基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術的莪術抗肝癌作用機制研究

李 婧，干泓俠

(1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041)

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由肝細胞癌、肝內(nèi)膽管細胞癌及混合型肝癌等組成，約90%是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC).近年來，肝癌發(fā)病率正在逐年增加，全世界每年新增患者近80萬例[1].我國是肝癌高發(fā)國家且呈明顯的上升趨勢，每年新增患者約40萬[2].肝癌的臨床治療主要以手術為主，放射介入、局部消融、靶向治療及生物基因治療等新的治療技術也為患者提供了多種治療途徑[3]，然而以上方法并不能用于所有患者，都有各自局限的適應癥.因此，尋找靶向清晰、高效低毒的新型抗肝癌藥物成為肝癌藥物研究的重要任務.

莪術(Curcumae Rhizoma)是姜科植物蓬莪術、廣西莪術及溫郁金的干燥根莖，味辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，具有消積止痛、行氣破血的功效，中醫(yī)用于治療瘀血經(jīng)閉、癥瘕痞塊、食積脹痛及胸痹心痛等病癥[4].現(xiàn)代醫(yī)學實驗證實莪術對乳腺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌、結腸癌、肝癌等多種癌癥具有一定的抗癌活性[5-7].莪術中的多種成分如β-欖香烯、吉馬酮、姜黃素等物質被證實對肝癌細胞具有較好抑制的作用[8-10]，然而莪術治療肝癌的整體作用機制尚不清楚.中藥治療腫瘤可作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，具有多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的特點.網(wǎng)絡藥理學通過檢索網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，構建“疾病-靶點-藥物”的網(wǎng)絡關系，能從整體上預測藥物作用靶點及作用機制[11]，符合中藥多成分、多途徑、多靶點的研究思路.本研究采用網(wǎng)絡藥理學的角度研究莪術抗肝癌的物質基礎及作用機制，為進一步實驗研究莪術抗肝癌的作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 莪術化學成分的獲取及篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜莪術的主要化學成分.本研究為盡可能多的篩選到有效化合物，以藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.10，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%為參考評估候選化合物.同時，查閱CNKI及PubMed等數(shù)據(jù)庫與莪術成分相關的文獻，收集莪術化學成分，結合本課實驗室前期研究，挖掘并整理莪術抗癌活性成分，對在TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選到的活性物質進行確證和補充，建立“莪術化學成分數(shù)據(jù)庫”.

1.2 活性成分作用靶點篩選

對1.1中得到的潛在活性化物進行作用靶點篩選，相應靶點從兩條途徑獲得:(1)在TCMSP數(shù)據(jù)庫以化合物名檢索并整理其靶點；(2)將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到的化合物鏈接到PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物結構以及分子信息.PharmMapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)是一個可以通過反向分子對接方法預測化合物靶點的服務平臺[12]，將化合物的3D結構SDF格式上傳到PharmMapper平臺，選擇人類數(shù)據(jù)庫，預測每種化合物的可能作用靶點.將(1)、(2)兩種途徑預測得到的化合物靶點進行整合，對應到Uniprot(http://www.uniprot.org/)蛋白數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一為靶基因名，建立“化合物-靶點數(shù)據(jù)庫”.

1.3 肝癌相關靶點的搜集及篩選

在OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)及GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中輸入關鍵詞“hepatocellular carcinoma”檢索已報道的與肝癌相關的基因，去除假陽性基因和重復基因，與“1.2”中得到的莪術活性成分作用靶點進行匹配，采用R語言加載“VennDiagram”數(shù)據(jù)包，畫出韋恩圖并取交集，獲取各數(shù)據(jù)集共有差異表達基因，得到莪術中活性成分抗肝癌的潛在作用靶基因.

1.4 莪術活性“成分-疾病-作用靶點”網(wǎng)絡構建與分

Cytoscape軟件能將藥物治療疾病的活性成分及作用機制進行可視化分析[13].將莪術化學成分及抗肝癌作用靶點信息導入Cytoscape(Version 3.7.1)軟件，構建“成分-疾病-作用靶點”網(wǎng)絡圖.在關系網(wǎng)絡圖中，其中的節(jié)點(node)表示化合物、疾病或靶蛋白.其中邊(edge)表示節(jié)點分子之間的互關系.網(wǎng)絡中每個節(jié)點的重要性都通過度數(shù)(Degree)和接近中心度(Betweenness Centrality)進行評估[14].節(jié)點的Degree表示與其相連的邊的個數(shù)，Degree越大表示參與的生物功能越多，提示該節(jié)點在作用網(wǎng)絡中越重要.

