兔VX2惡性骨腫瘤浸潤范圍的DWI與病理對照研究

吳增杰，董誠，邊甜甜，龐婧，李曉麗，郭佳，孫偉凱，郝大鵬，陳海松，徐文堅(jiān)

惡性骨腫瘤的首選治療方式是腫瘤切除術(shù)，而術(shù)前精確判定腫瘤浸潤范圍對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。VX2細(xì)胞株來源于shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤而衍生的鱗癌,接種到兔骨髓腔內(nèi)可建立人體惡性骨腫瘤模型，其生物學(xué)行為與人類骨腫瘤相似,已被廣泛認(rèn)可[1,2]。目前,惡性骨腫瘤浸潤范圍主要通過MR常規(guī)序列信號進(jìn)行判定，但常受腫瘤水腫影響[3]。擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)是一種無創(chuàng)性從分子水平上反映活體組織結(jié)構(gòu)的功能成像技術(shù)。鑒于磁共振螺旋槳技術(shù)(periodically rotated overlapping parallel lines enhanced reconstruction,PROPELLER)-DWI序列具有克服磁敏感偽影的作用，本文從分子水平研究DWI在惡性骨腫瘤浸潤范圍判定中的價(jià)值，旨在為臨床治療提供更精確的依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器

34只新西蘭大白兔,月齡2個(gè)月左右，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限,由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供, 許可證號:SCXK(魯) 20090007。 主要儀器為GE Signa 3.0T超導(dǎo)雙梯度磁共振系統(tǒng)(GE Medical System， Milwakee，USA)和順菱ES-250切片機(jī)(沈陽基石有限公司，中國)。

2.研究方法

VX2兔惡性骨腫瘤模型建立:經(jīng)耳緣靜脈注射地西泮和氯胺酮(用量分別為1 mL/kg和1.6 mL/kg)麻醉，距脛骨平臺2 cm處將右側(cè)小腿內(nèi)側(cè)皮膚縱行切開。采用牙科鉆在骨皮質(zhì)上鉆孔，孔徑約1 mm，24G留置針將腫瘤組織塊(1 mm3/kg)送入脛骨骨髓腔，骨蠟封堵骨皮質(zhì)缺口。逐層縫合切口，0.5%碘伏消毒后用無菌紗布包扎。模型兔建立成功的標(biāo)準(zhǔn):模型兔制備約4周后，MRI示脛骨上段出現(xiàn)溶骨性骨質(zhì)破壞并伴有周圍軟組織腫塊。

2.MRI檢查方法

將麻醉的模型兔橫行放入頭頸聯(lián)合線圈內(nèi)。掃描方位選擇脛骨矢狀位，矢狀位定位線：在冠狀位上與脛骨平臺垂直，在橫軸位上與股骨內(nèi)側(cè)髁內(nèi)側(cè)面平行。MRI掃描序列包括SE-T1WI(TR 500 ms，TE 10 ms,激勵(lì)次數(shù)2)、脂肪抑制(fat saturation，F(xiàn)S)FSE-T2WI(TR 2000 ms,TE 100 ms，激勵(lì)次數(shù)4)、短時(shí)反轉(zhuǎn)恢復(fù)(short TI inversion recovery，STIR)序列(TR 1800 ms，TE 90 ms，激勵(lì)次數(shù)2)和DWI(TR 4000 ms，TE 66～75 ms，激勵(lì)次數(shù)1.5，b值取500 s/mm2)。所有掃描序列視野為18 cm×18 cm，層厚3 mm，層間距1 mm。

病理切片選取與標(biāo)記:離斷并取出腫瘤側(cè)完整的小腿組織。用切片機(jī)按照MR矢狀位定位線方向，切制層厚3 mm的大標(biāo)本(圖1)，選取與MRI對應(yīng)的顯示腫瘤浸潤范圍最大層面的標(biāo)本。參考文獻(xiàn)方法[4]，將腫瘤最大層面的大體標(biāo)本切片分割成多個(gè)區(qū)，切割縱向線平行于脛骨前緣骨皮質(zhì)，橫向線與縱向線垂直，記錄切割后的每個(gè)小標(biāo)本區(qū)的縱向和橫向長度，并用英文字母A、B、C、D等有序標(biāo)記(圖2)以便與MRI進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)對照研究。標(biāo)本HE染色后,均行低倍鏡(×40)和高倍鏡(×100)觀察。

