氯蟲苯甲酰胺對亞洲玉米螟解毒酶活性及生長發(fā)育的影響

支昊宇,丁新華,陳萍,葉茂林,閆陽陽,姜衛(wèi)華*

(1.南京農業(yè)大學植物保護學院,江蘇 南京 210095;2.新疆農業(yè)科學院植物保護研究所/農業(yè)農村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室,新疆 烏魯木齊830091)

亞洲玉米螟(OstriniafurnacalisGuenée)是我國玉米生產的主要害蟲,可造成玉米產量損失10%～30%,大發(fā)生時可達 50%以上,嚴重威脅玉米的品質及產量。2003年以來,亞洲玉米螟(以下簡稱玉米螟)在全國的發(fā)生呈持續(xù)上升趨勢[1]?；瘜W藥劑的使用是防治該蟲有效的手段之一,但殺蟲劑的大量頻繁施用,玉米螟的抗藥性也會成為不可避免的問題[2-3]。

氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是新型鄰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑,它作用于魚尼丁受體(Ryanodine receptor,RyR),具有高效、低毒、對其他類型殺蟲劑無交互抗性等特點,引起市場廣泛關注[4]。隨著氯蟲苯甲酰胺的推廣使用,一些重要農業(yè)害蟲,如甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、二化螟(Chilosuppressalis)對氯蟲苯甲酰胺都已產生中等至高水平抗性[5-7]。調查發(fā)現該藥劑對玉米螟也具有良好的室內活性及田間控制效果[8-9],但伴隨著使用頻率的增加,玉米螟對氯蟲苯甲酰胺的敏感性勢必會逐漸降低,目前尚無玉米螟對氯蟲苯甲酰胺產生抗性的相關報道。

害蟲對雙酰胺類殺蟲藥劑的抗性機制,主要涉及細胞色素P450多功能氧化酶系(cytochrome P450 enzymes,P450)、谷胱甘肽S-轉移酶(GlutathioneS-transferase,GST)及酯酶(Esterase,EST)3種解毒酶活性增強導致的代謝抗性[10],以及魚尼丁受體結構突變和表達量的改變所引起的靶標抗性[11-12]?？顾幮缘漠a生一方面由于殺蟲劑過量、不合理的使用,另一方面也和農藥產生的亞致死作用有關。由于生物和非生物因素的影響,導致田間用藥時部分害蟲沒有接觸到足以致死的農藥量,這種亞致死劑量不僅影響害蟲的行為、生長發(fā)育和繁殖,還能對解毒酶活性及靶標受體表達量有誘導作用,從而對害蟲抗藥性的發(fā)展產生影響。有關氯蟲苯甲酰胺對害蟲的亞致死效應有不少研究報道。孫麗娜等[13]發(fā)現,低劑量的氯蟲苯甲酰胺連續(xù)和間斷處理均可使小菜蛾RyR基因表達量增加。氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理可引起二化螟雌成蟲體內卵黃蛋白CsVg表達量下降[14]。亞致死劑量氯蟲苯甲酰胺連續(xù)篩選小菜蛾5 代,其體內羧酸酯酶(Carboxylesterase,CarE)和P450比活力顯著增強[15]。Plata-Rueda等[16]發(fā)現,氯蟲苯甲酰胺LD50處理不僅降低咖啡果小蠹的存活率,還可降低其呼吸率,引起生物適合度成本的提高,同時也削弱肌肉活動導致的癱瘓。對天敵的處理發(fā)現,氯蟲苯甲酰胺對異色瓢蟲、七星瓢蟲的生長發(fā)育有明顯抑制效應[17-18]。由此可見,亞致死效應研究也是綜合、全面評價殺蟲劑防治效果中重要的一面。最近Song等[19]研究發(fā)現,氯蟲苯甲酰胺對玉米螟的生長發(fā)育有抑制作用,但目前尚未有關于氯蟲苯甲酰胺脅迫對玉米螟解毒酶活性影響的報道。