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)的構建與分析

String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是一個收集了大量的蛋白相互作用關系的數(shù)據(jù)庫，可以預測靶蛋白之間相互作用關系的數(shù)據(jù)庫[15].將莪術抗肝癌的潛在作用靶點信息導入String數(shù)據(jù)庫，物種設置為人，得到蛋白互作關系，保存TSV格式結果及蛋白互作圖片，用R語言計算核心基因并畫圖.

1.6 生物過程分析

“ClusterProfiler”是Bioconductor的一個軟件包，可以對基因cluster或基因集合進行功能聚類的統(tǒng)計及可視化分析.在R語言中加載“clusterProfiler”包，對莪術活性成分潛在作用靶點進行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes(KEGG)通路富集分析，閾值設定為P≤0.05，統(tǒng)計篩選出具有顯著性差異的生物過程及作用通路.并繪制柱狀圖、點狀圖及作用通路圖.

1.7 分子對接

利用UniProt檢索“1.5”中得到的關鍵靶蛋白的PDB ID，從RSCB PBD數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載PBD格式的3D結構文件，利用AutoDock Tools及PyMOL軟件對下載的靶蛋白進行去水、加氫、加電子等前處理，并根據(jù)文獻報道的靶蛋白活性位點或靶蛋白中配體的坐標初步確定分子對接的活性位點.采用AutoDock Vina進行分子對接，根據(jù)靶蛋白與配體的結合自由能判斷其親和力.

2 結果

2.1 莪術活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集莪術化學成分共81個，以OB≥30%，DL≥0.1為標準篩選化合物得到17個化合物.同時，對大量已報道文獻進行挖掘與整理，結合本實驗室前期研究，篩選具有抗癌活性的化合物，將TCSMP數(shù)據(jù)庫與文獻整理得到的化合物進行綜合，補充包括beta-elemene、curcumol、curdione、daucosterol、demethoxycurcumin、curcumadiol及germacrone等7種化合物，這幾種化合物中curcumin、beta-elemene、germacrone及curdione雖然OB或DL值較低，但是文獻報道具有抗癌活性的重要化合物[7-9]，因此我們也作為莪術抗癌活性成分進行研究.綜上研究，最終得到24個莪術活性成分，見表1.

表1 莪術中的主要活性成分Table 1 Main active ingredients in Curcumae Rhizoma

OB，oral bioavailability；DL，drug-likeness

2.2 莪術抗肝癌靶點預測

將以上24種化合物在TCMSP中檢索，收集蛋白靶點.同時，將以上24種化合物在PubChem數(shù)據(jù)庫種獲得的3D結構上傳至PharmMapper，預測每種化合物的作用靶點，將以上兩種方式獲得的化合物作用靶點進行整合，映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)一為基因名，去除重復靶點，共得到276個蛋白靶點.采用R語言將上述基因與在GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到已報道的與肝癌相關的基因取交集，獲取各數(shù)據(jù)集共有差異表達基因，得到莪術活性成分抗肝癌的潛在作用靶蛋白共73個，見表2.

表2 莪術抗肝癌潛在靶蛋白信息Table 2 Information of potential anti-HCC targets from Curcumae Rhizoma

