大蒜素對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制

萬慧芳，梁笑傾，劉卓琦,楊曉紅,張霞麗，李 華，萬福生*

(南昌大學(xué)a.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；b.第四附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;d.實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)中心，江西 南昌 330006)

卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1-2]。卵巢癌早期癥狀隱匿，患者就診時(shí)通常有60%～70%的人處于晚期[3]。盡管經(jīng)過初次手術(shù)和化療可達(dá)到完全緩解，但多數(shù)晚期患者仍會在2～3年后復(fù)發(fā)，甚至出現(xiàn)化療耐藥而死亡[4]。因此，尋找高效低毒的分子靶向藥物，以提高療效，減少卵巢癌死亡率是全世界亟待解決的重大問題。

大蒜素(diallyl trisulfide，DT)是百合科蔥屬草本植物的地下鱗莖大蒜中的主要有效成分，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物，其結(jié)構(gòu)式為CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素具有活血化瘀、益氣解毒、宣通溫補(bǔ)之功效[5]，其抗腫瘤作用在基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中逐漸被證實(shí)，已作為多種癌癥的輔助治療藥物投入臨床使用，在婦科惡性腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。大量研究表明[5-9]，大蒜素對卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病等腫瘤生長有明顯抑制作用，且還能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[8]，但它對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響則少有研究報(bào)道。本文以人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和ES-2細(xì)胞為研究對象，觀察了大蒜素對卵巢癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制，旨在為大蒜素用于卵巢癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和ES-2細(xì)胞株購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、細(xì)胞裂解液均購自于Solarbio公司，GSK-3β單克隆抗體(Cat.Ab32391)，pho-GSK-3β(Ser9)單克隆抗體(Cat.ab75814)，E-cadherin單克隆抗體(Cat.Ab1416，Abcam公司)，Vimentin單克隆抗體(Cat.Ab92547),N-cadherin多克隆抗體(Cat.Ab18203),MMP2多克隆抗體(Cat.Ab37150),MMP7多克隆抗體(Cat.Ab5706),MMP9多克隆抗體(Cat.Ab38898),辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)北京中杉金橋公司，大蒜素注射液(購自上海禾豐制藥公司,批號:H31022371)，CCK8試劑(上海東仁化學(xué)科技有限公司)。

1.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖活性

在含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基中，用0.25%胰酶消化傳代,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組(control，不含DT)、DT 2.5，DT5.0，DT10.0和DT 20.0 μg·mL-1組。

取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化制成密度約3×104個(gè)·mL-1單細(xì)胞懸液，以100 μL每孔接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共接種3塊96孔板。經(jīng)過夜貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，換成含不同溶度DT(0，2.5，5.0，10，20 μg·mL-1)的完全培養(yǎng)基，分別進(jìn)行處理24，48，72 h。從第二天開始，在固定時(shí)間點(diǎn)，每隔12 h取1塊96孔板，更換并加入100 μL新培養(yǎng)基(其中含有10 μL CCK8)，孵育3 h。在波長450 nm處測定其吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力

將生長良好的細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h，用含0.25% EDTA的胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化，無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×105個(gè)·mL-1。在Transwell小室的上室內(nèi)加入200 μL上述細(xì)胞懸液，24孔板中的下室加入600 μL含不同濃度DT的10%血清的培養(yǎng)基，小室置于24孔板中，48 h后收小室。用棉簽擦去上室細(xì)胞，PBS清洗3次后用4%細(xì)胞組織固定液固定細(xì)胞20 min，晾干后用1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌3次。小室干燥后在倒置顯微鏡下觀察并使用圖像采集系統(tǒng)選取上、中、下、左、右5個(gè)視野于100倍鏡下進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)并求其平均穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力

先將Matrigel膠分別與不含血清的H-DMEM和RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1:8的比例混合均勻(在冰上進(jìn)行)。取該混合物60 μL鋪于已預(yù)冷的小室中，將小室置于24孔板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜凝固成膠狀。然后接種細(xì)胞于小室中，接種于小室的細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)·孔-1，其余步驟與Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)一致，計(jì)算細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次。

1.5 Western blot檢測卵巢癌細(xì)胞蛋白表達(dá)

收集經(jīng)DT處理48 h的卵巢癌細(xì)胞，在冰上用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，12 000 r·min-1離心(4 ℃)10 min，取上清液。采用PierceBCA ProteinAssayKit試劑盒檢測蛋白濃度，按20 μg蛋白上樣量將蛋白樣品與上樣緩沖液(5×)按4:1的體積比例混合，沸水中煮5 min使蛋白變性。冷卻后，經(jīng)10%SDS-PAGE并半干電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入PTEN、AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、Vimentin、β-catenin等抗體，并4 ℃孵育過夜。次日，在室溫下加二抗孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X線膠片曝光成像，掃描儀掃描蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，組間進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)，假若方差齊性，則使用LSD(L)法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊性時(shí)，使用Dunnett,s(T3)法分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 DT對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用

經(jīng)不同濃度DT(0，2.5，5.0，10.0和20.0 μg·mL-1)分別處理卵巢癌SKOV-3細(xì)胞和ES-2細(xì)胞24，48和72 h。細(xì)胞增殖結(jié)果(見圖1)顯示，與control組比較，濃度為2.5～20.0 μg·mL-1的DT作用SKOV-3和ES-2細(xì)胞24，48和72 h后，對這兩種細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.05)，且呈一定的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。

2.2 DT對卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

利用Transwell小室觀察DT對SKOV-3和ES-2細(xì)胞侵襲與遷移的影響(見圖2和圖3)。結(jié)果顯示，與control(對照組)組比較，DT處理48 h后，兩種卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用均隨著DT濃度的增大而減小，穿膜細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，DT對卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲的抑制率顯著升高(P<0.05)。

