尿毒康通過抑制p38/ERK MAPK通路改善UUO大鼠腎小管細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化*

江茜 ，王宏 ，王蕾 ，康利 ，李燕林

（1．天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020；2．中山市中醫(yī)院，中山 528400）

近年來，慢性腎臟?。–KD）的發(fā)病率呈上升趨勢，CKD常合并貧血、骨代謝異常、心血管并發(fā)癥等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生理狀態(tài)和生活質(zhì)量，并增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。腎纖維化是CKD的主要病理改變，是由腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化之間的不平衡，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成過多引起[3]，包括腎小球硬化（GS）、腎間質(zhì)纖維化（TIF）和血管硬化。其典型病理表現(xiàn)為腎小球內(nèi)固有細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及間質(zhì)毛細(xì)血管喪失[4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一種胞漿內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在真核細(xì)胞中，由4條平行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組成，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK）通路、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶5（ERK5）/大絲裂原活化蛋白激酶1（BMK1）通路[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL2通過MEK/ERK/Nrf-1途徑調(diào)節(jié)自噬并影響糖尿病性腎病腎纖維化的進(jìn)展[6]。Roscovitine通過重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β1）/p38MAPK途徑減輕糖尿病小鼠的腎間質(zhì)纖維化[7]。

中醫(yī)中藥在預(yù)防和治療CKD中發(fā)揮日益重要的作用[8]。百日草（RDP）通過經(jīng)典和非經(jīng)典的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改善了單側(cè)輸尿管結(jié)扎法（UUO）誘導(dǎo)的腎纖維化[9]。清腎補(bǔ)陽方通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和Wnt/β-Catenin途徑減輕5/6腎切除大鼠的腎纖維化[10]。芪丹地黃湯通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）途徑減輕糖尿病腎纖維化[11]。腎康注射液可減輕阻塞性腎病中的腎小管間質(zhì)纖維化[12]。當(dāng)歸芍藥散通過調(diào)節(jié)缺氧和自噬減輕腎臟纖維化[13]。黃葵膠囊通過抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NLRP3）炎性小體和激活Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，減輕糖尿病腎病的腎小管EMT，抑制腎纖維化[14]。尿毒康是中山市中醫(yī)院自主研發(fā)的中藥制劑，從1992年開始即以湯劑在臨床中使用。該藥由大黃、丹參、黃芪、紅花、地榆等藥物組成，黃芪益氣健脾為方中主藥，配伍紅花、丹參活血化瘀，大黃瀉濁逐瘀以通腎絡(luò)，地榆涼血解毒，諸藥相合，扶正祛邪，攻補(bǔ)相宜。尿毒康針對慢性腎功能衰竭濕濁內(nèi)留，氣虛血瘀的本虛標(biāo)實(shí)之病機(jī)，具有祛濕濁，通腎絡(luò)，益氣健脾的功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尿毒康合劑能夠降低慢性腎功能衰竭大鼠的血清肌酐（SCr）和尿素氮含量，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善腎功能[15]。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尿毒康能降低患者SCr水平，改善腎功能，延緩終末期腎病發(fā)展[16-19]。尿毒康能增強(qiáng)機(jī)體的排毒能力，減輕腎損傷改善腎功能衰竭[18，20]。然而，尿毒康改善腎纖維化的具體機(jī)制至今沒有研究。因此，文章通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎法，構(gòu)建大鼠腎纖維化模型，考察尿毒康改善腎纖維化的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 UUO復(fù)制腎間質(zhì)纖維化模型 大鼠體質(zhì)量（208．60±6．05）g，45 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛后用碘酊-75%乙醇消毒手術(shù)區(qū)，行左側(cè)腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露并分離左側(cè)輸尿管，手術(shù)線結(jié)扎兩道，然后在兩道結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，逐層縫合。假手術(shù)組僅切開腹腔，游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷。

1.2 分組及給藥 將UUO大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥對照組（氯沙坦鉀片，30 mg/kg，10 mL/kg，相當(dāng)于臨床給藥劑量的6倍）、尿毒康20 mL/kg組、10 mL/kg組和5 mL/kg組（分別相當(dāng)于臨床給藥劑量的12倍、6倍和3倍）。手術(shù)第2天開始給藥。假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積純凈水，每日1次，連續(xù)21 d。各實(shí)驗(yàn)組大鼠10只。實(shí)驗(yàn)過程中模型組死亡大鼠2只，尿毒康高劑量死亡大鼠3只，低劑量死亡大鼠1只。假手術(shù)組、陽性藥對照組、尿毒康中劑量組未見死亡大鼠。

1.3 尿液和血清生化檢測 末次給藥后，收集大鼠24 h尿液，測定24 h尿蛋白。45 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，檢測SCr水平。