GOT1 Aspartate aminotransferase，cytoplasmic RXRA Retinoic acid receptor RXR-alpha MAPK9 Mitogen-activated protein kinase 9 SLC6A2 Sodium-dependent noradrenaline transporter IDH1 Isocitrate dehydrogenase[NADP] PTGS1 Prostaglandin G/H synthase 1 C1QBP Complement component 1 Q subcomponentbinding protein，mitochondrial NCOA2 Nuclear receptor coactivator 2 HSP90AA1 Heat shock protein HSP 90-alpha BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2 GPI Glucose-6-phosphate isomerase CDKN1A Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 GLYCTK Glycerate kinase EIF6 Eukaryotic translation initiation factor 6 S100A11 Protein S100-A11 RB1 Retinoblastoma-associated protein CAT Catalase TP63 Cellular tumor antigen p53 COG2 Conserved oligomeric Golgi complex subunit 2 TEP1 Telomerase protein component 1 FBP1 Fructose-1，6-bisphosphatase 1 CCNB1 G2/mitotic-specific cyclin-B1 PARP1 Poly[ADP-ribose]polymerase 1 RHOA Transforming protein RhoA MAGEA4 Melanoma-associated antigen 4 KCNH2 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2 VDR Vitamin D3 receptor ADH1C Alcohol dehydrogenase 1C MAP3K3 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3 PGR Progesterone receptor ALOX12 Arachidonate 12-lipoxygenase，12S-type ADRA1B Alpha-1B adrenergic receptor FLNB Filamin-B ADH1B Alcohol dehydrogenase 1B BTK Tyrosine-protein kinase BTK ACHE Acetylcholinesterase UAP1 UDP-N-acetylhexosamine pyrophosphorylase NR3C1 Glucocorticoid receptor CAPN2 Calpain-2 catalytic subunit NR3C2 Mineralocorticoid receptor AMY1A Alpha-amylase 1 CTSD Cathepsin D MAOA Amine oxidase[flavin-containing]A BCHE Cholinesterase H3F3B Histone H3 PRSS1 Trypsin-1 SDHA Succinate dehydrogenase[ubiquinone]flavoprotein subunit，mitochondrial ESR1 Estrogen receptor HPD 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase AR Androgen receptor ROCK2 Rho-associated protein kinase 2

2.3 莪術“成分-疾病-作用靶點”網(wǎng)絡構建

將疾病、莪術活性成分及和作用靶點的信息導入Cytoscape軟件，構建“成分-疾病-作用靶點”網(wǎng)絡，見圖1.如圖可見，網(wǎng)絡中共涉及98個節(jié)點和242條邊.其中綠色代表靶點蛋白，藍色代表活性化合物，紅色代表疾病(HCC)，黃色代表莪術(ezhu)，邊代表相互關系.采用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡中所有節(jié)點的拓撲參數(shù)，得到化合物的平均degree為7.2，得到度數(shù)越大，說明每個活性成分可作用于多個靶點，因此莪術抗肝癌作用具有多靶點特性.其中度數(shù)較大(degree＞10)的化合物為beta-elemene，hederagenin，germacrone，gweicurculactone，curcumadiol，每個節(jié)點的相對位置由其接近中心度(Betweenness Centrality)決定，接近中心度越大表示越接近其他所有節(jié)點.分析顯示以上幾種成分接近中心度較高，位于網(wǎng)絡的中心，是莪術抗肝癌重要的活性化合物.化合物拓撲學參數(shù)見表1.

圖1 莪術化合物-靶點網(wǎng)絡綠色代表靶點蛋白，藍色代表活性化合物，紅色代表疾病(HCC)，黃色代表莪術(ezhu)Fig.1 Components-targets network of Curcumae RhizomaThe green is the targets，the blue is the main active ingredients，the red is disease(HCC)，yellow is Curcumae Rhizoma(ezhu)

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)構建及分析

采用STRING在線工具對73個潛在靶點基因進行編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)構建，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關系，保存其TSV格式文件及PPI圖，見圖2(a).圖中的節(jié)點表示靶蛋白，邊表示靶蛋白之間的關聯(lián)，共包括73個節(jié)點及199個邊.采用R語言計算關鍵基因，對排名前30基因作圖，結果見圖2(b)，如圖可見CAT，CYCS，HSP90AA1，ESR1，PTGS2，PGR，AR，CDKN1A，RHOA等基因在PPI中處于較中心位置，為莪術抗肝癌重要靶基因，可進一步研究.

