基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)雙蓮方對(duì)肝細(xì)胞癌作用的機(jī)制

陳元堃，曾 奧，何樹苗，賀思晴，李春梅，盧 群

（廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510002）

肝細(xì)胞癌是肝臟中最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，是導(dǎo)致肝硬化患者死亡的主要原因之一，其病死率在所有的惡性腫瘤中排名第三[1]。據(jù)報(bào)道，每年約有84萬(wàn)人患肝細(xì)胞癌，其中約78萬(wàn)人死亡。發(fā)展中國(guó)家肝細(xì)胞癌的患病率極高，且呈現(xiàn)患病男性多于女性的趨勢(shì)[2]。當(dāng)前肝細(xì)胞癌主要以手術(shù)切除為主要的治療方案，但這僅僅是早期患者的選擇，肝細(xì)胞癌晚期患者錯(cuò)過(guò)了手術(shù)的最佳時(shí)期，只能采用化療、介入等手段進(jìn)行治療，且預(yù)后也并不樂(lè)觀[3]。近年來(lái)，科研人員對(duì)腫瘤的研究已逐步進(jìn)入分子水平，在分子水平上對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)行了深入的研究，為肝細(xì)胞癌的診斷、治療和預(yù)防提供了新的思路。目前肝細(xì)胞癌的多種治療手段仍有缺陷及局限性，故綜合治療開(kāi)始受到更多臨床醫(yī)生的重視。

在肝細(xì)胞癌的治療中，中藥治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和療效，是中西醫(yī)結(jié)合治療中極其重要的一部分[4，5]。雙蓮方是由半枝蓮、半邊蓮及夏枯草三味中藥組合而成的新方劑，在臨床上廣泛運(yùn)用于肝細(xì)胞癌的治療[6]。據(jù)報(bào)道，組成雙蓮方的三味中藥對(duì)腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[7，8]。在過(guò)去的幾年里，生物信息學(xué)和微陣列技術(shù)被廣泛應(yīng)用于挖掘多種疾病的多種靶點(diǎn)，幫助研究者識(shí)別差異表達(dá)的基因和可能的信號(hào)通路。目前，對(duì)于雙蓮方中具體有效成分治療肝細(xì)胞癌的潛在作用機(jī)制未見(jiàn)系統(tǒng)性報(bào)道，故本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)分析雙蓮方中的主要活性成分，預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，探索雙蓮方治療肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療肝細(xì)胞癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取微陣列數(shù)據(jù)

本研究以“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞，從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索得到GSE121248數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)集共有107個(gè)樣本（包括37個(gè)鄰近組織的正常樣本和70個(gè)肝細(xì)胞癌樣本）。根據(jù)網(wǎng)站中的平臺(tái)注釋文件，將其探針轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的基因符號(hào)（Gene symbol）。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

利用Bioconductor中的limma包對(duì)收集到的芯片進(jìn)行差異基因分析及校正，篩選條件設(shè)定為P＜0.01，差異倍數(shù)（FC）＞2。若一個(gè)基因出現(xiàn)多行，則對(duì)其取均值。利用R語(yǔ)言將其中表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的基因逐個(gè)篩選出來(lái)。

1.3 雙蓮方主要成分的獲取及篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及在線分析平臺(tái)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）收集半枝蓮、半邊蓮、夏枯草的主要活性成分。以生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為篩選條件來(lái)篩選候選的活性成分。

1.4 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及篩選交集基因

利用Perl腳本篩選出候選活性成分的作用靶點(diǎn)，剔除沒(méi)有對(duì)應(yīng)活性成分的靶點(diǎn)。通過(guò)R腳本將前文獲得的疾病差異表達(dá)基因與藥物作用靶點(diǎn)取交集。將獲得的交集部分以及中藥、候選活性成分整合為“network”“node”文件，將其導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2中構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape_v3.7.2的插件BisoGenet構(gòu)建前文獲得的交集靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），用插件CytoNCA分析PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征，依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞睦砟钸x出此網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)。篩選條件為：度中心性（DC）大于全部DC節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的2倍，介度中心性（BC）、接近中心性（CC）均大于節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)值中位數(shù)。

