基于食管癌分子分型液體活檢技術(shù)的研發(fā)和推廣應(yīng)用

王盼盼，趙學(xué)科，李秀敏，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，孟超龍，胡守佳，程 錕，李留玉，張立國，李志強(qiáng)，劉太江，張高富，陳志國，李喜琴，王立東

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室、省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450052；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省腫瘤分子治療醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸外科，河南 新鄉(xiāng) 453000；5.輝縣市第三人民醫(yī)院(孟莊鎮(zhèn)衛(wèi)生院)腫瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453621；6.新鄉(xiāng)同盟醫(yī)院腫瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453800；7.輝縣市共濟(jì)醫(yī)院腫瘤科，河南 新鄉(xiāng) 453600)

食管癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于胃癌，90%以上為食管鱗癌[1]。臨床上首次確診的食管癌患者約90%以上為中晚期，食管鱗癌總體5 a生存率僅15%左右[2]，其主要原因是早期食管癌患者無特異性癥狀，缺乏無創(chuàng)性早期診斷的篩查策略。迄今為止，早期食管癌及癌前病變篩查仍為色素內(nèi)鏡檢查加病理活檢，其過程痛苦、技術(shù)要求高、患者依從性差，難以大范圍推廣。食管癌變是一個(gè)多階段演進(jìn)過程，食管癌前病變形態(tài)發(fā)展之前已發(fā)生多種基因和蛋白的改變，包括來自腫瘤細(xì)胞的一組特異蛋白，后者可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，這一組蛋白稱為腫瘤相關(guān)抗原[3-4]。因此，檢測外周血腫瘤相關(guān)抗原自身抗體可能有助于高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)。過去一些相關(guān)研究大多集中在單個(gè)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測或組織中腫瘤相關(guān)抗原檢測，導(dǎo)致早期癌檢出率過低。因此，本研究旨在聯(lián)合檢測多種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體，闡明這些標(biāo)志物對食管癌高危人群預(yù)警篩查和早期發(fā)現(xiàn)的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料入組研究對象為3組，收集時(shí)間為2010年1月至2019年12月。第1組：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的100例早期食管鱗癌患者(食管癌組)及100例正常人(正常對照組)。食管癌組均為經(jīng)病理確診且未接受任何放化療的初診患者，男54例，女46例，年齡35～69(58.98±7.24)歲；正常對照組來自門診健康體檢人群，并經(jīng)內(nèi)鏡病理活檢排除食管癌前病變或早期食管癌，無任何腫瘤相關(guān)證據(jù)，男51例，女49例，年齡35～70(57.88±7.71)歲。2組研究對象的性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。第2組(驗(yàn)證組)：接受流行病學(xué)調(diào)查和家訪的400例無癥狀人群來自食管癌高發(fā)區(qū)河南新鄉(xiāng)大塊鎮(zhèn)，男201例，女199例，年齡35～70(53.30±9.71)歲(表1)。第3組(推廣應(yīng)用組)：獨(dú)立于驗(yàn)證組的食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群，入組標(biāo)準(zhǔn)同驗(yàn)證組，主要來自河南新鄉(xiāng)食管癌高發(fā)區(qū)的3個(gè)自然村，共10 752例，男5 433例，女5 319例，年齡35～70(53.23±9.90)歲(表2)。所有研究對象均排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病等影響血清蛋白質(zhì)表達(dá)的疾病。所有入組研究對象均簽署知情同意書。該研究已被鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 驗(yàn)證組400例無癥狀人群性別、年齡分布情況

表2 推廣應(yīng)用組10 752例無癥狀人群性別、年齡分布情況

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 3組人群均取空腹靜脈血5 mL至離心管中，室溫靜置30 min，2 000 r/min離心20 min，取血清并每管100 μL分裝，干冰保存，后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測 所有樣品血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)均是在不獲取樣品對應(yīng)臨床信息的前提下進(jìn)行的。用美國Scripps研究所自行提取和純化的細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)、胰島素樣生長因子2 mRNA-結(jié)合蛋白1(IMP1)和P65等共5種抗原對以上血清標(biāo)本進(jìn)行腫瘤相關(guān)抗原自身抗體水平檢測。采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法[5-6]，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG稀釋濃度為15 000。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原100 μL/孔，4 ℃過夜(>24 h)。加入稀釋后的患者血清100 μL/孔，每個(gè)樣品至少做2次檢查，37 ℃孵育。已知陽性的血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，置于37 ℃避光反應(yīng)，當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，并在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)讀數(shù)儀上讀取450 nm波長處光密度值。

1.2.3 血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測結(jié)果判定 采用美國Scripps研究所判定方法確定截?cái)嘀?，讀數(shù)在此值以上的為陽性，否則為陰性[7-8]。