圖2 莪術蛋白相互作用網(wǎng)絡圖及關鍵基因(a.蛋白互作網(wǎng)絡，b.關鍵基因)Fig.2 Protein interaction network and key gene of Curcumae Rhizoma(a.Protein interaction network，b.Key gene)

2.5 靶點生物學功能分析

2.5.1 莪術抗肝癌的潛在靶點GO基因功能分析

為了進一步研究莪術抗肝癌作用的分子機制，我們將73個潛在靶點采用R語言中的“clusterProfiler”包進行富集，設定閾值P≤0.05，進行生物學功能富集，共富集到34條生物過程，對前20條過程作圖，顏色越紅表明富集程度越高，GO分析結果見圖3.結果顯示，這些靶點主要涉及類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、核受體活性(nuclear receptor activity)、轉錄因子活性(transcription factor activity)、過氧化物酶活性(peroxidase activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、與類固醇的結合(steroid binding)、抗氧化活性(antioxidant activity)、核激素受體結合(nuclear hormone receptor binding)、激素受體結合(hormone receptor binding)等生物學功能.這些生物學過程表明網(wǎng)絡中莪術作用的肝癌相關靶點主要與激素調節(jié)、細胞轉錄調節(jié)、氧化還原等能量代謝過程有關，莪術可能是通過調節(jié)這些生物過程發(fā)揮其抗肝癌作用.

圖3 莪術抗肝癌的潛在靶點GO基因功能分析(A.柱狀圖；B.點狀圖)Fig.3 GO analysis of potential targets for Curcumae Rhizoma in treating hepatocellular carcinoma(A.Barplot；B.Dotplot)

2.5.2 莪術抗肝癌的潛在靶點KEGG通路富集分析

采用R語言中的“clusterProfiler”包共富集得到38條信號通路，對前20條通路作圖，按照P判斷其可靠性，顏色紅表明富集程度越高，KEGG分析柱狀圖和點狀圖見圖4.結果顯示，碳代謝通路(Carbon metabolism)、酪氨酸代謝通路(Tyrosine metabolism)、小細胞肺癌(Small cell lung cancer)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、激素抵抗(Endocrine resistance)等信號通路與莪術抗肝癌作用相關性較大.提示莪術抗肝癌靶點分散于這些通路中，其中多個靶點能在多條通路中發(fā)揮作用，如:CYCS、HSP90AA1、PTGS2等.

圖4 莪術抗肝癌的潛在作用靶點KEGG通路富集分析(A.柱狀圖；B.點狀圖)Fig.4 KEGG pathway analysis of potential targets for Curcumae Rhizoma in treating hepatocellular carcinoma(A.Barplot；B.Dotplot)

2.6 分子對接

選擇CAT、CYCS、HSP90AA1、ESR1等4個關鍵靶蛋白，將2.1項中得到的有效成分中22個結構確證的成分與上述4個靶點蛋白進行分子對接，以結合能判斷其親和力，結合能為負值說明受體與配體具有親和力，結合能小于-5.0 kcal·mol-1說明親和力較好.對 接 結 果 見 表3，由 表 可 見CAT、CYCS、HSP90AA1、ESR1等關鍵靶蛋白與莪術有效成分結合能均小于-5.0 kcal·mol-1，分子對接結果說明關鍵靶蛋白莪術活性成分具有較好的親和力.

表3 莪術中22個化合物與部分靶點的結合能值(kcal·mol-1)Table 3 The binding energy value of the 22 compounds in Curcumae Rhizoma with part of targets(kcal·mol-1)

3 討論

大量文獻報道莪術中有效成分具有抗肝癌作用，然而莪術中成分復雜，具有中藥多成分多靶點的特性.本研究首先對莪術抗肝癌的物質基礎進行了挖掘，納入的24中化合物中包括從TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到的17個滿足要求的化合物以及從文獻報道中搜集到7種具有抗癌活性的化合物.中藥成分理想的篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18，為了更多的納入潛在化合物，我們將DL≥0.1做為篩選標準.我們納入的24種化合中curcumin、beta-elemene、germacrone等化合物OB或DL值較低，但是文獻報道具有抗肝癌活性的重要化合物.例如，有研究報道注射Beta-elemene能有效抑制肝癌HepG2細胞的增殖，促進細胞凋亡[7]；curcumin可以通過降低VEGF表達在體內(nèi)外抑制肝癌的增殖[8]；germacrone可以誘導G2/M細胞周期阻滯促進細胞凋亡，從而對肝癌細胞系產(chǎn)生抑制作用[9].因此，我們將這些潛在活性化合物也納入我們的研究中.結果表明beta-elemene、germacron、curcumin等化合物位于化合物-靶點網(wǎng)絡中心，是莪術抗肝癌的重要活性物質，與已有文獻報道相符.