1.6 KEGG和GO富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，于基因列表中輸入交集靶點(diǎn)的集合，基因標(biāo)示符檢選官方基因符號(hào)，背景欄選擇物種為人，最后選功能富集工具進(jìn)行GO、KEGG通路的富集分析，并應(yīng)用Cytoscape_v3.7.2進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝細(xì)胞癌差異基因的挖掘

通過(guò)R語(yǔ)言分析肝細(xì)胞癌組織與鄰近正常組織后共得到580個(gè)差異表達(dá)基因，其中有167個(gè)上調(diào)基因，有413個(gè)下調(diào)基因，用上調(diào)及下調(diào)最顯著的各20個(gè)差異基因繪制聚類熱圖，見(jiàn)圖1。

圖1 肝細(xì)胞癌差異基因的聚類熱圖（紅色表示上調(diào)差異基因，綠色表示下調(diào)差異基因，C表示鄰近正常樣本，T表示癌癥樣本）Figure 1 Clustering heat map of differential gene in HCC (red:up-regulated gene.blue:down-regulated gene.C:adjacent normal sample.T:tumor sample)

2.2 收集及篩選雙蓮方中候選化學(xué)成分

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索收集到94個(gè)半枝蓮的化學(xué)成分、71個(gè)半邊蓮的化學(xué)成分和60個(gè)夏枯草的化學(xué)成分。對(duì)得到的各中藥化學(xué)成分依據(jù)OB ≥30%、DL ≥0.18的條件進(jìn)行篩選，并剔除沒(méi)有靶點(diǎn)的化學(xué)成分，共得到50個(gè)有效的活性成分，其中半邊蓮有17個(gè)，半枝蓮有29個(gè)，夏枯草有11個(gè)。其中槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）同時(shí)存在于半邊蓮、半枝蓮、夏枯草中，山柰酚（kaempferol）存在于半邊蓮與夏枯草中，而β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）存在于半枝蓮與夏枯草中，具體成分見(jiàn)圖2。

圖2 雙蓮方藥物-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Drug-active ingredient network of Shuanglianfang

2.3 收集靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集得到半枝蓮、半邊蓮、夏枯草中50個(gè)化學(xué)成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共1 385個(gè)，其中半邊蓮有417個(gè)，半枝蓮有591個(gè)，夏枯草有377個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)，存在多個(gè)藥物共同擁有多個(gè)靶點(diǎn)、一個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)和多個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)一個(gè)靶點(diǎn)的情況。將雙蓮方活性成分作用靶點(diǎn)與肝細(xì)胞癌差異基因匹配之后，共得到28個(gè)雙蓮方治療肝細(xì)胞癌的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 雙蓮方治療肝細(xì)胞癌的潛在靶點(diǎn)Table 1 Potential targets of Shuanglianfang in the treatment of HCC

2.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

利用Cytoscape構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)中有63個(gè)節(jié)點(diǎn)及83條邊，節(jié)點(diǎn)為活性成分及靶點(diǎn)基因，邊為它們之間的相互關(guān)系。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，三種藥物中的活性成分對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)有作用，存在一個(gè)活性成分對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)起作用和多個(gè)活性成分對(duì)一個(gè)靶點(diǎn)有作用的情況，體現(xiàn)了雙蓮方多成分、多靶點(diǎn)相互協(xié)同治療肝細(xì)胞癌的特點(diǎn)。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過(guò)Cytoscape_v3.7.2 的插件BisoGenet 構(gòu)建交集靶點(diǎn)調(diào)控的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（數(shù)據(jù)源于DIP、BIND、HPRD、MINT、INTACT、BIOGRID 數(shù)據(jù)庫(kù)），見(jiàn)圖4。網(wǎng)絡(luò)中共有1 439 個(gè)蛋白和27 515 條相互關(guān)系通道。以這1 439 個(gè)蛋白做進(jìn)一步的CytoNCA 分析，篩選的參數(shù)包括DC、BC、CC、NC、LAC。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選出14個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和91個(gè)關(guān)系，篩選過(guò)程見(jiàn)圖4（A）。將其導(dǎo)入STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4（B）。圖4（C）中，檢索基因調(diào)控的蛋白質(zhì)為紅色，有相互作用的蛋白質(zhì)為藍(lán)色。結(jié)果提示雙蓮方可能通過(guò)影響這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)起到治療肝細(xì)胞癌的作用。