新疆是全國玉米主產區(qū)之一,種植總面積位于新疆糧食作物第2位[9]。玉米螟近年來在新疆主產區(qū)發(fā)生不斷加劇[1,9],氯蟲苯甲酰胺作為防治的主要化學藥劑,當地玉米螟對其敏感性水平變化尚不明確。本研究對新疆不同地區(qū)玉米螟進行抗性水平及3種主要代謝酶活性的測定,發(fā)現新疆玉米螟種群對氯蟲苯甲酰胺出現敏感性降低的現象;進一步采用低劑量氯蟲苯甲酰胺處理室內玉米螟3齡幼蟲,分析其生長發(fā)育以及體內解毒酶活性的變化,研究結果將為預防玉米螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性發(fā)展及該蟲的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2018年3—4月于新疆烏魯木齊、伊寧及喀什地區(qū)疏勒和澤普采集玉米螟越冬老熟幼蟲,轉至室內利用人工飼料飼養(yǎng),3齡幼蟲作為抗性測定試蟲。室內品系(S):疏勒種群不接觸藥劑人工飼料飼養(yǎng)7代。篩選品系(CAP-Sel):用氯蟲苯甲酰胺LD50以點滴法處理室內品系3齡幼蟲,連續(xù)篩選9代。養(yǎng)蟲室溫度(26±1)℃、相對濕度60%、光/暗時間為16 h/8 h。

1.2 供試藥劑

96%氯蟲苯甲酰胺原藥(chlorantraniliprole)為南京紅太陽股份有限公司產品。

1.3 毒力測定方法

利用點滴法測定玉米螟對藥劑的敏感性。選取生長一致的玉米螟 3 齡幼蟲,放入培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中。用丙酮將各原藥按不同濃度梯度稀釋,用Hamillton點滴器吸取1.1 μL藥液,滴于玉米螟3齡幼蟲前胸背板處,點滴丙酮作為對照。處理后以人工飼料飼喂試蟲,并置于(26±1)℃、相對濕度 75%、光/暗時間為16 h/8 h的恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。每處理重復3次,每重復10頭幼蟲。氯蟲苯甲酰胺處理72 h后檢查玉米螟的死亡情況。

1.4 酶活性測定

1.4.1 酶液制備氯蟲苯甲酰胺LD20和LD50分別處理室內品系3齡幼蟲72 h的存活試蟲、CAP-Sel品系每世代及不同田間種群的3齡幼蟲,用液氮速凍后放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。對照為丙酮處理或室內敏感品?每處理10個重復。取試蟲單頭于勻漿器內,分別加入 1.2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.6,含 1 mmol·L-1EDTA,1 mmol·L-1DTT,1 mmol·L-1PTU,1 mmol·L-1PMSF)勻漿,用于細胞色素P450多功能氧化酶活性測定;加入 1.2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.6)勻漿用于谷胱甘肽S-轉移酶活性測定;加入 1.2 mL 0.02 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.0)勻漿用于酯酶活性測定。勻漿液于 4 ℃、 13 000g離心 15 min 后,將上清液轉移到新的 1.5 mL 離心管,重復離心1次后,取上清液作為酶液。

1.4.2 P450活性測定根據Rose等[20]的方法測定。在96孔酶標板中依次加入100 μL 2 mmol·L-1對硝基苯甲醚(P-NA)和90 μL酶液,在30 ℃溫育3 min后,加入10 μL 9.6 mmol·L-1NADPH 開始反應。在SPECTRA max?340-PC型酶標儀(美國Molecular Devices公司生產)405 nm處每隔20 s記錄15 min內的吸光值變化,酶促反應溫度為30 ℃。P450比活力用ΔmD·min-1·mg-1表示。

1.4.3 EST活性測定根據Yang等[21]的方法測定。在96孔板中依次加入10 μL酶液、205 μL固藍RR鹽和α-NA混合液。用酶標儀在450 nm處每隔30 s記錄10 min內的吸光值變化,酶促反應溫度為27 ℃。EST比活力以ΔmD·min-1·mg-1表示。

1.4.4 GST活性測定根據Yang等[21]的方法測定GST活性。當底物為CDNB或DCNB時,分別在96孔酶標板中加入10 μL或25 μL酶液、1.2 mmol·L-1CDNB或DCNB 100 μL、6 mmol·L-1還原型谷胱甘肽100 μL。用酶標儀在波長340 nm處每隔10 s記錄20 min內的吸光值變化,酶促反應溫度為30 ℃。GST比活力以 ΔmD·min-1·mg-1表示。