1.2.4 色素內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢 對驗(yàn)證組所有對象、推廣應(yīng)用組中液體活檢檢測5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體有至少1種陽性者進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢，并常規(guī)在食管中1/3段(距門齒28～30 cm)、下1/3段(食管賁門交界線上2～3 cm)各取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機(jī)取材，必要時(shí)進(jìn)行食管黏膜碘染色。在食管不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇內(nèi)固定。常規(guī)脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片6張，每張切片厚5 μm，其中1張進(jìn)行HE染色，核實(shí)組織病理學(xué)診斷，其余5張行免疫組化檢查。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及免疫組化檢查結(jié)果，將食管黏膜上皮分為正常、不典型增生和鱗癌。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組和正常對照組血清5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達(dá)比較食管癌組血清CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65等5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽性率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.779，P=0.005；χ2=14.222，P<0.001；χ2=13.211，P<0.001；χ2=13.455，P<0.001；χ2=26.510，P<0.001)。5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測至少1種陽性用于食管癌診斷的敏感性為77.00%，特異性為87.00%。見表3。

表3 食管癌組和正常對照組血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽性率比較及對食管癌的診斷效能 n(%)

2.2 驗(yàn)證組400例無癥狀人群液體活檢和色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果比較隨食管癌前病變程度的加重，CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65聯(lián)合液體活檢技術(shù)至少1種陽性檢出食管病變率呈增加趨勢，而且出現(xiàn)多種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽性現(xiàn)象。在驗(yàn)證組食管癌高發(fā)區(qū)400例無癥狀人群中，5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術(shù)檢出食管癌8例(72.73%)、癌前病變22例(75.86%)，該方法用于食管癌診斷的敏感性為72.73%，特異性為86.94%。見表4。

表4 驗(yàn)證組400例無癥狀人群液體活檢和色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果比較 n(%)

2.3 推廣應(yīng)用組10 752例無癥狀人群液體活檢技術(shù)聯(lián)合色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果利用液體活檢技術(shù)對推廣應(yīng)用組食管癌高發(fā)區(qū)10 752例無癥狀人群進(jìn)行大規(guī)模篩查，篩查出2 043例(19.00%)有至少1種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽性者，定義為高危人群。高危人群進(jìn)一步進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，發(fā)現(xiàn)正常人群1 075例(52.62%)、不典型增生710例(34.75%)、食管癌258例(12.63%)。即在食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群中進(jìn)行液體活檢技術(shù)聯(lián)合色素內(nèi)鏡檢查，食管癌檢出率為2.40%(258/10 752)。

3 討論

食管癌早期起病隱匿，缺乏特異性癥狀，其主要篩查手段仍是色素內(nèi)鏡檢查和黏膜活檢(具有技術(shù)要求高、有創(chuàng)、依從性差、效率偏低等劣勢)，加上傳統(tǒng)的高危人群界定標(biāo)準(zhǔn)精準(zhǔn)度低(高發(fā)區(qū)、40歲以上、男性、吸煙、飲酒、家族史陽性)；當(dāng)對高危人群進(jìn)行內(nèi)鏡篩查時(shí)，早期癌發(fā)現(xiàn)率僅2%左右。這些原因使高發(fā)區(qū)無癥狀人群大規(guī)模篩查食管癌受到極大限制。

食管癌多階段演進(jìn)過程中產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體可在患者出現(xiàn)主要臨床癥狀之前的數(shù)月甚至數(shù)年即被檢測到[9]。聯(lián)合檢測多種抗腫瘤相關(guān)抗原抗體對惡性腫瘤高危人群篩查和早期診斷具有一定的可行性[10-11]。本研究主要基于食管癌分子分型液體活檢技術(shù)，優(yōu)化組合出5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體(CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65)聯(lián)合檢測方法，通過食管癌患者與正常對照人群研究指標(biāo)診斷的可靠性，并在食管癌高發(fā)區(qū)小規(guī)模人群中進(jìn)行驗(yàn)證，之后將其在食管癌高發(fā)區(qū)獨(dú)立的大規(guī)模無癥狀人群進(jìn)行推廣應(yīng)用。

本研究結(jié)果顯示：第1組的早期食管癌患者的5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測陽性率為77.00%，驗(yàn)證組中食管癌和癌前病變的陽性率分別為72.73%和75.86%，在推廣應(yīng)用組中有相似的結(jié)果。這提示利用血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術(shù)對食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群進(jìn)行檢測，是一種非常有前景的食管癌高危人群篩查和早期診斷方法。這3組人群腫瘤相關(guān)自身抗體聯(lián)合檢測時(shí)均存在一定的假陰性率，可導(dǎo)致食管癌前病變和早期癌漏診，提示未來我們的研究應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注多種腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)化組合，提高聯(lián)合診斷敏感性。在第3組食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群大規(guī)模推廣應(yīng)用中，通過對腫瘤相關(guān)自身抗體陽性者進(jìn)一步行色素內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)，與單純色素內(nèi)鏡檢查的食管癌檢出率相近。提示該方案在無癥狀人群大規(guī)模推廣應(yīng)用中具有顯著的篩查診斷潛力。

總之，這是一項(xiàng)多中心、多階段的大規(guī)模人群研究，主要基于食管癌分子分型液體活檢技術(shù)，優(yōu)化組合出5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體(CyclinE、STAT3、E2F1、IMP1和P65)聯(lián)合檢測方法，精準(zhǔn)確定出食管癌高危人群，具有與色素內(nèi)鏡篩查相似效果，但極大減少了內(nèi)鏡篩查人數(shù)，節(jié)約了篩查成本，可作為食管癌高危人群預(yù)警和早期診斷的關(guān)鍵手段，在食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群大規(guī)模篩查中應(yīng)用具有明顯的社會效益和臨床意義。