3.觀察項(xiàng)目與評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

不同組織區(qū)域的ADC值測量:測量ADC圖中腫瘤實(shí)性區(qū)、腫瘤壞死區(qū)、肌肉水腫(包括近、遠(yuǎn)端)、正常肌肉、骨髓水腫的ADC值，并與病理點(diǎn)對點(diǎn)對照研究，鏡下觀察ADC值測量感興趣區(qū)的病理表現(xiàn)。每個(gè)病變區(qū)域的ADC值均由3位放射科資深醫(yī)生測量，取其平均值，感興趣區(qū)大小為2 mm2。

腫瘤浸潤范圍大小的測量:選取MRI圖像和病理標(biāo)本中的腫瘤最大層面。參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]的方法分別測量FSE-T2WI、FS-T2WI、STIR、DWI-ADC圖像中腫瘤的最大縱徑(平行于脛骨前緣骨皮質(zhì))及最大橫徑(垂直于最大縱徑)，并將兩徑線數(shù)值相加，兩者之和代表腫瘤浸潤范圍(圖3、4)。ADC圖測量大小標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)算所有模型的腫瘤實(shí)性區(qū)平均ADC值的95%可信區(qū)間的上限值，并將該值定義為腫瘤ADC域值，小于該域值作為腫瘤實(shí)性區(qū)，以通過ADC域值來測量腫瘤大小。由3位資深放射科醫(yī)生測量，取其平均值。在標(biāo)本上確定腫瘤浸潤最大縱徑和橫徑,計(jì)算腫瘤浸潤范圍。

圖1 大體標(biāo)本及標(biāo)本分割線。 圖2 各個(gè)小標(biāo)本的制作與標(biāo)記。 圖3 FSE FS-T2WI測量腫瘤大小的方法：縱徑平行于脛骨前緣骨皮質(zhì)，橫徑垂直于縱徑，A-D點(diǎn)的位置根據(jù)腫瘤信號確定。 圖4 b=500s/mm2與b=0的ADC融合圖像測量腫瘤大小的方法：縱徑平行于b=0圖像的脛骨前緣骨皮質(zhì)，橫徑垂直于縱徑，A-D點(diǎn)的位置由腫瘤邊緣區(qū)的ADC值確定。

DWI序列顯示腫瘤浸潤的敏感度與特異度:以腫瘤浸潤最大橫徑線上的最遠(yuǎn)點(diǎn)為中心,于其內(nèi)、外、上、下各選取一個(gè)2 mm×2 mm感興趣區(qū)進(jìn)行分析比較。以病理切片為金標(biāo)準(zhǔn),比較不同感興趣區(qū)中常規(guī)序列與DWI顯示腫瘤的敏感度及特異度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對腫瘤實(shí)性區(qū)、腫瘤壞死區(qū)、肌肉水腫(近端和遠(yuǎn)端)、正常肌肉、骨髓水腫的ADC值行單因素方差分析及多組兩兩比較。將FSE-T2WI、FS-T2WI、STIR、ADC圖上測量的腫瘤大小與病理所測腫瘤大小行單因素方差分析及多組兩兩比較。通過與病理對照，判定不同MRI序列對腫瘤的顯示能力，并計(jì)算各序列界定腫瘤的敏感度及特異度。相同感興趣區(qū)內(nèi)MRI序列診斷為腫瘤,病理結(jié)果也為腫瘤即為真陽性；MRI診斷為非腫瘤組織,病理結(jié)果為非腫瘤組織即為真陰性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.VX2兔惡性骨腫瘤模型

成功建立30只腫瘤模型，建模需約4周。所有模型兔均出現(xiàn)溶骨性骨質(zhì)破壞、周圍軟組織腫塊、骨膜異常(骨膜反應(yīng)和骨膜水腫)、肌肉水腫(圖5～7)。