1.4.5 總蛋白測定參照Bradford[22]考馬斯亮藍G-250法測定蛋白含量。

1.5 氯蟲苯甲酰胺短期及長期處理對玉米螟生長發(fā)育的影響

利用氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量LD20點滴法處理室內品系3齡幼蟲,72 h后將存活幼蟲100頭轉入無毒人工飼料上繼續(xù)飼養(yǎng),每處理共設4次重復,以丙酮為對照組。另外,用氯蟲苯甲酰胺LD50連續(xù)處理室內品系3齡幼蟲9代,F10代建立生命表,每處理100頭初孵幼蟲,4個重復。每間隔24 h觀察記載不同處理組幼蟲的齡期,化蛹后分別記錄化蛹數、蛹重、雌雄比及成蟲羽化數。在各處理組中隨機選取同日羽化的雌、雄玉米螟成蟲各1頭配對,每對作為1次重復,每處理至少60個重復。將配對成蟲用玻璃試管移入塑料框(38 cm×26 cm×21.5 cm)內,頂部用黑色棉布封口,框底放置含10%蜂蜜水溶液的脫脂棉,以此作為成蟲的補充營養(yǎng)?？騼缺诟街蛴〖?供成蟲產卵,每隔3 d更換新的產卵用紙,直至雌蛾死亡,收集并記錄產于打印紙上的蟲卵量,計算單雌產卵量。將卵塊放入幼蟲飼養(yǎng)盒中,放入人工飼料,待幼蟲孵化記錄幼蟲孵化數,計算卵孵化率(幼蟲孵化數/總卵量)。

1.6 數據分析

根據機率值分析法用Excel計算LD50值及95%置信限?？剐员稊?RR)=田間種群LD50/參照種群LD50,抗性級別劃分標準:RR低于3倍為敏感;3.1～5.0倍為敏感性下降;5.1～10.0倍為低水平抗性;10.1～40.0倍為中等水平抗性;40.1～160.0倍為高水平抗性;高于160.0倍為極高水平抗性[23]。利用SPSS 18.0軟件(Turkey’s檢驗)分析酶活性及生長發(fā)育數據的差異顯著性(P<0.05)。

凈增殖率(R0):指個體的總后代數,R0=∑lxmx。式中:x為特定年齡;lx為特定年齡x的存活率;mx為x時間的雌蟲平均產卵數量。T為世代平均歷期,T=∑lxmxx/R0。內稟增長率(r):指種群在理想狀態(tài)下的最大種群增長率,r=lnR0/T。

2 結果與分析

2.1 新疆玉米螟種群對氯蟲苯甲酰胺的敏感性

由表1可以看出:烏魯木齊種群的敏感性最高,LD50為0.002 5 μg·頭-1,以該種群作為相對敏感種群,伊寧種群也表現敏感(RR為1.32倍),而疏勒和澤普種群則敏感性降低,RR分別為4.00和4.20倍。

表1 新疆不同地區(qū)玉米螟對氯蟲苯甲酰胺的敏感性Table 1 Sensitivity to chlorantraniliprole of different populations of Ostrinia furnacalis in Xinjiang using topical application(2018)

2.2 氯蟲苯甲酰胺對玉米螟解毒酶活性的影響

2.2.1 新疆不同玉米螟種群解毒酶活性的差異從表2可以看出:對氯蟲苯甲酰胺敏感性不同的玉米螟種群之間P450和GST(DCNB為底物)活性差異顯著。其中,伊寧種群的P450酶活性最高,烏魯木齊種群次之,澤普和疏勒種群的酶活性最低;對于GST(DCNB為底物),疏勒種群的酶活性最高,伊寧和澤普種群的酶活性最低。而GST(CDNB為底物)和酯酶的酶活性均為澤普最高,但與其他種群之間沒有顯著差異。

表2 新疆地區(qū)玉米螟種群解毒酶活性比較Table 2 Comparison of detoxification enzyme activities of O.furnacalis in Xinjiang

