楊樹(shù)葉片結(jié)構(gòu)與抗銹菌侵染的相關(guān)性*

沈闊程 陳倩文 齊 梅 彭子嘉 樊軍鋒 余仲東

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌712100； 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所 北京100093)

楊樹(shù)(Populus) 是重要的速生造林樹(shù)種，廣泛用于風(fēng)沙治理、防止水土流失、涵養(yǎng)水源等方面。同時(shí)楊樹(shù)也是現(xiàn)代生物質(zhì)能源的重要樹(shù)種之一，用于能源化工、木材制漿業(yè)(Boyleetal., 2010; Xiaetal., 2017)。松楊柵銹菌(Melampsoralarici-populina)所引起的楊樹(shù)葉銹病嚴(yán)重影響著楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致楊樹(shù)過(guò)早落葉并延遲翌年的萌發(fā)，縮短楊樹(shù)生長(zhǎng)周期導(dǎo)致楊樹(shù)后期木材生長(zhǎng)不足和木質(zhì)化不良，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Freyetal., 1997)。楊樹(shù)銹病可嚴(yán)重阻礙楊樹(shù)的生長(zhǎng)，其中根冠降低可達(dá)17%～46%，葉干質(zhì)量降低21%～66%，直徑生長(zhǎng)降低1%～35%(Stochlovaetal., 2016)。此外，葉銹病還會(huì)破壞楊樹(shù)自身防御系統(tǒng)，使其遭受蟲(chóng)害、凍害、根部或干部病害等災(zāi)害。葉銹病的發(fā)生嚴(yán)重影響楊樹(shù)的健康生長(zhǎng)，已成為制約楊樹(shù)人工林產(chǎn)業(yè)的重大問(wèn)題(Barresetal., 2008; Wanetal., 2013; Persoonsetal., 2014)。

松楊柵銹菌是典型的長(zhǎng)史型銹菌，生活史包括5個(gè)孢子堆階段(Wanetal., 2015; Ullahetal., 2017)。其中，夏孢子階段對(duì)楊樹(shù)具有反復(fù)侵染的特點(diǎn)，危害性最強(qiáng)。循環(huán)侵染中夏孢子萌發(fā)長(zhǎng)出芽管，芽管在葉表蠟質(zhì)層上匍匐生長(zhǎng)并通過(guò)氣孔侵入到葉片，分化形成侵染絲侵入氣孔下囊。侵染絲在葉肉組織內(nèi)進(jìn)一步分化形成初生菌絲。初生菌絲細(xì)胞表面具有可識(shí)別楊樹(shù)葉肉細(xì)胞信號(hào)的功能，導(dǎo)致菌絲與葉肉細(xì)胞相互作用，形成吸器母細(xì)胞，并最終發(fā)育成吸器，建立活體專性寄生關(guān)系(Finketal., 1991； Allenetal., 1991)。目前，針對(duì)松楊柵銹菌的研究大多集中在寄主楊樹(shù)的防御信號(hào)的傳導(dǎo)、細(xì)胞壁的強(qiáng)化、局部細(xì)胞的死亡程序、R、Mer、Rus楊樹(shù)抗病基因功能驗(yàn)證(Dowkiwetal., 2004)等方面。但大量研究表明，楊樹(shù)固有的結(jié)構(gòu)特征對(duì)抵抗其入侵也同樣具有重要作用，可視為林木在抗銹病侵染中的第一道防線。田呈明等(2001； 2002)研究發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)葉片氣孔的大小及密度等葉表特征會(huì)影響寄主對(duì)葉銹病的抗性； Pambou等(2018)認(rèn)為，楊樹(shù)葉片蠟質(zhì)的形態(tài)、硬度、疏水性等物理性質(zhì)對(duì)松楊柵銹菌侵染具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)調(diào)查29種無(wú)性系楊樹(shù)抗銹病的差異，并進(jìn)一步采用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡，觀察并分析了葉片物理結(jié)構(gòu)與抗銹性的相關(guān)性，為楊樹(shù)抗銹病品種的快速篩選提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料包括29種楊樹(shù)無(wú)性系，其中卜氏楊(Populuspurdomii)、川楊(P.szechuanica)、青楊(P.cathayana)、小葉楊(P.simonii)4種楊樹(shù)來(lái)自秦嶺火地塘試驗(yàn)基地，其余楊樹(shù)無(wú)性系來(lái)自陜西渭河教學(xué)試驗(yàn)站的半同胞家系(藕丹等， 2017)。

1.2 試驗(yàn)方法

2018年9月21日對(duì)采自西北農(nóng)林科技大學(xué)秦嶺火地塘試驗(yàn)基地的卜氏楊、青楊、小葉楊、川楊無(wú)性系進(jìn)行松楊柵銹菌發(fā)病情況調(diào)查及葉片采集； 2018年9月25日對(duì)西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河試驗(yàn)站的25種楊樹(shù)無(wú)性系進(jìn)行調(diào)查及葉片采集。