2.不同病變區(qū)的ADC值比較

腫瘤實(shí)性區(qū)、腫瘤壞死、肌肉水腫近端、肌肉水腫遠(yuǎn)端、正常肌肉、骨髓水腫的平均ADC值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=1146.78，P值=0.000，表1)。肌肉水腫近端的ADC值低于遠(yuǎn)端肌肉水腫(圖6、7)。采用LSD-t檢驗(yàn)對不同區(qū)域的ADC值進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示除正常肌肉與骨髓水腫的ADC值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.939)外，其他不同病變區(qū)域的ADC值兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤ADC域值為1.18×10-3mm2/s。

表1 不同組織區(qū)域的平均ADC值比較 (×10-3mm2/s)

3.DWI和常規(guī)方法與病理對照

將MRI不同序列圖像與病理標(biāo)本所測腫瘤大小進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值=0.612，P值=0.655)；DWI-ADC圖像所測腫瘤大小更接近于病理標(biāo)本測量值(表2)。

表2 MRI不同序列圖像及病理大標(biāo)本測量的腫瘤大小 (cm)

4.DWI與常規(guī)序列對腫瘤顯示的敏感度與特異度

圖5 兔VX2惡性腫瘤模型的FS-T2WI圖像，脛骨近端骨質(zhì)破壞，呈稍高信號，內(nèi)部信號不均勻，邊界略模糊，伴周圍軟組織腫塊及肌肉水腫。 圖6 兔VX2惡性腫瘤模型的DWI圖像(b=500s/mm2)， 腫瘤呈稍高信號，近遠(yuǎn)端肌肉水腫亦呈高信號。 圖7 兔VX2惡性腫瘤模型的ADC圖像，腫瘤周圍肌肉水腫與腫瘤分界清晰，腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)為低ADC值，近端肌肉的ADC值(2.12×10-3mm2/s)低于遠(yuǎn)端肌肉水腫(2.35×10-3mm2/s)。

DWI序列對腫瘤范圍界定的敏感度及特異度最高，T2WI圖像對腫瘤范圍顯示的敏感度及特異度最低，F(xiàn)S-T2WI及STIR序列居中(表3)。

表3 MR常規(guī)序列及DWI顯示腫瘤范圍的敏感度與特異度 (例)

討 論

原發(fā)惡性骨腫瘤是起源于骨組織的惡性腫瘤性疾病，嚴(yán)重危害人類健康，其發(fā)病率占全部惡性腫瘤的1%,具有年輕化、惡性程度高和致殘率高等特點(diǎn)。當(dāng)前原發(fā)惡性骨腫瘤主要的治療方式是保肢術(shù)，是未來治療發(fā)展的主要方向，術(shù)前精確判定腫瘤浸潤范圍對其治療預(yù)后及保肢術(shù)后肢體重建至關(guān)重要。國外相關(guān)研究認(rèn)為，測量術(shù)后腫瘤標(biāo)本中的腫瘤范圍是判定骨腫瘤浸潤范圍的金標(biāo)準(zhǔn)[3]?，F(xiàn)階段對惡性骨腫瘤術(shù)前浸潤范圍的研究主要通過MRI技術(shù)，包括常規(guī)序列、DWI及動(dòng)態(tài)增強(qiáng)等。DWI是一種無創(chuàng)性從分子水平上反映活體組織結(jié)構(gòu)及功能的一種新的影像技術(shù)，能夠定量分析不同組織的性質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于骨腫瘤的診斷、療效評估等方面[6-9]。

DWI圖像可通過ADC值來定量區(qū)分不同組織成分。國外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DWI能夠通過ADC值鑒別良惡性腫瘤，人體正常肌肉組織與病變組織的ADC值差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9-10]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)b值為500s/mm2時(shí)，腫瘤實(shí)性區(qū)、腫瘤壞死、肌肉水腫(包括近、遠(yuǎn)端)、正常肌肉、骨髓水腫的ADC值差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，除正常肌肉與骨髓水腫的ADC值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其它兩兩比較ADC值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)影像與病理點(diǎn)對點(diǎn)對照研究，腫瘤實(shí)性區(qū)低ADC值是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞密集及核漿比高，使得水分子擴(kuò)散受限。但當(dāng)腫瘤發(fā)生壞死時(shí)，細(xì)胞膜裂解使水分子的擴(kuò)散受限減低，造成壞死組織的ADC值較腫瘤實(shí)性區(qū)組織的ADC值高?？傊珼WI能夠區(qū)分不同組織成分，對臨床療效評估及腫瘤范圍判定有重要價(jià)值。

