不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析結(jié)果的影響*

秦建兵，李 雯，衣 昕，田美玲，何 輝，金國(guó)華*

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，南通 226001)

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次形成子細(xì)胞為止，在此過程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均勻地分配到兩個(gè)子細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA 含量來進(jìn)行細(xì)胞周期的分析在細(xì)胞生物學(xué)以及腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域已愈來愈普遍。雖然此方法比較簡(jiǎn)單，但是因?yàn)椴僮髡叩氖炀毘潭纫约安煌膶?shí)驗(yàn)方法，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性及數(shù)據(jù)的可信度下降。本文針對(duì)這一問題展開研究，探討不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 大鼠C6 腦膠質(zhì)細(xì)胞株(吉?jiǎng)P基因)、DMEM/F12 培養(yǎng)基(Corning)、胎牛血清、胰酶(Gibco)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)/核糖核酸酶(ribonuclense,RNase)染色液(BD)、20×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(上海生工生物)、流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)。

1.2 影響因素及實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 乙醇濃度對(duì)細(xì)胞周期的影響 大鼠C6 細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積80%左右，胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，0.01 mol/L PBS洗2 遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1×106/管將細(xì)胞分配到若干離心管中。按照乙醇濃度分為低(50%)、中(75%)、高(100%)組。置于-20 ℃固定24 h 后檢測(cè)。

1.2.2 固定方式對(duì)細(xì)胞周期的影響 按照固定方式分為細(xì)胞沉淀滴入預(yù)冷75%乙醇組、預(yù)冷75%乙醇滴入細(xì)胞沉淀組、1 mL PBS 重懸細(xì)胞后滴入3 mL預(yù)冷無水乙醇組、3 mL 預(yù)冷無水乙醇滴入1 mL PBS 重懸細(xì)胞組。置于-20 ℃固定24 h 后檢測(cè)。

1.2.3 染色時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期的影響 用1 mL PBS重懸細(xì)胞后滴入3 mL 預(yù)冷無水乙醇，-20 ℃固定24 h，按染色時(shí)間分為5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d 組。

1.2.4 固定時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期的影響 用1 mL PBS重懸細(xì)胞后滴入3 mL 預(yù)冷無水乙醇，按照乙醇固定時(shí)間分為2 h、1 d、7 d、28 d 組，分別放置-20 ℃保存后檢測(cè)。

1.2.5 樣品流速對(duì)細(xì)胞周期的影響 用1 mL PBS重懸細(xì)胞后滴入3 mL 預(yù)冷無水乙醇，-20 ℃固定24 h，分為高流速組(60 μL/min)、中流速組(35 μL/min)、低流速組(12 μL/min)。

1.2.6 細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞周期的影響 用1 mL PBS重懸細(xì)胞后滴入3 mL 預(yù)冷無水乙醇，-20 ℃固定24 h，分為高濃度組(1×107/mL)、中濃度組(2×106/mL)、低濃度組(0.4×106/mL)。

1.3 染色及上機(jī)檢測(cè) 各組細(xì)胞1 000 r/min 離心5 min，小心吸除固定液，加入4 mL 0.01 mol/L PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，重復(fù)1 次，小心吸除PBS，室溫下避光加入0.5 mL PI/RNase 染液重懸細(xì)胞后待上機(jī)檢測(cè)。BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀，以FSC-H 為橫坐標(biāo)，SSC-H 為縱坐標(biāo)，設(shè)置門R1，以FL2-A 為橫坐標(biāo)，F(xiàn)L2-W 為縱坐標(biāo)，設(shè)置門R2，共收集R2 門內(nèi)20 000 個(gè)細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞周期分析 利用儀器自帶Modfit 軟件(版本號(hào)3.3.11)分析DNA 面積直方圖，得出各個(gè)細(xì)胞周期的百分比和變異系數(shù)(coefficient of variance,CV)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乙醇濃度對(duì)細(xì)胞周期的影響 由圖1 可見，細(xì)胞的G2/M 期細(xì)胞與雙黏體細(xì)胞分離界限清楚，說明儀器的分辨率良好。流式散點(diǎn)圖可見無水乙醇組、50%乙醇組細(xì)胞碎片明顯增多，無水乙醇組細(xì)胞FSC 和SSC 信號(hào)減小，說明細(xì)胞脫水固縮，細(xì)胞黏連明顯，直方圖可見兩組較75%乙醇組峰寬明顯增加，CV 值增大(P＜0.05)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用75%乙醇固定細(xì)胞。

2.2 固定方式對(duì)細(xì)胞周期的影響 1 mL PBS 重懸細(xì)胞后滴入3 mL 預(yù)冷無水乙醇組、3 mL 預(yù)冷無水乙醇滴入1 mL PBS 重懸細(xì)胞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；細(xì)胞沉淀滴入預(yù)冷75%乙醇組、預(yù)冷75%乙醇滴入細(xì)胞沉淀組細(xì)胞黏連體增多，周期分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖2。

2.3 染色時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期的影響 5～30 min 間各組S 期和G2/M 期數(shù)值變化較大，隨著染色時(shí)間的延長(zhǎng)直方圖中的峰變窄，CV 值也明顯減小(P＜0.05)，1～12 h 各組間數(shù)值基本平穩(wěn)(P＞0.05)，1 d 以上組細(xì)胞周期數(shù)值與1～12 h 各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 固定時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞經(jīng)75%乙醇固定后放置-20 ℃保存2 h、1 d、7 d、28 d 組之間除2 h 組CV 值稍高外，周期分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4。

