中國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)無(wú)癥狀人群液體活檢技術(shù)篩查早期食管癌和高危人群的多中心應(yīng)用研究

孟超龍，趙學(xué)科，崔曉賓，程 錕，胡守佳，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢(mèng)霞，韓文莉，雷玲玲，姚品芳，熊 飛，伊力亞爾·夏合丁，李 鋒，曹維克，王立東

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室、省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450052；2. 新疆石河子大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，新疆 石河子 832003；3. 湖北省腫瘤醫(yī)院研究所，湖北 武漢 430079；4. 湖北省腫瘤醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430079；5. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830054；6. 淮安市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 淮安 223300)

湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京是食管癌發(fā)病率和死亡率較高的3個(gè)地區(qū)。目前，食管癌依然是3個(gè)地區(qū)腫瘤相關(guān)主要死亡原因。早期食管癌患者癥狀并不典型,隨著病情的發(fā)展可逐漸出現(xiàn)吞咽困難、食管內(nèi)異物感及胸骨后燒灼樣疼痛等癥狀[1]，首次就診的患者90%左右已經(jīng)處于中晚期[2-3]。本課題組以往研究[4]表明：使用液體活檢技術(shù)從無(wú)癥狀人群中確定高危人群，再進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查是目前實(shí)現(xiàn)食管癌早期發(fā)現(xiàn)的最佳技術(shù)。多種腫瘤相關(guān)抗原可以在食管癌組織中表達(dá)，并且可以在食管癌患者血液中檢測(cè)到相應(yīng)的自身抗體，不同的抗體表達(dá)的量有所不同[5]。本研究團(tuán)隊(duì)使用液體活檢技術(shù)檢測(cè)食管癌高發(fā)區(qū)無(wú)癥狀人群血清中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體，然后根據(jù)液體活檢技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步做色素內(nèi)鏡檢查，探索自身抗體聯(lián)合檢測(cè)在食管癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群篩查中的意義，并建立相應(yīng)的能用于大規(guī)模食管癌高危人群篩查的液體活檢技術(shù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象第1組人群來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室血清樣本，其中正常人血清245例作為對(duì)照組，早期食管癌患者血清245例作為早期食管癌組。245例正常人血清來(lái)自該實(shí)驗(yàn)室合作醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，無(wú)任何腫瘤相關(guān)的證據(jù)。245例正常人中，男121例、女124例，年齡35～70(52.07±10.21)歲。245例早期食管癌患者血清來(lái)源于經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的早期(0期+Ⅰ期)食管癌患者，均未接受放療或化療治療。245例食管癌患者中，男135例、女110例，年齡35～70(59.45±6.99)歲。

第2組人群來(lái)自于豫北食管癌高發(fā)區(qū)某鎮(zhèn)流行病學(xué)調(diào)查，共納入自愿接受流行病學(xué)調(diào)查、液體活檢和色素內(nèi)鏡檢查的無(wú)癥狀人群1 755例，男869例、女886例，年齡35～70(51.91±10.33)歲。

第3組人群來(lái)自于湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京食管癌大規(guī)模篩查，共納入自愿配合食管癌篩查的無(wú)癥狀人群6 325例，其中男3 132例、女3 193例，年齡35～70(51.96±10.30)歲。對(duì)其進(jìn)行液體活檢，5種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體有至少1種陽(yáng)性者再進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查。

1.2 方法

1.2.1 檢查試劑和方法 對(duì)3組研究對(duì)象分別抽血，每例均取空腹靜脈血5 mL至離心管中，室溫靜置30 min，然后離心(2 000 r/min)20 min，吸取上層血清進(jìn)行分裝，每管100 μL，用液氮進(jìn)行保存，最后儲(chǔ)存到-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

提取和純化的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)來(lái)自美國(guó)Scripps研究所。

采用本研究團(tuán)隊(duì)以往建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法對(duì)所取標(biāo)本進(jìn)行上述5種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測(cè)[6-7]，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，稀釋濃度為15 000的抗人IgG用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)板孔中加入用包被稀釋液稀釋過(guò)的抗原100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜(24 h以上)。加入稀釋后的患者血清100 μL/孔,每個(gè)樣品至少要做2次檢查，在37 ℃條件下孵育。已知陽(yáng)性血清為陽(yáng)性對(duì)照，包被緩沖液為陰性對(duì)照。加入稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 100 mL/孔, 在37 ℃條件下孵育。加入四甲基聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，置于37 ℃條件下避光反應(yīng)，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)比較明顯的顏色變化后, 每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，最后在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)讀數(shù)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)處光密度值。

1.2.2 血清學(xué)結(jié)果判定 采用美國(guó)Scripps研究所制定的判定方法確定截?cái)嘀?，讀數(shù)在此截?cái)嘀狄陨系臑殛?yáng)性，否則為陰性[3,8]。

