長(zhǎng)鏈非編碼RNA富核轉(zhuǎn)錄本 1和INK 4位點(diǎn)反義非編碼RNA在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價(jià)值

周天磊，陳萍#，唐玲玲，汪毅

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212001

胸腔積液是由各種疾病引起的常見(jiàn)并發(fā)癥，惡性疾病是胸腔積液的主要原因之一，約有2/3的惡性胸腔積液由肺癌、乳腺癌、淋巴瘤導(dǎo)致[1]。惡性胸腔積液的存在通常提示疾病已處于晚期，正確的診斷對(duì)進(jìn)一步的治療至關(guān)重要，因此，新的腫瘤標(biāo)志物用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷成為了研究的熱點(diǎn)。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色[2]。研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA富核轉(zhuǎn)錄本1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，并且參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及凋亡[3-4]。INK4位點(diǎn)反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）也有類似的報(bào)道，研究表明，ANRIL在肺癌和乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常肺組織和乳腺組織，且促進(jìn)了肺癌組織對(duì)順鉑的耐藥，并被認(rèn)為可以作為腫瘤預(yù)后判斷的指標(biāo)以及治療的靶點(diǎn)[5-7]。然而，NEAT1和ANRIL在良惡性胸腔積液中的表達(dá)水平尚不清楚。因此，本研究以良惡性胸腔積液患者作為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)NEAT1與ANRIL在胸腔積液中的相對(duì)表達(dá)量，探討其在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年7月至2019年7月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的100例胸腔積液患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次就診的胸腔積液患者；②良性胸腔積液患者的原發(fā)病灶均可通過(guò)臨床表現(xiàn)、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)特征明確診斷；③惡性胸腔積液患者的原發(fā)病灶均可通過(guò)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本收集前患者采用過(guò)藥物治療。100例患者中，良性和惡性胸腔積液患者均為50例。良性胸腔積液患者中，男32例，女18例；年齡20～83歲，平均（63.30±14.08）歲；炎性胸腔積液17例，結(jié)核性胸腔積液27例，心功能不全、乳糜性胸腔積液、低蛋白血癥各2例。惡性胸腔積液患者中，男 28例，女 22例；年齡 41～86歲，平均（69.63±12.01）歲；肺癌41例（肺腺癌32例，肺鱗狀細(xì)胞癌6例，小細(xì)胞肺癌3例），卵巢癌2例，胃癌2例，惡性淋巴瘤2例，前縱隔B型胸腺瘤、前列腺癌及食管癌各1例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑和儀器

Trizol試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成；QuantStudio?5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，MyCycler PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Micro21R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Colibri超微量分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Berthold Detection Systems公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胸腔積液處理 收集患者的胸腔積液標(biāo)本200 ml，采用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，30 min內(nèi)進(jìn)行如下處理：①將200 ml胸腔積液標(biāo)本分裝于50 ml離心管內(nèi)，4℃條件下1060 r/min離心5 min，棄上清留沉淀；②向沉淀中加入3000 μl紅細(xì)胞裂解劑，吹打混勻，并于4℃條件下520 r/min離心5 min，棄上清留沉淀；③加入3000 μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），吹打混勻，充分洗滌沉淀，繼續(xù)于4℃條件下1060 r/min離心5 min，棄上清；④重復(fù)②③步驟各1次，取沉淀加入1 ml Trizol液，吹打混勻后于-80℃凍存?zhèn)溆?。同時(shí)留取10 ml胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）測(cè)定。

1.3.2 RNA提取 ①將上述處理后的標(biāo)本常溫解凍，取500 μl，加入100 μl氯仿，充分振蕩，靜置5 min后，4℃條件下12 275 r/min離心15 min；②吸取上清液200 μl，加入等量異丙醇，上下顛倒后于室溫下靜置10 min，然后于4℃條件下12 275 r/min離心10 min，棄上清留沉淀；③向沉淀中加入500 μl 75%乙醇，充分振蕩洗滌沉淀，并于4℃條件下7970 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，重復(fù)洗滌兩次；④將沉淀置于室溫下干燥至無(wú)色透明，加入100 μl焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水充分溶解；⑤測(cè)定RNA的純度及濃度，D260nm/D280nm在1.8～2.0之間，濃度在300～500 ng/μl之間視為可用標(biāo)本。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，于冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，RNA溶液和逆轉(zhuǎn)錄試劑總體積為20 μl。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃5 s，85℃15 min，4℃保存。合成的cDNA隨即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也可置于-20℃冷凍備用。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，于冰上配制PCR反應(yīng)液，cDNA溶液和相應(yīng)的PCR試劑總體積為20 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃5 s，退火和延伸60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參基因。每個(gè)標(biāo)本的兩個(gè)目的基因（NEAT1和ANRIL）和內(nèi)參基因重復(fù)測(cè)定3次，記錄Ct值，3次測(cè)定的Ct值相差小于0.005視為可用Ct值，取均值。采用2-Ct法計(jì)算各個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。所有基因的引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。GAPDH上游引物為5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物為5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；NEAT1上游引物為 5'-TCCTTGCCTCCACTCCAATCCAG-3'，下游引物為5'-GCACTGCCATCAACACCTCCTG-3'；ANRIL上游引物為5'-AGCAGACATTGGAGTGAACGCATC-3'，下游引物為5'-TTGACTGGACCTGGTGGCTACG-3'。