2.5 樣品上樣速度對(duì)細(xì)胞周期的影響 低流速組與高流速組及中流速組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，S 期和G2/M 期數(shù)值變化較大。且隨著流速的增大，直方圖中的峰變寬，CV 值也明顯增加(P＜0.05)，見圖5。

2.6 細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞周期的影響 周期分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示，高濃度組與低濃度組及中濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖6。

3 討 論

在細(xì)胞周期的不同時(shí)期，DNA 含量存在差異，正常細(xì)胞G0/G1期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量(2N)，G2/M 期具有四倍體細(xì)胞的DNA 含量(4N)，而S期DNA 含量介于二倍體和四倍體之間[1]。PI 是一種常用的細(xì)胞核熒光染料，能嵌入堿基對(duì)之間實(shí)現(xiàn)與雙鏈DNA 結(jié)合，DNA 含量多，嵌入的染料多，熒光強(qiáng)度就高；嵌入的DNA 含量少，熒光強(qiáng)度就低。但PI 無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，乙醇可通過沉淀、失活起到固定作用，同時(shí)可溶解脂質(zhì)起到破膜作用[2]。因此，經(jīng)乙醇固定，再行PI 染色，用流式細(xì)胞術(shù)分析已成為當(dāng)前一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)細(xì)胞周期的方法[3-7]。雖然此方法步驟簡(jiǎn)單，但由于各種實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致數(shù)據(jù)平行性不好，同時(shí)樣品處理不當(dāng)導(dǎo)致周期分析的CV 值增大，從而使數(shù)據(jù)的可信度下降[8-11]。本文從細(xì)胞周期檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)的各種影響因素和實(shí)驗(yàn)條件的變化，觀察其對(duì)細(xì)胞周期分析結(jié)果的影響，以期為廣大的流式實(shí)驗(yàn)人員，特別是初學(xué)者提供實(shí)驗(yàn)條件參考。

本研究將乙醇作為固定破膜劑使用，它簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、無毒性，觀察到75%乙醇的固定效果無論是從細(xì)胞周期各時(shí)期的分析結(jié)果，還是CV 值大小來看，均明顯優(yōu)于無水乙醇或50%乙醇。這可能是無水乙醇濃度過高，快速固定而致固定不均勻，細(xì)胞發(fā)生脫水，發(fā)硬易碎，樣品的碎片增加，DNA 的釋放又導(dǎo)致細(xì)胞間黏連加大從而使分析結(jié)果出現(xiàn)偏差，而50%乙醇由于固定不充分也影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在乙醇加入方式的研究中，先將細(xì)胞團(tuán)塊用1 mL PBS 重懸后，無論是加入3 mL 預(yù)冷無水乙醇混勻還是無水乙醇加入懸液混勻，分析結(jié)果均無差異。細(xì)胞沉淀不用PBS 重懸直接加入乙醇可能因?yàn)榧?xì)胞沒有迅速分散而結(jié)團(tuán)、細(xì)胞固定不佳導(dǎo)致分析結(jié)果偏差。在染色時(shí)間的研究中，染色的初始階段因染料的結(jié)合未充分而影響了細(xì)胞周期中各期細(xì)胞百分比值，尤其是對(duì)S 期和G2/M 期的影響，經(jīng)過1 h 左右染色基本充分，各期數(shù)值在12 h 內(nèi)變化不大。乙醇固定時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)細(xì)胞周期的各期細(xì)胞數(shù)百分比影響不明顯，因此可以收集不同時(shí)期處理的樣品置-20 ℃保存，待收集完畢后同時(shí)上機(jī)檢測(cè)，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。流式細(xì)胞上樣的速度對(duì)分析結(jié)果影響顯著，由于流速的增加導(dǎo)致樣品流液柱直徑變大，有部分細(xì)胞通過激光束時(shí)偏離光斑中心，受到激發(fā)的能量下降，信號(hào)減弱，表現(xiàn)為直方圖的峰增寬，CV 值增大，數(shù)據(jù)可信度下降。因此流式檢測(cè)細(xì)胞周期一定要低速上樣。試劑說明書推薦染色合適的細(xì)胞濃度為2×106/mL，本研究用5 倍量的細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)樣品的結(jié)果偏差較大，有可能是染色不充分導(dǎo)致。細(xì)胞濃度過低時(shí)對(duì)結(jié)果影響不明顯，但大大增加了樣品的收集時(shí)間而影響實(shí)驗(yàn)的效率，若加大上樣速度又影響實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果，因此染色前對(duì)細(xì)胞的計(jì)數(shù)顯得尤為重要，建議最后一遍PBS 重懸細(xì)胞用流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)細(xì)胞，再離心去除PBS 加入合適量的染液。最后由于PI 染料黏附管路對(duì)儀器的性能影響較大，表現(xiàn)為CV 值的增大，因此每次檢測(cè)結(jié)束的清洗和定期的大維護(hù)也顯得非常重要。

綜上所述，建議在儀器設(shè)備狀態(tài)良好的前提下，推薦采用先將細(xì)胞沉淀用PBS 重懸成單細(xì)胞懸液，然后緩慢加入3 倍體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕混勻打散細(xì)胞后置于-20 ℃固定24 h 以上，按每1×106個(gè)細(xì)胞加0.5 mL 染液室溫避光染色1 h 以上，以低流速上樣檢測(cè)為最佳選擇。