1.2.3 色素內(nèi)鏡檢查 對(duì)液體活檢技術(shù)檢測(cè)5種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體有至少1種陽(yáng)性者和大致相應(yīng)數(shù)量陰性者進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，用常規(guī)方法在食管中取活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機(jī)取活檢組織，必要時(shí)進(jìn)行染色，在食管不染區(qū)和賁門染區(qū)取材，所有的活檢組織全部快速置于體積分?jǐn)?shù)85%乙醇內(nèi)固定[9-11]。

1.2.4 病理組織學(xué)檢查 對(duì)色素內(nèi)鏡下夾取的食管活檢組織，采用體積分?jǐn)?shù)85%乙醇固定，常規(guī)脫水后用石蠟包埋，每張切片的厚度為5 μm，進(jìn)行HE染色，然后進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 早期食管癌組和對(duì)照組研究對(duì)象血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達(dá)比較早期食管癌組BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP等5種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.053，P<0.001；χ2=5.833，P<0.001；χ2=4.200，P<0.001；χ2=4.374，P<0.001；χ2=4.992，P<0.001)。隨著自身抗體組合數(shù)目的增加，早期食管癌診斷的敏感性也隨之增加，5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的敏感性高達(dá)86.94%；雖然隨著抗體數(shù)目的增加，特異性逐漸降低，但5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的特異性仍然能夠達(dá)到82.45%。結(jié)果提示，5種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)既能保持較高的特異性，又能提高診斷的敏感性。見表1、2。

表1 早期食管癌組和對(duì)照組研究對(duì)象血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達(dá)比較 n(%)

表2 不同腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)對(duì)食管癌的診斷效能 n(%)

2.2 小規(guī)模人群驗(yàn)證在豫北食管癌高發(fā)區(qū)某鎮(zhèn)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，納入自愿配合食管癌篩查的無(wú)癥狀人群1 755例，利用食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)對(duì)其進(jìn)行液體活檢，并與色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果進(jìn)行比較。1 755例無(wú)癥狀人群年齡、性別分布見表3，液體活檢與色素內(nèi)鏡檢查比較結(jié)果見表4。

表3 1 755例無(wú)癥狀人群年齡、性別分布 n(%)

表4 液體活檢與色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果比較 n(%)

2.3 大規(guī)模人群驗(yàn)證結(jié)果在湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，納入自愿配合食管癌篩查的無(wú)癥狀人群6 325例，年齡、性別分布見表5。利用食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)對(duì)其進(jìn)行液體活檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性(高危)人群1 018例，陰性(正常)人群5 307例。1 018例液體活檢陽(yáng)性人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常567例(8.96%)、癌前病變286例(4.52%)、食管癌[149例(2.36%)，其中早期食管癌130例(2.06%)、晚期食管癌19例(0.30%)]、其他上消化道腫瘤16例(0.25%)。

表5 6 325例無(wú)癥狀人群年齡、性別分布 n(%)

3 討論

食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、復(fù)雜的演進(jìn)過(guò)程[12]，但其明確的發(fā)病因素及分子機(jī)制仍然不是十分清楚[6]。同時(shí)，高發(fā)區(qū)食管癌的發(fā)病率和死亡率仍然比較高，患者就診時(shí)間相對(duì)過(guò)晚使治療效果并不理想，因此，食管癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療非常關(guān)鍵。本研究分別對(duì)BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP等5種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行最優(yōu)組合，結(jié)果提示，BCRP、hTERT、BAX、VEGF和MRP的組合可用于早期食管癌診斷和高危人群篩查。

本研究團(tuán)隊(duì)在湖北鐘祥、新疆烏魯木齊、江蘇南京開展了多中心應(yīng)用性研究，用血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測(cè)食管癌高發(fā)區(qū)無(wú)癥狀人群，篩查出至少1種自身抗體陽(yáng)性人群，然后做色素內(nèi)鏡檢查，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)建立的食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用后可區(qū)分早期食管癌和癌前病變。因此，在食管癌高發(fā)區(qū)應(yīng)用自身抗體聯(lián)合檢測(cè)液體活檢技術(shù)對(duì)篩查早期食管癌和高危人群有一定實(shí)用價(jià)值。

與傳統(tǒng)色素內(nèi)鏡篩查技術(shù)相比，本實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)建立的食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了上消化道惡性腫瘤的精準(zhǔn)篩查,更明確了癌前病變惡性轉(zhuǎn)歸人群監(jiān)測(cè)范圍。明顯減輕財(cái)政負(fù)擔(dān)和患者的精神壓力，且該液體活檢技術(shù)具有成本低、無(wú)創(chuàng)和精準(zhǔn)等特點(diǎn)，值得推廣應(yīng)用。