1.4 組織病理學(xué)觀察 取結(jié)扎側(cè)腎臟（左側(cè)），縱向剖開，10%中性甲醛固定，制成石蠟切片。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠腎組織的病理改變。Masson染色觀察纖維化程度。Masson染色后，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，按病變面積占該視野的百分比評(píng)分，無計(jì)0分、小于25%計(jì)1分、25%～50%計(jì)2分、大于50%計(jì)3分。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測TGF-β和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）mRNA表達(dá) 取腎臟組織剪碎后加入1 mL Trizon后反復(fù)吹打，使樣本充分裂解。加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置2min。4℃12000r/min離心15min，離心半徑8cm，取上層水相層。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min。4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀。4℃12 000 r/min離心5 min，離心半徑8 cm，棄上清，揮干。加入30 μL無RNase的水溶解。根據(jù)HiFiScript g DNA Removal cDNA Synthesis Kit（康為世紀(jì)，Cat：CW2582M）說明書配制反應(yīng)體系，42℃15 min，85℃5 min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù) UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康為世紀(jì)，Cat：CW2601M）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反應(yīng)：預(yù)變性95℃5 min，（變性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 1 min，延伸 72 ℃30 s）45 cycles，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。2-ΔΔCt計(jì)算 mRNA 的相對變化。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.6 Western Blot檢測p38，ERK蛋白的表達(dá) 取腎臟組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗凈，加入蛋白裂解液，充分裂解后，4℃12 000 r/min離心15 min，離心半徑8 cm，取上清液，蛋白定量，變性后進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后，甲醇活化PVDF膜，按濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序組裝；組裝完成后按PVDF膜在正極，凝膠在負(fù)極，置于轉(zhuǎn)膜槽中，200mA恒流轉(zhuǎn)2h。5%脫脂奶粉室溫閉1h。一抗p38（CST，1∶1 000），ERK（CST，1∶1 000），β-actin（CST，1∶1 000），4 ℃孵育過夜。1×TBST 洗3次，每次5min；二抗（HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體，1∶3 000），室溫2 h，洗膜，ECL成像系統(tǒng)發(fā)光顯影，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿毒康能改善UUO大鼠的腎功能 對各組大鼠24 h尿蛋白含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，UUO模型大鼠 24 h尿蛋白明顯升高（P＜0．01），見圖1A；與模型組相比，陽性藥對照組和尿毒康組較UUO模型大鼠 24 h 尿蛋白定量水平（P＜0．05 或 P＜0．01）明顯降低，其中尿毒康10 mL/kg組下降明顯。隨后，檢測了大鼠SCr的變化，發(fā)現(xiàn)模型組SCr水平明顯升高（P＜0．01），見圖 1B；與模型組相比，陽性對照組和尿毒康組SCr水平明顯降低（P＜0．01）。說明尿毒康能夠改善UUO大鼠的腎功能。見圖1。

2.2 尿毒康能明顯改善腎臟纖維化 大體觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組腎臟大小正常，表面光滑，切面見腎實(shí)質(zhì)厚度正常，皮髓質(zhì)分界清晰，未見腎盂、腎盞擴(kuò)張；模型組腎臟體積增大，成囊狀，腎切面可見實(shí)質(zhì)菲薄，皮、髓質(zhì)分界不清，腎盂和腎盞高度擴(kuò)張、變形。尿毒康各劑量組和陽性藥對照組腎臟體積增大較模型組小，腎盂和腎盞高度擴(kuò)張、變形程度輕。腎組織HE染色發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組腎小球體積未見縮小或肥大，數(shù)目未見減少，腎小管上皮細(xì)胞未見變性、壞死或脫落，管腔中未見管型及結(jié)石，腎間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生；模型組腎小管廣泛萎縮及代償擴(kuò)張，部分區(qū)域可見腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞明顯減少，多數(shù)腎小囊增寬，并出現(xiàn)部分腎小球的崩解，大多數(shù)腎小管萎縮，上皮細(xì)胞變性壞死，局部管腔擴(kuò)張明顯，髓質(zhì)區(qū)失去放線結(jié)構(gòu)，伴有大量炎細(xì)胞浸潤。尿毒康各劑量組和陽性藥對照組病理表現(xiàn)較模型組腎小球形態(tài)、腎小管形態(tài)、腎間質(zhì)、炎細(xì)胞浸潤方面有所改善。其中尿毒康10 mL/kg組在間質(zhì)纖維化程度方面改善相對明顯。見圖2A。