1.4 觀察指標(biāo)

以病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析NEAT1、ANRIL和CEA對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能。靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)（/真陽(yáng)性+假陰性）例數(shù)×100%，特異度=真陰性例數(shù)（/真陰性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)（/真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）例數(shù)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)（/真陰性+假陰性）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真陽(yáng)性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或近似t檢驗(yàn)。根據(jù)NEAT1和ANRIL基因的相對(duì)表達(dá)量，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，獲取曲線下面積（area under the curve，AUC），依此確定臨界（cut-off）值，并通過(guò)計(jì)算靈敏度、特異度等指標(biāo)評(píng)估兩種lncRNA對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 良惡性胸腔積液中NEAT 1和ANRIL相對(duì)表達(dá)量的比較

良性胸腔積液中NEAT1的相對(duì)表達(dá)量為（0.020±0.013），明顯低于惡性胸腔積液的（0.075±0.047），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.073，P＜0.01）。良性胸腔積液中ANRIL的相對(duì)表達(dá)量為（0.001±0.001），明顯低于惡性胸腔積液的（0.004±0.005），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.463，P＜0.01）。

2.2 NEAT 1、ANRIL和CEA診斷惡性胸腔積液的ROC曲線

ROC曲線分析結(jié)果顯示，NEAT1和ANRIL診斷惡性胸腔積液的AUC值分別為0.815（SE=0.042，95%CI：0.732～0.897）和 0.807（SE=0.043，95%CI：0.723～0.890），均大于CEA診斷惡性胸腔積液 的AUC值0.730（SE=0.051，95%CI：0.629～0.831）。此外，NEAT1和ANRIL聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的 AUC值為 0.894（SE=0.031，95%CI：0.833～0.954）。（圖1）

圖1 NEAT 1、ANRIL和CEA診斷惡性胸腔積液的ROC曲線

2.3 NEAT 1、ANRIL和CEA對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果，確定NEAT1、ANRIL診斷惡性胸腔積液的臨界值分別為0.0501、0.0006，此時(shí)這兩個(gè)指標(biāo)診斷惡性胸腔積液的靈敏度及特異度最佳。此外，臨床中通常將5.0 μg/L作為CEA的最高臨界值。NEAT1和ANRIL聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度均高于NEAT1、ANRIL和CEA單獨(dú)診斷的結(jié)果。（表1）

表1 NEAT 1、ANRIL和CEA對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能（%）

2.4 不同臨床特征惡性胸腔積液患者中NEAT 1和ANRIL相對(duì)表達(dá)量的比較

不同腫瘤組織來(lái)源、肺癌組織類型、性別、年齡、吸煙史、糖尿病或心血管病發(fā)生情況的惡性胸腔積液患者中NEAT1和ANRIL的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

3 討論

惡性胸腔積液診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是組織活檢和細(xì)胞學(xué)檢查。胸膜組織活檢具有較高的陽(yáng)性率，但操作復(fù)雜，創(chuàng)傷性和風(fēng)險(xiǎn)較大，而細(xì)胞學(xué)檢查雖然操作簡(jiǎn)便，但靈敏度較低[8-9]。近年來(lái)，臨床中采用腫瘤標(biāo)志物鑒別良惡性胸腔積液，CEA被認(rèn)為是最具有臨床價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。盡管有研究報(bào)道了CEA鑒別良惡性胸腔積液的臨床價(jià)值，但其靈敏度和特異度均不理想[10]。隨著基因組技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明lncRNA不僅能夠在腫瘤組織中被檢測(cè)出，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲，而且在腫瘤患者的血清、尿液、胸腔積液等易于獲得的體液中也均被檢測(cè)出[11-12]。本研究選擇了NEAT1和ANRIL作為目的基因，探討其在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價(jià)值。

表2 不同臨床特征惡性胸腔積液患者中NEAT 1和ANRIL的相對(duì)表達(dá)量（ n=50）

NEAT1是新發(fā)現(xiàn)的一種限制性lncRNA，被譽(yù)為眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。近年來(lái)的一些研究表明，NEAT1通過(guò)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了腫瘤組織的增殖和侵襲。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1在肺癌組織中高表達(dá)，高表達(dá)的NEAT1抑制了高遷移率族蛋白2（high mobility group box protein 2，HMGB2）的表達(dá)，從而降低了微小RNA（microRNA，miRNA）-181a-5p的表達(dá)水平，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。Jiang等[4]研究表明，NEAT1在乳腺癌中高表達(dá)，并且可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，通過(guò)與miRNA-448競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1），從而參與乳腺癌的進(jìn)展。該研究還證明，NEAT1在肺癌和乳腺癌中的表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，并且可以作為腫瘤預(yù)后的判斷指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，NEAT1在惡性胸腔積液中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于良性胸腔積液（t=6.073，P＜0.01），與上述研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果還顯示，不同腫瘤組織來(lái)源、肺癌組織類型、性別、年齡、吸煙史、糖尿病或心血管病發(fā)生情況的惡性胸腔積液患者中NEAT1的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明惡性胸腔積液患者中NEAT1的表達(dá)水平與上述臨床特征無(wú)關(guān)。

