血府逐瘀湯提取過(guò)程中成分的量變規(guī)律研究*

薛夢(mèng)潔，于卉娟，王璐瑤，柴欣，楊靜，王躍飛

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

血府逐瘀湯源自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是“逐瘀湯”系列方中臨床應(yīng)用較為廣泛的方劑，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地、牛膝、甘草等11味藥組成[1]。該方具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，主要治療“胸中血府血瘀”所致諸證，多應(yīng)用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、婦科疾病等。其組成藥味中含有黃酮、有機(jī)酸、生物堿等化合物，特別是含有大量黃酮類化合物[2]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，血府逐瘀湯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化，抑制心肌細(xì)胞壞死及凋亡，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生，抗肺纖維化等藥理作用[3-4]。

血府逐瘀湯在防治心血管疾病方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，被開(kāi)發(fā)成多種劑型，如片劑、膠囊劑、口服液等。課題組前期采用超高效液相色譜法開(kāi)展了血府逐瘀湯主要?jiǎng)┬偷?2個(gè)成分差異分析，研究表明不同劑型中指標(biāo)成分的差異較大，可能是由于提取工藝和制劑工藝不同引起的[5]。文獻(xiàn)也報(bào)道了傳統(tǒng)煎煮法、超臨界CO2萃取法對(duì)血府逐瘀湯主要化學(xué)成分的提取效果，超臨界CO2萃取物的有效成分提取率明顯高于煎煮法[6]。以芍藥苷為指標(biāo)，系統(tǒng)開(kāi)展不同提取時(shí)間、煎煮方法、干燥條件下血府逐瘀湯的提取效率研究，延長(zhǎng)提取時(shí)間、減壓干燥有助于提高芍藥苷轉(zhuǎn)移率[7-8]。目前，關(guān)于不同提取條件下血府逐瘀湯水提液紫外光譜變化情況及不同極性成分提取過(guò)程中的量變情況鮮有報(bào)道。

本研究采用水提法系統(tǒng)研究不同提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)血府逐瘀湯成分的提取效率的影響，通過(guò)紫外分光光度法和超高效液相色譜法測(cè)定不同提取液的吸收光譜和主要成分（苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、異甘草素、甘草素、甘草酸、橙皮苷），揭示隨提取時(shí)間和提取次數(shù)變化血府逐瘀湯提取液吸收光譜和主要成分含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為更加有效的利用血府逐瘀湯提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC system（美國(guó)沃特世公司），ME204型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Centrifuge 5430 R離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司），VARIAN Cary 50紫外分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥 甲醇（色譜純，Sigma Aldrich），乙腈（色譜純，Sigma Aldrich），甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制，Milli-Q超純水），甲醇（天津市康科德科技有限公司）；柴胡、當(dāng)歸、生地、赤芍、紅花、桔梗、炒桃仁、炒枳殼、甘草、川芎、牛膝均購(gòu)于河北美威藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)企業(yè)提供檢驗(yàn)報(bào)告均符合2015版中國(guó)藥典飲片質(zhì)量要求；對(duì)照品：苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、異甘草素、甘草素、甘草酸、橙皮苷均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。

2 水提液的制備

取當(dāng)歸 12．0 g，生地 12．0 g，柴胡 4．0 g，赤芍8．0 g，紅花 12．0 g，桔梗 6．0 g，炒桃仁 15．0 g，炒枳殼8．0 g，甘草 8．0 g，川芎 6．0 g，牛膝 12．0 g，精密稱定，置于2 L圓底燒瓶中，加入8倍量水；分別提取0．5、1、1．5、2、2．5 h，過(guò)濾，得不同提取時(shí)間血府逐瘀湯的水提液；分別提取 1、2、3 次，每次提取 2 h，過(guò)濾，得不同提取次數(shù)血府逐瘀湯的水提液。

不同提取時(shí)間及次數(shù)的樣品各平行制備3份，分別量取水提液體積。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 紫外分光光度法

3.1.1 檢測(cè)條件 檢測(cè)波長(zhǎng)：200～500 nm。

3.1.2 供試品溶液的制備方法 精密移取水提液1 mL，與1 mL甲醇混勻，12 000 r/min離心10 min，離心半徑8．9 cm，吸取上清液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻；精密移取1 mL，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。