圖3 雙蓮方藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Drug-active ingredient-target network

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Protein interaction network

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（續(xù)）Figure 4 Protein interaction network（continued）

2.6 GO富集分析

通過(guò)DAVID 對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，得到314個(gè)富集結(jié)果，其中生物過(guò)程（BP）有286個(gè)，主要涉及激素代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)過(guò)程、類固醇分解代謝過(guò)程等方面；細(xì)胞成分（CC）有5個(gè)，主要涉及蛋白激酶復(fù)合物、絲/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等；分子功能（MF）有23個(gè)，主要涉及細(xì)胞因子活性、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合等。CC的前五項(xiàng)富集結(jié)果及BP、MF的前10項(xiàng)富集結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 GO富集結(jié)果Figure 5 GO enrichment results

2.7 KEGG富集分析

通過(guò)DAVID對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，得到13條富集結(jié)果，其中與肝細(xì)胞癌有關(guān)的通路主要有腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、P53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）、Toll 樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、細(xì)胞周期信號(hào)通路（cell cycle）等（表2），說(shuō)明雙蓮方可能通過(guò)以上通路治療肝細(xì)胞癌。將獲得的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2繪制作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。

表2 KEGG富集結(jié)果Table 2 KEGG enrichment results

圖6 靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 Target-signal pathway network

3 討論

導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的病因有很多，如生活習(xí)慣、遺傳及理化因素等[9]，這些因素可能會(huì)對(duì)肝細(xì)胞中某些特定靶點(diǎn)起作用，進(jìn)而影響相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使基因表達(dá)異常[10，11]。因?yàn)橛卸喾N信號(hào)分子參與，涉及到多條復(fù)雜的信號(hào)通路，科研人員難以對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞中信號(hào)的輸出情況作出準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)及判斷，針對(duì)于單個(gè)分子靶點(diǎn)的研究策略有很大的局限性[12]。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)的方法篩選雙蓮方治療肝細(xì)胞癌的活性成分，得到其中的作用靶點(diǎn)后繪制藥物-活性成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，分析GO、KEGG 富集結(jié)果，確定了雙蓮方在分子層面的靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)出藥物治療肝細(xì)胞癌的有效成分及作用機(jī)制。

本研究根據(jù)顯著性差異表達(dá)情況應(yīng)用生物信息學(xué)的方法篩選出580個(gè)差異表達(dá)的基因，這些基因的表達(dá)改變與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有重要關(guān)系。從TCMSP中獲取數(shù)據(jù)并篩選后得到雙蓮方的50個(gè)化學(xué)成分及1 385個(gè)作用靶點(diǎn)，其中雙蓮方中涉及靶點(diǎn)較多的化合物主要為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）等黃酮類化合物，說(shuō)明這些化合物是雙蓮方中的主要活性物質(zhì)。黃酮類化合物可通過(guò)調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡、炎癥、血管生成、轉(zhuǎn)移等途徑中的各種酶和受體來(lái)減弱及抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]。槲皮素是一種明星抗癌化合物，可通過(guò)抑制Caspase/Cyto-c、AP-2β/hTERT、NF-κB/COX-2途徑及阻斷Akt/ERK1/2信號(hào)通路起到治療肝細(xì)胞癌的作用，近年來(lái)相關(guān)研究較多[14-16]。木犀草素可作用于P53蛋白，使Bax表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)降低，促使Casepase3激活及PARP裂解，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[17，18]。山奈酚對(duì)腫瘤的耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用，可通過(guò)影響Wnt/β-catenin通路使肝細(xì)胞癌細(xì)胞分化受阻[19]。

