重復(fù)性(見下表)。

    C o p i e s/μ L n V i r a l s a m p l e s批內(nèi)重復(fù)域值(C T值)批間重復(fù)域值(C T值)M e a n s S D C V(%)M e a n s S D C V(%)S a m p l e 1 1 0 5 5 2 2.5 1 0.2 2 0.9 7 2 2.9 4 0.3 7 1.6 6 S a m p l e 2 1 0 5 5 1 9.4 5 0.1 1 0.5 5 1 9.6 3 0.3 0 1.5 3 S a m p l e 3 1 0 5 5 1 5.2 2 0.1 4 0.9 4 1 5.1 1 0.2 2 1.4 7

    4 小結(jié)

    目前CSFV的病原檢測方法有間接免疫熒光(IFA)、抗原捕獲ELISA、普通的RT-PCR和熒光定量RT-PCR等。IFA需要較昂貴的顯微鏡和有經(jīng)驗的實驗人員,且該法經(jīng)驗性較強,耗時長,難度大。基于抗原捕獲ELISA法的試劑盒主要依賴進口,價格昂貴,而且敏感度較低,不利于普及。普通的RT-PCR方法具有操作簡便、快速和特異性強等特點,但在病毒含量較低時,會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。熒光定量RTPCR方法具有更高的敏感性、特異性和準確性等優(yōu)點,受到多數(shù)學(xué)者的青睞。之前有學(xué)者成功建立了基于探針的熒光定量RT-PCR方法,但該法過于昂貴,且需要特殊的配套儀器。其他學(xué)者有建立的基于熒光染料的熒光定量RT-PCR方法,但使用的引物是基于病毒的變異較大E2蛋白設(shè)計,特異性差,不利于對多種不同亞型CSFV毒株的擴增。

    由于以上存在的諸多問題,本實驗參考國內(nèi)外流行的多種CSFV亞型毒株,基于高度保守的5‘NTR區(qū),設(shè)計合成特異性引物,成功建立了豬瘟病毒SYBR?Green I熒光定量RT-PCR檢測方法。該法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性,可用于所有亞型CSFV毒株的的快速檢測。

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