1.2.1 葉片表面夏孢子堆密度 參考沈闊程(2019)方法，以單位面積葉片上夏孢子堆數(shù)目為單位，評(píng)估楊樹(shù)感病程度。

1.2.2 葉片縱切面相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 參照Yi等(2010)、沈闊程(2019)制作楊樹(shù)葉片超薄切片，利用透射電鏡下測(cè)定下表皮細(xì)胞厚度、上表皮細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片的總厚度、柵欄組織與海綿組織中細(xì)胞密度。

1.2.3 蠟質(zhì)厚度及下表皮細(xì)胞壁厚度測(cè)定 參照Wan等(2015)方法制作超薄切片，在透射電鏡下測(cè)定蠟質(zhì)厚度與下表皮細(xì)胞壁厚度。

1.2.4 活性氧(H2O2)測(cè)定 用二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Amresco)對(duì) H2O2的產(chǎn)生位點(diǎn)進(jìn)行染色，定位在顯微鏡下觀察侵染位點(diǎn)處H2O2情況(Thordal-Christensenetal., 1997； 王晨芳， 2008)。

1.2.5 葉片表面結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 使用干燥法制備樣品(Zhangetal., 2005； Jetteretal., 2016)，在掃描電鏡下測(cè)算相鄰氣孔間距離、閉合氣孔長(zhǎng)度、葉片表面蠟質(zhì)粗糙度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS22.0進(jìn)行楊樹(shù)上夏孢子堆密度的Euclidean聚類，運(yùn)用GraphPad Prism 8.0繪制楊樹(shù)葉片各指標(biāo)Violin圖，分析其分布。運(yùn)用GraphPad Prism 8.0繪制指標(biāo)間的相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)葉表夏孢子堆密度在無(wú)性系間差異性

通過(guò)不同無(wú)性系楊樹(shù)葉片間的夏孢子堆密度Euclidean距離進(jìn)行聚類(圖1)。其中毛白楊(P.tomentosa)、銀白楊(P.alba)聚為一類，其感病程度為0，無(wú)夏孢子堆產(chǎn)生，為非寄主組(Group1)； 69楊(P.deltoidescv. I-69； ♀)與青楊(♂)的雜種一代(F1)、青楊、卜氏楊、小葉楊歸為一類，其夏孢子堆密度最大感病程度最為嚴(yán)重，為易感病組(Group2)； 剩余14種無(wú)性系楊樹(shù)感病程度居中單獨(dú)聚為一類，主要包括69楊、歐美楊(P. ×euramericana)、69楊(♀)與歐美楊(♂)雜種一代(F1)、紅葉楊(P.deltoidescv. Zhonghuahongye)等，為抗病寄主組(Group3)。根據(jù)各無(wú)性系楊樹(shù)的遺傳背景及分派標(biāo)準(zhǔn)，白楊派(Sect.Leuces)楊樹(shù)為松楊柵銹菌的一種非寄主，單獨(dú)分支； 青楊派(Sect.Tacamahaca)為松楊柵銹菌的易感病寄主，黑楊派(Sect.Aigeiros)為該銹菌較強(qiáng)抗性寄主。此外，69楊與青楊的雜種一代(F1)抗銹病能力接近青楊派楊樹(shù)為易感病寄主，69楊與歐美楊雜種一代(F1)抗銹病能力接近于歐美楊的抗性，雜交楊樹(shù)品種抗銹性受父本的抗銹性影響大。

圖1 不同無(wú)性系楊樹(shù)松楊柵銹菌夏孢子堆密度系譜Fig.1 Cluster map based on uredinial density in different poplar clones69青、69歐分別表示母本♀為69楊，父本♂為青楊和歐美楊的雜種一代(F1)； 其中，父本♂花粉分別是2008年采自秦嶺東部、中部、西部的混合花粉，并由 1、2、3表示。Both P. deltoides cv. I-69× P. cathayana and P. deltoides cv. I-69× P. ×euramericana mean P. deltoides cv. I-69 is maternal, P. cathayana and P. ×euramericana are paternal; the pollen of P. cathayana and P. ×euramericana was collected in 2008 from the eastern, central and western Qinling Mountains, and marked as 1,2,3, respectively.