莪術的化合物-靶點網(wǎng)絡圖顯示了莪術多成分、多靶點的抗肝癌作用特點.其中CAT、CYCS、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、PGR、AR、CDKN1A、RHOA、PARP1、CCNB1、CTSD等靶基因處于網(wǎng)絡中心，可作為莪術抗肝癌的重要靶基因，這些靶基因涉及激素的調節(jié)、細胞轉錄調節(jié)、氧化還原調節(jié)等能量代謝過程.激素被證實與多種癌癥相關，研究報道激素與肝癌的發(fā)生相關，固醇類激素可作為肝癌檢測的標志物[16]，雌雄激素的失調可能是肝癌發(fā)生的誘因.以上重要靶基因中ESR1、PARP1、PGR、AR等基因是莪術參與激素調節(jié)以及細胞轉錄調節(jié)的基因.有研究證實ESR1(雌激素受體1)可以通過與SP1蛋白結合介導肝癌細胞的凋亡[17]；PARP1(多聚ADP-核糖聚合酶1)在肝癌細胞中高表達，PARP1缺陷可抑制肝癌細胞生長和遷移；AR(雄激素受體)可以通過抑制環(huán)狀RNA的表達對肝癌產(chǎn)生調控[18].此外，本研究提示氧化還原等能量代謝調控也是莪術肝癌的重要調控方式，以上重要基因中CAT、PTGS2等基因是氧化還原調控的基因.CAT的表達或降低會導致細胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度增加，可形成氧化壓力，引起蛋白質大分子物質的不穩(wěn)定性增加，誘發(fā)腫瘤.研究報道活性成分germacrone可以使ROS濃度增加及p53表達上調，誘導G2/M細胞周期阻滯，促進肝癌細胞凋亡[19].同時，CAT基因也可通過下調金屬蛋白酶(MMPs)和NF-κB的表達等功能，抑制肝癌細胞的轉移[20].研究證實活性成分curcumin可以通過抑制腫瘤NF-κB通路抑制肝癌[21].前列腺素合成酶2(PTGS2)又稱環(huán)氧化酶(COX-2)，實驗證明PTGS2的過表達能降低TET1誘導啟動子高甲基化從而誘導肝癌[22]，因此莪術對CAT、PTGS2等基因的調控也可能是其抗肝癌的原因.碳代謝能為肝癌細胞提供能量，促進肝癌的發(fā)生，對碳代謝的調控也成為治療肝癌的一種途徑[23].對莪術抗肝癌KEGG通路富集結果提示，莪術可能通過碳代謝通路影響肝癌.莪術對肝癌氧化還原代謝以及碳代謝的影響也提示可能通過線粒體途徑誘導肝癌凋亡.本研究還提示莪術抗肝癌還與酪氨酸代謝通路及激素調控的信號通路相關，這些通路都被證實在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了一定的作用.因此，本研究的預測結果與現(xiàn)代藥理學研究也是相互驗證的.此外，本研究對預測得到的重要作用靶蛋白進行了分子對接驗證，結果靶蛋白與莪術有效成分親和力較好，驗證本研究靶點預測的可靠性，同時也為后續(xù)進一步研究提供了參考.

綜上，本研究采用網(wǎng)絡藥理學及分子對接的方法對莪術抗肝癌潛在活性成分、作用靶點以及作用機制進行了初步研究，結果提示莪術有24個重要潛在活性成分可能作用于73個靶基因，涉及多個生物過程、靶基因及相關通路，體現(xiàn)了莪術抗肝癌“多成分-多靶點-多途徑”的特點，本研究為進一步深入探討其作用機制提供了參考，相關靶點和通路的驗證也正在實驗進行中.本研究也存在一定局限性，如數(shù)據(jù)庫信息不全面、化合物篩選的主觀性等使研究結果存在一定的片面性.