2.3 DT對人卵巢癌細(xì)胞EMT和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)的影響

Western blot檢測EMT相關(guān)因子和MMPs的表達(dá)變化，結(jié)果如圖4和圖5所示。DT處理SKOV-3和ES-2細(xì)胞48 h后，與control(對照組)組比較，隨著DT濃度的增加，這兩種細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)均顯著上調(diào)；相反，N-cadherin和Vimentin表達(dá)則呈現(xiàn)下降(圖4)。同樣，與control組比較，MMP2、MMP7和MMP9表達(dá)水平也隨著DT濃度的增加而降低(圖5)，這些結(jié)果表明DT可以阻礙SKOV-3和ES-2細(xì)胞EMT的進(jìn)程和下調(diào)MMPs表達(dá)。

2.4 DT對人卵巢癌細(xì)胞中AKT/GSK-3β/β-catenin通路的影響

通過免疫印跡分析SKOV-3和ES-2細(xì)胞中PTEN、AKT、GSK-3β和β-catenin的蛋白水平(圖6和圖7)。結(jié)果顯示，隨著DT濃度增加，兩種細(xì)胞的p-AKT，p-GSK-3β水平均逐漸呈顯著性上調(diào)(P<0.05)，而AKT、GSK-3β則表現(xiàn)不同程度的降低(P<0.05)；且β-catenin表達(dá)水平也呈顯著性下調(diào)(P<0.05)。此外，PTEN也有不同程度的升高(PTEN是AKT/GSK-3β/β-catenin通路上游信號分子)。此結(jié)果表明DT對AKT/GSK-3β/β-catenin通路有一定的調(diào)控作用。

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，絕大多數(shù)的卵巢癌是上皮性癌，盡管治療方法在不斷進(jìn)步，但上皮性卵巢癌5年生存率也僅有30%。卵巢癌早期癥狀隱匿，60%～70%患者就診時(shí)已處于晚期[10]。卵巢癌易侵襲轉(zhuǎn)移也是卵巢癌患者生存期短、預(yù)后差的又一個(gè)重要原因。此外，癌細(xì)胞耐藥性也是婦科腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后差的又一個(gè)重要原因[11]。卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移過程涉及到多種途徑，近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬和微小RNA(microRNA，miRNA)與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移過程倍受關(guān)注[12-13]。因此，尋找高效低毒的分子靶向藥物，提高卵巢癌化療療效、減少腫瘤細(xì)胞耐藥、控制卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移，降低卵巢癌死亡率是全世界亟待解決的重大問題。近年來大量的研究提示大蒜素對于腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化有一定的抑制作用[14-17]，已作為多種癌癥輔助治療的藥物，在婦科及其他惡性腫瘤治療中都具有廣闊的應(yīng)用前景。

我們實(shí)驗(yàn)室早期研究結(jié)果顯示[9,18-19]：大蒜素對SKOV-3/DDP細(xì)胞有顯著的抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，增加SKOV-3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，其機(jī)制與大蒜素能調(diào)控PUMA、Bax、Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)和增強(qiáng)Caspase-3活性相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(PUMA)在大蒜素誘導(dǎo)人上皮性卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株(SKOV-3/DDP)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[19]。本文結(jié)果表明，DT對卵巢癌SKOV-3和ES-2細(xì)胞的侵襲遷移具有顯著性抑制作用，且有一定的濃度依賴性(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)DT能增加卵巢癌細(xì)胞中E-cadherin、p-AKT和p-GSK-3β蛋白表達(dá)，下調(diào)N-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白水平(圖6和圖7)，此結(jié)果提示DT對卵巢癌SKOV-3和ES-2細(xì)胞EMT過程有顯著的抑制作用，其機(jī)制與AKT/GSK-3β/β-catenin通路相關(guān)，特別是GSK-3β在其中起重要作用。GSK-3β是一種由絲氨酸/蘇氨酸組成的多功能激酶，在調(diào)節(jié)糖原代謝起關(guān)鍵作用，同時(shí)它又是PI3K/AKT信號通路下游基因，可磷酸化Snail轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控EMT。GSK-3β是Wnt/β-catenin信號途徑的關(guān)鍵因子，可以直接調(diào)控胞漿中β-catenin蛋白的穩(wěn)定性。在Wnt經(jīng)典信號中,E-cadherin可以與細(xì)胞內(nèi)的β-catenin形成特殊地復(fù)合體,并直接連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架上,從而保證上皮細(xì)胞的完整和功能發(fā)揮。而E-cadherin的缺失或下調(diào)是EMT發(fā)生過程中的重要標(biāo)志之一。此外，本文結(jié)果還顯示DT能下調(diào)卵巢癌細(xì)胞MMP2、MMP7和MMP9蛋白表達(dá)(見圖5)，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)能降解細(xì)胞外基質(zhì)中多種蛋白質(zhì)，破壞癌細(xì)胞侵襲的組織屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。Li等人[20]發(fā)現(xiàn)在肺癌中可通過GSK-3β/Snail/E-cadherin調(diào)控EMT，進(jìn)而調(diào)節(jié)肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移；在乳腺癌和胃癌中也發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/GSK-3β信號通路調(diào)控EMT[21-22]。本文結(jié)果表明，DT可通過調(diào)控AKT/GSK-3β/β-catenin通路抑制卵巢癌細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移，并希望AKT/GSK-3β/β-catenin通路將成為治療卵巢癌的重要通路之一。