2.2 楊樹(shù)葉片組織結(jié)構(gòu)差異性分析

下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度、蠟質(zhì)粗糙度、閉合氣孔長(zhǎng)度在2.1所分的3類不同感病程度楊樹(shù)群體間均具有顯著的差異(圖2)，其中青楊派易感病組(Group3)的蠟質(zhì)厚度及下表皮細(xì)胞壁厚度最小，白楊派非寄主楊樹(shù)(Group1)的最大，黑楊派抗病寄主組(Group2)居中。在寄主楊樹(shù)中，青楊派易感病組(Group3)的上表皮細(xì)胞厚度顯著小于黑楊派抗病組(Group2)； 寄主楊樹(shù)(Group2、Group3)中，葉片總厚度、下表皮細(xì)胞厚度、海綿組織厚度指標(biāo)顯著大于白楊派非寄主楊樹(shù)(Group1)； 寄主楊樹(shù)(Group2、Group3)的柵欄組織厚度、相鄰氣孔間距離及海綿組織細(xì)胞密度指標(biāo)則顯著小于白楊派非寄主楊樹(shù)(Group 1)。在楊樹(shù)的感病程度分類中，除川楊被歸為抗性寄主外，各無(wú)性系楊樹(shù)葉片結(jié)構(gòu)均與其派別分類和抗性基本相符(圖1)。葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)在3組不同感病楊樹(shù)群體之間具有較大的離差，其主要原因是根據(jù)感病程度所分的組中包含有眾多無(wú)性系，不同無(wú)性系間也具有一定的差異。

圖2 楊樹(shù)無(wú)性系葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的小提琴圖及差異Fig.2 Violin plot of histological index of poplar leaf

綜合不同基因背景楊樹(shù)(所有試驗(yàn)楊樹(shù))葉片結(jié)構(gòu)與感染葉銹病的相關(guān)性分析表明： 下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與葉表夏孢子堆密度具顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.747，-0.473，圖3)。閉合氣孔長(zhǎng)度、柵欄組織厚度、海綿組織細(xì)胞密度、下表皮厚度與葉表孢子堆密度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.577，0.757，0.569，0.720)。69楊與歐美楊雜種F1代半同胞家系中，蠟質(zhì)厚度、下表皮細(xì)胞壁厚度與相鄰氣孔間距離具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.431，-0.586)； 海綿組織厚度與葉表夏孢子堆密度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.197)。69楊與青楊的雜種一代(F1)半同胞家系中，下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與葉表夏孢子堆密度也顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.665，-0.245)； 海綿組織細(xì)胞密度、相鄰氣孔間距離與葉表夏孢子堆密度顯著的正相關(guān)(r=0.182，0.374)。因此，下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度在所有試驗(yàn)楊樹(shù)中均與葉表夏孢子堆密度具有顯著的負(fù)相關(guān)性(圖3)，這表明下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與楊樹(shù)抗銹病能力具有一個(gè)穩(wěn)定的正相關(guān)關(guān)系。

在銹菌侵染的過(guò)程中，松楊柵銹菌芽管可以通過(guò)氣孔和已破損的蠟質(zhì)層直接穿透侵入葉片內(nèi)部(圖4A)。此外銹菌芽管在葉表生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)蠟質(zhì)層具有一定的溶解作用從而直接穿透蠟質(zhì)保護(hù)層，所以蠟質(zhì)層的厚度也直接決定著芽管穿透蠟質(zhì)而侵入的難易程度(圖4B)。通過(guò)DAB-HCl染色觀察到楊樹(shù)葉肉細(xì)胞受到銹菌感染時(shí)在細(xì)胞壁周圍會(huì)積累大量的H2O2，抵御銹菌的入侵(圖5)。楊樹(shù)下表皮細(xì)胞壁不僅物理防御對(duì)銹菌的侵染還通過(guò)調(diào)節(jié)植物的生理生化反應(yīng)對(duì)銹菌同樣具有重要的防御作用。下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與抗銹性具有正相關(guān)關(guān)系。以卜氏楊、毛白楊、69楊為代表，透射電鏡顯示(圖6)： 易感病寄主卜氏楊下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度，非寄主毛白楊最大，抗病寄主69楊居中，與下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與抗銹性具有正相關(guān)關(guān)系的結(jié)論相符，進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論的普遍性。

圖3 楊樹(shù)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)與感染松楊柵銹菌產(chǎn)生夏孢子堆密度的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis between leaf structure and uredinial density on poplarsA. 29種供試楊樹(shù) 29 clones of tested poplar; B. 69楊×歐美楊半同胞家系 Half-sib families of P.deltoides cv. I-69 and P. × euramericana; C. 69楊×青楊半同胞家系 Half-sib families of P. deltoides cv. I-69 and P. cathayana.

圖4 松楊柵銹菌通過(guò)氣孔和穿透蠟質(zhì)層進(jìn)入葉片內(nèi)部侵染69楊Fig.4 The infection process of the germ tube via stomata or cuticle on the leaf surface of P. deltoides cv. I-69紅色箭頭代表通過(guò)氣孔侵染楊樹(shù)葉片； 藍(lán)色箭頭代表通過(guò)破損的蠟質(zhì)層或者溶解蠟質(zhì)層而侵入楊樹(shù)到楊樹(shù)內(nèi)部。 Red arrow indicated the germ tubes penetrated by stomata and the blue arrow indicated the germ tube penetrating the cuticle directly or germ tubes merging with each other.