2.2.2 氯蟲苯甲酰胺短期及長期處理對玉米螟解毒酶活性的影響測定玉米螟室內品系對氯蟲苯甲酰胺的敏感性,得出LD20和LD50分別為0.30和0.71 ng·頭-1。由表3可見:氯蟲苯甲酰胺LD20和LD50處理玉米螟72 h,3種解毒酶活性隨處理劑量的升高而增加。LD20和LD50處理組的GST(DCNB為底物)活性顯著高于對照,分別增加46%和86%(活性比分別為1.46和1.86),以CDNB為底物的GST活性高于對照但差異不顯著。LD50處理組的EST酶活性顯著高于LD20,但與對照均無顯著差異。

當使用LD50劑量連續(xù)篩選玉米螟時,發(fā)現隨篩選代數的增加,3種解毒酶活性都呈增加的趨勢(圖1),但第2、5和8代(F2、F5、F8)的EST活性與敏感品系相比都無顯著差異。P450酶在F5和F8代的活性是敏感品系的4.27和5.09倍(P<0.05);F5和F8代GST(底物CNDB)及F8代的GST(底物DCNB)活性分別是敏感品系的1.27、1.33和1.36倍(P<0.05)?？梢钥闯?氯蟲苯甲酰胺長期與短期處理對玉米螟解毒酶活性影響的趨勢接近。

2.3 氯蟲苯甲酰胺對玉米螟生長繁殖的影響

從表4可以看出:與對照相比,經氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量LD20處理72 h,玉米螟蛹重和單雌產卵量顯著降低,蛹重降低9.2%,單雌產卵量減少約30%;此外,幼蟲生長期和蛹期都延長,成蟲羽化率、成蟲雌雄比、卵孵化率降低,但與對照相比差異不顯著。最終處理組的內稟增長率低于對照,但無明顯差異,表明氯蟲苯甲酰胺短期處理對玉米螟的生物適合度有一定影響但不顯著。

表4 氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量(LD20)處理72 h對玉米螟存活和生長發(fā)育的影響Table 4 Effects of chlorantraniliprole sublethal dose LD20 treated for 72 h on development of O.furnacalis

從表5可以看出:與敏感品系相比,玉米螟篩選品系F10代1齡和3齡幼蟲期顯著延長,蛹重、羽化率顯著增加6.58%和4.27%;單雌產卵量及孵化率比敏感品系顯著降低14.83%和5.84%。篩選品系的內稟增長率顯著低于敏感品系,表明氯蟲苯甲酰胺長期處理對玉米螟的生物適合度有顯著影響。

表5 氯蟲苯甲酰胺(LD50)連續(xù)處理對玉米螟存活和生長發(fā)育的影響Table 5 Life tables of the susceptible strain and tenth generation of O.furnacalis selected continuously by LD50 dose of chlorantraniliprole

3 討論

新疆地區(qū)近些年玉米螟的發(fā)生呈爆發(fā)態(tài)勢,除了以赤眼蜂為主的生物防治以外,化學藥劑的使用對于有效、快速地控制玉米螟種群數量尤為重要。氯蟲苯甲酰胺是近幾年來才開始用于玉米螟的防治,本文抗性監(jiān)測結果發(fā)現相對于烏魯木齊種群,疏勒和澤普種群對氯蟲苯甲酰胺呈現敏感性降低,可見玉米螟對該藥劑抗性發(fā)展的風險較高,有必要加強當地玉米螟的抗性監(jiān)測,為合理用藥和有效防治提供科學指導。

害蟲抗藥性機制的闡明是抗性治理的重要前提。其中解毒酶活性的增強是害蟲抗藥性產生的重要機制之一。亞致死效應涉及害蟲的行為學、生物學、生理學及抗藥性發(fā)展等很多方面,有關研究可為藥劑的合理使用、避免或減少藥劑的副作用提供一定的理論依據。本研究初步發(fā)現,疏勒和澤普種群對氯蟲苯甲酰胺有發(fā)展抗性的潛在趨勢,通過亞致死效應研究可初步明確玉米螟對氯蟲苯甲酰胺抗性產生相關的解毒酶。