由于腫瘤與周圍正常組織之間常有過渡區(qū)，它是由少量腫瘤細(xì)胞(微浸潤)或水腫組成[11]，而腫瘤過渡區(qū)的水腫會影響常規(guī)MRI圖像上腫瘤范圍的判定，并導(dǎo)致脂肪抑制T2WI或STIR圖像確定腫瘤范圍過高[12]。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)T2WI、FS-T2WI和STIR圖像測量的腫瘤浸潤范圍要大于病理標(biāo)本測量的腫瘤浸潤范圍，推測與腫瘤過渡區(qū)所致的信號有關(guān)。MRI常規(guī)序列不能區(qū)分腫瘤過渡區(qū)內(nèi)的微浸潤與水腫，本研究結(jié)果顯示，肌肉水腫近端區(qū)DWI圖像上的ADC值要低于遠(yuǎn)端肌肉水腫的ADC值，并經(jīng)病理證實(shí)肌肉水腫近端區(qū)內(nèi)部有腫瘤微浸潤，因此DWI能夠通過ADC值區(qū)分腫瘤過渡區(qū)內(nèi)的微浸潤與水腫，為更精準(zhǔn)測量腫瘤浸潤范圍提供幫助。

DWI界定惡性骨腫瘤浸潤范圍較MRI常規(guī)技術(shù)更加客觀準(zhǔn)確，MRI常規(guī)序列成像基于質(zhì)子弛豫時(shí)間，多種病理狀態(tài)下信號強(qiáng)度發(fā)生重疊是難免的，而DWI主要基于組織中水分子自由擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的快慢，不同病理狀態(tài)下水分子的運(yùn)動(dòng)改變不同。孟悛非等[13]研究常規(guī)序列與SSEPI-DWI確定惡性骨腫瘤浸潤范圍時(shí)，發(fā)現(xiàn)ADC圖可以確定腫瘤髓內(nèi)浸潤范圍，尤其當(dāng)常規(guī)序列T1WI和/或STIR界定腫瘤浸潤范圍存在較大差異或存在困難時(shí)，ADC圖可為精確判定腫瘤浸潤范圍提供參考。本研究結(jié)果顯示，ADC圖上測量的腫瘤浸潤范圍低于常規(guī)序列測量的范圍，并且最接近于病理標(biāo)本的測量值。在各序列對腫瘤范圍顯示的敏感度、特異度方面，DWI-ADC圖像顯示腫瘤范圍的敏感度及特異度遠(yuǎn)高于常規(guī)序列，敏感度、特異度均最高(分別為93.3%和80.0%),而最優(yōu)常規(guī)序列中FS FSE-T2WI的敏感度及特異度(分別為66.7%和53.3%)明顯低于DWI。總之，DWI-ADC圖較MRI常規(guī)序列能能精確、客觀地確定腫瘤浸潤范圍，對臨床治療有指導(dǎo)性幫助。

本研究存在以下局限性：①樣本量較少，可能存在數(shù)據(jù)偏倚；②本研究采用兔VX2腫瘤模型，其生物學(xué)行為及影像學(xué)表現(xiàn)與人不完全一致，以后需通過人體研究進(jìn)一步證實(shí)；③本研究為常規(guī)序列與DWI的對比研究，未與MRI增強(qiáng)掃描及其它功能成像進(jìn)行對比研究。

綜上所述， PROPELLER DWI-ADC圖像顯示的腫瘤浸潤范圍更接近于病理標(biāo)本測量的浸潤范圍，可通過ADC值區(qū)分腫瘤過渡區(qū)微浸潤與水腫，較常規(guī)MRI圖像更能精確地界定腫瘤浸潤范圍并且檢測腫瘤浸潤范圍的敏感度及特異度最高，可作為臨床界定骨腫瘤浸潤范圍的優(yōu)選序列。