3.2 超高效液相色譜法

3.2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm，美國(guó)Waters公司）；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0．3 mL/min；柱溫：50 ℃；流動(dòng)相：0．1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序如下：0～3 min，90%～17%B；3～13 min，17%～35%B；13～17 min，35%～43%B；17～19 min，43%～44%B；19～20 min，44%～50%B；20～23 min，50%～90%B；23～26 min，90%B；26～28 min，90%～10%B；28～32 min，10%B。

采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，同時(shí)采用波長(zhǎng)切換方法以最大吸收波長(zhǎng)分別檢測(cè)待測(cè)化合物，波長(zhǎng)切換條件如下：0～2．34 min，254 nm；2．35～3．89 min，211 nm；3．90～5．24 min，230 nm；5．25～6．47 min，323 nm；6．48 ～7．39 min，283 nm；7．40 ～16．74 min，283 nm；16．75～17．99 min，250 nm；18．00～20．00 min，254 nm[5]。

3.2.2對(duì)照品溶液的配制 稱取苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、異甘草素、甘草素、甘草酸、橙皮苷對(duì)照品，加入甲醇與二甲基亞砜（DMSO）（1∶1），制成濃度分別為 5．01、5．02、1．01、0．995、0．98、1．05、1．03、1．07、0．96 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液混合，制得混合對(duì)照品溶液，濃度分別為苦杏仁苷 0．351 mg/mL、芍藥苷 0．100 mg/mL、阿魏酸 0．010 mg/mL、柚皮苷 0．289 mg/mL、新橙皮苷 0．289 mg/mL、異甘草素 0．012 mg/mL、甘草素0．014mg/mL、甘草酸 0．171mg/mL、橙皮苷 0．038mg/mL。

3.2.3 供試品溶液的制備 精密移取水提液1 mL，置于2 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，12 000 r/min 離心 10 min，離心半徑 8．9 cm，取上清液，0．45 μm 濾膜過(guò)濾，即得。

4 結(jié)果與分析

4.1 紫外分光光度法研究不同提取時(shí)間和次數(shù)下血府逐瘀湯中化學(xué)成分量變規(guī)律 參照“2水提液的制備”“3．1紫外分光光度法”方法制備水提液樣品并檢測(cè)水提液的吸收曲線，不同提取時(shí)間和提取次數(shù)的血府逐瘀湯吸收曲線如圖1A、1C所示。為了消除血府逐瘀湯投料飲片質(zhì)量、水提液體積差異對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，將最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處的測(cè)定結(jié)果A值按公式（1）進(jìn)行處理。

上式中，A′代表水提液供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)處校正吸光度值，A代表水提液供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)處吸光度值，M代表血府逐瘀湯投料飲片的質(zhì)量，V代表水提液的體積。

以血府逐瘀湯提取時(shí)間2．5 h水提液供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處校正吸光度值為參照，以 A′t/A′2．5（t為提取時(shí)間）為縱坐標(biāo)，提取時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制不同提取時(shí)間血府逐瘀湯水提液供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處校正吸光度值變化趨勢(shì)圖，如圖1B所示。以血府逐瘀湯提取3次的水提液供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm 處校正吸光度值為參照，以 A′n/A′3（n 為提取次數(shù)）為縱坐標(biāo)，提取次數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制不同提取次數(shù)血府逐瘀湯水提液供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處校正吸光度值變化趨勢(shì)圖，如圖1D所示。

如圖 1B 所示，提取時(shí)間為 0．5～2．5 h 時(shí)，水提液供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處校正吸光度隨提取時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加并趨于穩(wěn)定，提示隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)水提液中化合物濃度趨于飽和。如圖1D所示，提取次數(shù)為1～3次時(shí)，水提液供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處校正吸光度隨次數(shù)增加而增大，但增長(zhǎng)的趨勢(shì)逐步減緩，提示隨著提取次數(shù)的增多藥渣留存的化合物逐步減少。