本研究通過(guò)活性成分-靶點(diǎn)及靶點(diǎn)-信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，在篩選出的28個(gè)潛在靶點(diǎn)中，PTGS2、CDK1、Cfos等能夠影響細(xì)胞周期、機(jī)體代謝、機(jī)體免疫、信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤的新生血管生成等，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，可作為雙蓮方治療肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)。PTGS2為前列腺素合成反應(yīng)的限速酶，又稱為環(huán)氧合酶-2（COX-2），在心血管疾病、癌癥等多種疾病中發(fā)揮重要作用[20，21]。COX-2參與肝細(xì)胞癌早期發(fā)生，COX-2低表達(dá)時(shí)與低分化的肝細(xì)胞癌組織相關(guān)，其過(guò)表達(dá)時(shí)與高分化的肝細(xì)胞癌組織相關(guān)，COX-2可促使VEGF表達(dá)增高、血管生成及PGE2的生成，激活抗凋亡通路Akt/PKB及誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)從而抑制凋亡，COX-2表達(dá)下調(diào)可能是治療肝細(xì)胞癌的手段之一，阿司匹林、塞來(lái)昔布等多種COX-2抑制劑表現(xiàn)出優(yōu)異的肝細(xì)胞癌治療效果[22-24]。CDK 是一種對(duì)細(xì)胞周期及增殖有重要作用的激酶，多種腫瘤中均有過(guò)表達(dá)的CDK1/cyclinB，近幾年成為抗腫瘤的重要靶點(diǎn)，抑制其表達(dá)對(duì)防治腫瘤有重要意義[25]。C-fos形成AP-1后可激活下游的通路，促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等，其表達(dá)增高與肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展有重要關(guān)系[26]。

本研究通過(guò)建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)浞治龅玫?4個(gè)關(guān)鍵的蛋白節(jié)點(diǎn)和91條相互關(guān)系，提示雙蓮方是通過(guò)作用于這些關(guān)鍵蛋白從而影響相關(guān)通路以發(fā)揮作用。在進(jìn)行GO和KEGG 的富集后發(fā)現(xiàn)半枝蓮、半邊蓮、夏枯草中的活性分子與肝細(xì)胞癌細(xì)胞的多種代謝過(guò)程、刺激反應(yīng)及生物調(diào)節(jié)有關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)P53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移及分化等過(guò)程。P53是機(jī)體內(nèi)一種重要的抑癌基因，正常狀態(tài)下不僅能維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)還可抑制細(xì)胞的惡性增殖，當(dāng)P53突變或失活時(shí)可啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生。Li等研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的SNHG1可通過(guò)與DNMT1結(jié)合靶向抑制P53的表達(dá)從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖及侵襲，表明P53信號(hào)通路的激活可能對(duì)治療肝細(xì)胞癌有重要意義[27]。Zanoaga等發(fā)現(xiàn)駱駝蓬堿可通過(guò)影響P53/P21信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞活力，增加其死亡[28]。TNF-α是參與多種腫瘤發(fā)生的重要因子，其生成與惡性腫瘤的低生存率有關(guān)，Chang等發(fā)現(xiàn)黃芪酸可通過(guò)抑制TNF信號(hào)通路使NF-κB活性減弱，從而抑制腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增長(zhǎng)及促其凋亡[29]。Toll樣受體在多種腫瘤中表現(xiàn)為高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)其表達(dá)可有效抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與侵襲[30]。不同的信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌發(fā)生的各個(gè)階段發(fā)揮不同的作用，各個(gè)通路之間又相互交聯(lián)，形成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。雙蓮方的多種活性組分可能通過(guò)對(duì)失衡的通路進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，從而發(fā)揮防治肝細(xì)胞癌的作用。