氯蟲苯甲酰胺處理對不同害蟲解毒酶的誘導作用不同。Mao等[24]發(fā)現,0.01 mg·L-1氯蟲苯甲酰胺處理家蠶可使其P450和GST比活力顯著升高。陳羿渠等[25]發(fā)現,甜菜夜蛾氯蟲苯甲酰胺抗性品系的GST與P450活性顯著高于敏感品系,用亞致死劑量氯蟲苯甲酰胺處理抗性品系后其3 種解毒酶活性均有一定程度的上升,且P450 活性的增長倍數最高。與之結果相似的是,本研究發(fā)現玉米螟篩選品系F5和F8代的P450和GST活性都顯著升高,其中 P450活性增長最為顯著;另外氯蟲苯甲酰胺LD20、LD50短期處理對玉米螟解毒酶活性都有誘導作用,但僅GST活性顯著升高;酯酶在玉米螟對氯蟲苯甲酰胺的代謝中不起主要作用。Li等[26]研究表明,不同褐飛虱田間種群的GST活性與其對氯蟲苯甲酰胺的LD50值呈正相關。本研究也發(fā)現,對氯蟲苯甲酰胺敏感性降低的疏勒和澤普玉米螟的GST活性也相對較高。綜合以上結果作者認為,GST和P450可能與玉米螟對氯蟲苯甲酰胺的敏感性下降有關。但也有與本研究結果不同的報道,如亞致死劑量氯蟲苯甲酰胺對棉鈴蟲的GST活性有抑制作用[27];而東亞飛蝗經氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理7 d可導致其GST活性顯著升高,但P450活性顯著降低[28]。究其原因可能是由于受藥昆蟲的種類和生理狀況、施用殺蟲劑及其濃度、處理方法等差異所引起的。解毒酶活性增強是害蟲產生抗性的主要機制之一。研究發(fā)現在殺蟲劑脅迫下昆蟲解毒代謝酶可通過基因表達量上調和突變導致解毒能力加強,從而使昆蟲產生抗藥性[10,29-30]。本研究中玉米螟經氯蟲苯甲酰胺處理引起P450和GST活性增加的分子機制有待進一步研究探明。

殺蟲劑亞致死劑量不僅對昆蟲的解毒酶具有誘導或抑制作用,也可對害蟲種群的生物學特性產生影響。歐善生等[27]利用氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量(LC10、LC25和LC50)處理可引起棉鈴蟲幼蟲和蛹重顯著降低,幼蟲期顯著延長,而成蟲期顯著縮短。Song等[19]用氯蟲苯甲酰胺LC10(0.038 mg ·L-1)和LC40(0. 098 mg ·L-1)處理玉米螟3 齡幼蟲120 h后,發(fā)現幼蟲和蛹的發(fā)育歷期顯著延長,產卵量也顯著降低。本研究發(fā)現,氯蟲苯甲酰胺LD20短期處理可造成玉米螟的蛹重和產卵量顯著降低,3齡幼蟲至預蛹的生長期延長但與對照無顯著差異,這與Song等[19]的結果不盡相同但具有相似的趨勢。陳羿渠等[25]利用亞致死劑量氯蟲苯甲酰胺連續(xù)篩選甜菜夜蛾6代后,發(fā)現抗性品系成蟲的產卵前期和總產卵前期延長,而產卵量減少,其內稟增長率、周限增長率和凈增殖率均顯著小于敏感品系。與之類似的是,本研究中氯蟲苯甲酰胺連續(xù)篩選玉米螟9代可導致F10代1齡和3齡幼蟲期顯著延長,蛹重、羽化率顯著增加,但產卵量、孵化率顯著降低,最終內稟增長率顯著低于對照,可以看出本研究中無論是短期或長期處理的結果都表明氯蟲苯甲酰胺對玉米螟的生長發(fā)育具有抑制作用。

本文對新疆玉米螟抗性監(jiān)測結果顯示:澤普和疏勒種群對氯蟲苯甲酰胺敏感性降低,且分別具有最高的GST活性(底物分別為CDNB和 DCNB);氯蟲苯甲酰胺短期和長期處理不僅抑制玉米螟的生長發(fā)育,也可誘導GST和P450活性增加,有利于玉米螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性發(fā)展。因此,新疆玉米螟具有對氯蟲苯甲酰胺產生抗性的風險,其中GST和P450活性的增加可能是敏感性降低和抗性形成的機制之一,這有待于進一步的研究證實。