如圖1A和C所示，水提液在200～400 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的紫外吸收，最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm；黃酮化合物基本母核為2-苯基色原酮，都具有C6-C3-C6的結(jié)構(gòu)，因此，多數(shù)黃酮類化合物存在兩個(gè)特征吸收，即300～400 nm區(qū)間由桂皮?；到y(tǒng)電子躍遷引起的帶Ⅰ和240～285 nm區(qū)間由苯甲?；到y(tǒng)電子躍遷引起的帶Ⅱ，分子中取代基的類型、位置和數(shù)量影響吸收帶的峰位、強(qiáng)度和峰形[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，血府逐瘀湯水提液供試品溶液存在300～400 nm區(qū)間和240～285 nm區(qū)間的強(qiáng)紫外吸收，結(jié)合黃酮類化合物紫外吸收光譜特征及文獻(xiàn)報(bào)道，說(shuō)明血府逐瘀湯中含大量黃酮類化合物。

圖1 不同提取時(shí)間和提取次數(shù)血府逐瘀湯供試品溶液吸收曲線及最大吸收波長(zhǎng)（278±1）nm處校正吸光度變化趨勢(shì)圖（n=3）Fig.1 Absorption curve and trend of corrected absorbance at maximum absorption wavelength(278±1)nm for sample solution of Xuefu Zhuyu Decoction obtained by the different extraction time and extraction frequency（n=3）

4.2 超高效液相色譜法研究不同提取時(shí)間和次數(shù)下血府逐瘀湯中化學(xué)成分量變規(guī)律 參照“2水提液的制備”“3．2超高效液相色譜法”方法制備水提液樣品并檢測(cè)水提液中的苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、異甘草素、甘草素、甘草酸、橙皮苷，血府逐瘀湯水提液供試品溶液超高效液相色譜圖如圖2所示。

如圖2所示，血府逐瘀湯水提液檢測(cè)到苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸及少量橙皮苷，未檢測(cè)到甘草素、異甘草素。以“3．2．2”項(xiàng)下配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液為對(duì)照溶液，計(jì)算不同提取時(shí)間、提取次數(shù)血府逐瘀湯水提液中苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸的含量（為了便于比較，水提液中化合物的含量均以飲片計(jì)），根據(jù)公式（2）、（3）計(jì)算。

圖2 血府逐瘀湯供試品溶液（A）和混合對(duì)照品溶液（B）的超高效液相色譜圖（n=3）Fig.2 UPLC chromatograms of the sample solution of Xuefu Zhuyu Decoction(A)and mixed standard solution(B)（n=3）

上式中，A標(biāo)代表對(duì)照品的峰面積，A樣代表供試品溶液中相應(yīng)化合物的峰面積，C標(biāo)代表對(duì)照品濃度，C樣代表供試品溶液中相應(yīng)化合物的濃度，V代表供試品溶液的體積，V′代表水提液的體積，M代表血府逐瘀湯投料飲片的質(zhì)量，W代表從單位質(zhì)量飲片中提取的相應(yīng)化合物的量。

如圖 3 A 所示，提取時(shí)間為 0．5～2．5 h，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，飲片中被提出的化合物量逐步增加，其中，苦杏仁苷、柚皮苷、新橙皮苷等糖苷類成分增加明顯；阿魏酸基本保持穩(wěn)定，至提取時(shí)間為2 h時(shí)各化合物提出的量趨于穩(wěn)定。如圖3B所示，提取次數(shù)為1～3次時(shí)，隨著提取次數(shù)增加，飲片中被提出的化合物量越多，但增長(zhǎng)的趨勢(shì)逐步減緩，而阿魏酸基本保持穩(wěn)定，該研究結(jié)果與紫外分光光度法研究結(jié)果一致。

5 結(jié)論

本研究采用紫外分光光度法和超高效液相色譜法研究不同提取時(shí)間和不同提取次數(shù)血府逐瘀湯水提液中成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和提取次數(shù)的增加，飲片中被提出的化合物量逐漸增加，說(shuō)明提取時(shí)間和次數(shù)的增加有助于飲片中成分的提取，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)綜合考慮藥效、生產(chǎn)效率、成本等多方面因素確定提取次數(shù)和時(shí)間。

圖3 不同提取時(shí)間（A）和提取次數(shù)（B）血府逐瘀湯提取的指標(biāo)成分趨勢(shì)圖（n=3）Fig.3 Trend of the index components extracted in XuefuZhuyu Decoction obtained by the different extraction time(A)and extraction frequency(B)（n=3）