ANRIL最先在黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)和命名[13]。全基因組關(guān)聯(lián)研究將ANRIL基因作為冠狀動(dòng)脈疾病、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、2型糖尿病和惡性腫瘤共同的遺傳易感基因位點(diǎn)，使得ANRIL逐漸成為研究的熱點(diǎn)[14-15]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，ANRIL在多種腫瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。Zhang等[16]的研究證實(shí)了ANRIL在胃癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)與多梳抑制復(fù)合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）結(jié)合調(diào)控雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）和周期蛋白依賴性激酶 6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）/E2F轉(zhuǎn)錄因子 1（E2F transcription factor 1，E2F1）通路并沉默miRNA-99a/miRNA-449a的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Nie等[5]研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL可以通過(guò)直接與PRC2的核心亞基zeste增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）結(jié)合沉默KLF2的表達(dá)以及抑制p21的轉(zhuǎn)錄，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，Xu等[17]的研究表明，ANRIL在三陰性乳腺癌中呈高表達(dá)，并通過(guò)與miRNA-199a的相互作用抑制miRNA-199a的抑癌作用。本研究結(jié)果顯示，惡性胸腔積液中ANRIL的相對(duì)表達(dá)量明顯高于良性胸腔積液（t=3.463，P＜0.01），且不同腫瘤組織來(lái)源、肺癌組織類型、性別、年齡、吸煙史的惡性胸腔積液患者中ANRIL的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明惡性胸腔積液患者中ANRIL的表達(dá)水平與上述臨床特征無(wú)關(guān)。有研究表明，ANRIL還與冠狀動(dòng)脈疾病、2型糖尿病等多種人類疾病相關(guān)[18-19]。因此，本研究分析了惡性胸腔積液患者中ANRIL表達(dá)情況與糖尿病或心血管疾病的關(guān)系，結(jié)果顯示，有糖尿病或心血管疾病和無(wú)糖尿病或心血管疾病的惡性胸腔積液患者中ANRIL的相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），排除了糖尿病或心血管疾病對(duì)惡性胸腔積液患者中ANRIL表達(dá)情況的影響。

本研究結(jié)果顯示，NEAT1和ANRIL在惡性胸腔積液中的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于良性胸腔積液，二者診斷惡性胸腔積液的AUC值分別為0.815和0.807，均大于CEA診斷惡性胸腔積液的AUC值0.730。NEAT1和ANRIL聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確度均高于NEAT1、ANRIL和CEA單獨(dú)診斷的結(jié)果。NEAT1診斷惡性胸腔積液的靈敏度和特異度分別為78.0%和84.0%，與CEA的76.0%和82.0%差異不明顯。而ANRIL診斷惡性胸腔積液的靈敏度為84.0%，高于CEA的76.0%，但特異度僅為58.0%，假陽(yáng)性率和誤診率較高。NEAT1和ANRIL聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，其靈敏度和特異度分別為86.0%和92.0%，均高于CEA，假陽(yáng)性率降低，準(zhǔn)確度升高。表明聯(lián)合檢測(cè)胸腔積液中的腫瘤標(biāo)志物對(duì)良惡性胸腔積液的鑒別診斷作用更為顯著。此外，本研究結(jié)果顯示，肺癌和非肺癌患者惡性胸腔積液中NEAT1和ANRIL的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明NEAT1和ANRIL在惡性胸腔積液中的表達(dá)水平與患者的腫瘤組織來(lái)源無(wú)關(guān)。由于樣本主要來(lái)源于肺癌，胸腔積液的出現(xiàn)往往提示疾病進(jìn)入晚期，本研究未能對(duì)腫瘤分期進(jìn)行相關(guān)分析，后續(xù)將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步分析腫瘤分期與惡性胸腔積液中NEAT1和ANRIL表達(dá)的關(guān)系。

綜上所述，NEAT1和ANRIL在惡性胸腔積液中的表達(dá)水平均高于良性胸腔積液，且其在惡性胸腔積液中的表達(dá)水平與腫瘤組織來(lái)源、年齡、性別等無(wú)關(guān)。NEAT1和ANRIL表達(dá)水平的檢測(cè)對(duì)良惡性胸腔積液的鑒別診斷具有一定的臨床意義，有可能成為鑒別良惡性胸腔積液的生物標(biāo)志物，而二者聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高良惡性胸腔積液的診斷效能。