Masson染色發(fā)現(xiàn)：模型組腎間質(zhì)增寬、間質(zhì)成纖維細(xì)胞大量增生，膠原纖維形成。半定量分析顯示模型組腎間質(zhì)纖維化程度明顯高于假手術(shù)組（P＜0．01）；尿毒康10mL/kg組能夠明顯減輕UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化程度（P＜0．01）。見圖 2B 和 2C。

隨后，qRT-PCR檢測了纖維化關(guān)鍵因子TGF-β和α-SMA的mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UUO模型大鼠TGF-β，α-SMA mRNA表達(dá)增加，而尿毒康組較UUO模型組TGF-β，α-SMA mRNA表達(dá)表達(dá)下降。以上結(jié)果表明尿毒康能夠明顯改善腎纖維化，且尿毒康10 mL/kg作用最明顯。見圖2D。

2.3 尿毒康抑制p38/ERK MAPK通路改善腎纖維化 為了進(jìn)一步研究尿毒康改善腎纖維化的機(jī)制，檢查了MAPK通路關(guān)鍵蛋白p38，ERK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UUO模型大鼠p38，ERK的表達(dá)增加，而尿毒康組較模型組p38，ERK表達(dá)下降。說明尿毒康改善腎纖維化可能與抑制了p38/ERK MAPK通路有關(guān)。見圖3。

3 討論

圖1 尿毒康對UUO大鼠腎功能的影響Fig.1 Effect of Niaodukang on renal function of UUO rats

圖2 尿毒康對UUO大鼠腎臟纖維化的影響Fig.2 Effect of Niaodukang on renal fibrosis significantly of UUO rats

圖3 尿毒康對MAPK通路的影響Fig.3 Effect of Niaodukang on MAPK pathway

中醫(yī)學(xué)中沒有腎纖維化的病名，但從腎纖維化形成的病理基礎(chǔ)來看，其與血瘀證密切相關(guān)，具體為臟腑功能虛損，脾腎虛為主，兼有濁毒內(nèi)阻，病情逐步發(fā)展而加重，最后導(dǎo)致正氣虛衰，濁邪阻滯。研究發(fā)現(xiàn)，清腎補(bǔ)陽方[10]、芪丹地黃湯[11]、當(dāng)歸芍藥散[13]等在防治腎纖維化方面具有顯著的效果，顯示了中醫(yī)藥在治療腎纖維化應(yīng)用中的良好前景。尿毒康由大黃、何首烏、女貞子、黃芩等藥組成，具有益氣溫陽，健脾益腎，活血瀉濁的功能，切中慢性腎功能衰竭脾腎氣（陽）虛為本，濕濁瘀血為標(biāo)的病機(jī)。大黃具有瀉濕濁、逐瘀血、蕩滌胃腸、清熱解毒之功效，此外，大黃還具有抗菌，抗凝，降血黏，改善氨基酸、脂質(zhì)代謝，抑制腎小球系膜細(xì)胞等作用，故大黃長期以來用于慢性腎功能衰竭的治療。丹參中的成分Magnesium Lithospermate B能提高腎組織活性氧清除酶活性，抑制過氧化脂質(zhì)丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，從而改善腎小球?yàn)V過、腎小管重吸收功能。丹酚酸A通過抑制NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路來減輕5/6腎切除大鼠的腎臟損傷和炎癥[21]。丹參和紅花協(xié)同活瘀血、通腎絡(luò)，增加尿量，加速毒素從尿中排泄。黃芪具有健脾益氣，擴(kuò)張血管，改善腎血流，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用。諸藥合用，具有化瘀解毒、利濕瀉濁、健脾益氣功效。本實(shí)驗(yàn)首先通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎，成功復(fù)制了大鼠腎纖維化模型，通過灌胃給與不同濃度的尿毒康，證實(shí)了臨床等效劑量的尿毒康能夠明顯改善UUO大鼠的腎小管細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在進(jìn)一步的機(jī)制探討中發(fā)現(xiàn)，尿毒康能夠降低TGF-β的表達(dá)，TGF-β為腎纖維化進(jìn)展的重要因子。已有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β上調(diào)ERK途徑，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞膠原沉積和腎纖維化[22]。于是通過Western Blot檢測了p38與ERK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組p38與ERK表達(dá)增加，尿毒康組p38與ERK表達(dá)下降。p38與ERK是MAPK通路的關(guān)鍵蛋白，p38 MAPK通路為控制炎性反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一，可被TGF-β激活，參與應(yīng)激條件下的細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及炎性反應(yīng)過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予尿毒康后，p38與ERK表達(dá)降低，MAPK通路抑制，因此，尿毒康能夠通過抑制p38/ERK MAPK通路改善腎小管細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腎纖維化。但是尿毒康能否改善其他臟器的纖維化，擴(kuò)大尿毒康的臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步的研究。