圖5 松楊柵銹菌侵染過(guò)程中楊樹(shù)葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁周圍積累大量H2O2Fig.5 Accumulation of a large amount of H2O2 around the cell wall of poplar leaf cells during the infection of Melampsora larici-populina

圖6 卜氏楊(A)、69楊(B)、毛白楊(C)葉片蠟質(zhì)及下表皮細(xì)胞壁厚度(背面)Fig.6 The thickness of cuticle and lower epidermal cell walls (hypophyllous) of P. purdomii(A), P. deltoides cv. I-69(B) and P. tomentosa(C)

3 討論

松楊柵銹菌嚴(yán)重影響楊樹(shù)的生長(zhǎng)，已逐漸成為阻礙楊樹(shù)人工林產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素(Wanetal., 2013)，利用雜種優(yōu)勢(shì)篩選抗銹性楊樹(shù)品種是生產(chǎn)中通用做法。本研究通過(guò)對(duì)29種楊樹(shù)無(wú)性系發(fā)病情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雜交種的抗銹性主要來(lái)自其父本的抗性差異，且不同派別楊樹(shù)及其雜交楊無(wú)性系對(duì)松楊柵銹菌抗性具有顯著的不同，其中青楊派楊樹(shù)及其雜交品種為易感病寄主，黑楊派楊樹(shù)具有較強(qiáng)抗銹性，白楊派楊樹(shù)為松楊柵銹菌的非寄主。Stochlova等(2016)與Pinon等 (2006)報(bào)道的黑楊派與青楊派雜種葉表疏水性較低，更貼近于青楊派樹(shù)種，致使葉表濕度顯著提高有利于銹菌夏孢子的萌發(fā)與侵入。黑楊派與青楊派雜種在不斷的與黑楊派楊樹(shù)回交過(guò)程中，其抗銹病能力與葉表濕度均顯著提高，從而使雜交種在抗銹性上更接近黑楊派樹(shù)種。本研究也發(fā)現(xiàn)黑楊派69楊與青楊派青楊的雜種一代表現(xiàn)有較強(qiáng)的感病能力。在葉片組織結(jié)構(gòu)差異性分析中，寄主楊樹(shù)下表皮厚度、海綿組織厚度、葉片總厚度均顯著大于非寄主楊樹(shù)。銹菌在葉表萌發(fā)后，芽管通過(guò)氣孔或者直接穿透方式侵入到葉片內(nèi)部，主要在下表皮細(xì)胞和海綿組織細(xì)胞中形成吸器吸取營(yíng)養(yǎng)。在同種楊樹(shù)上，葉片海綿組織厚度較厚者可提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分，致使產(chǎn)孢量增加，發(fā)病加重(康振生等,1993; 唐志鵬,2006; 李琴, 2010; Yuetal.,2011; 田呈明等,2001)。銹菌在非寄主植物上不能成功建立寄生關(guān)系并形成吸器，故寄主楊樹(shù)與非寄主楊樹(shù)抗銹病能力差異并不是下表皮厚度、海綿組織厚度、葉片總厚度間的差異所致(Newcombe,2005; Bettgenhaeuseretal.,2014; Wanetal., 2015)。

在葉片結(jié)構(gòu)與抗銹病的相關(guān)分析中，不同基因背景楊樹(shù)中有6個(gè)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)與抗病性具有顯著的相關(guān)性。而在基因背景相近的69楊與歐美楊雜種一代半同胞家系中有3個(gè)結(jié)構(gòu)指標(biāo)與抗銹病具有相關(guān)性，69楊與青楊雜種一代半同胞家系中有4個(gè)結(jié)構(gòu)指標(biāo)與抗銹病相關(guān)，但共性指標(biāo)僅有蠟質(zhì)厚度和下表皮細(xì)胞壁厚度，其他非共性指標(biāo)可能來(lái)自不同楊樹(shù)間的固有差異但與抗銹病并無(wú)穩(wěn)定的相關(guān)性。楊樹(shù)葉片氣孔密度和大小間的差異與銹菌侵染是否具有相關(guān)關(guān)系一直存在著爭(zhēng)議。有研究者認(rèn)為，銹菌主要通過(guò)氣孔侵入到葉片內(nèi)部，較大的氣孔密度與較大的氣孔結(jié)構(gòu)可以增加病原菌侵入到葉片內(nèi)部的機(jī)會(huì)，同時(shí)也可提高葉片蒸騰速率，加大葉表濕度，促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)(Russinetal., 1997; Heath, 2002; Nicolasetal., 2018)。另一些研究認(rèn)為芽管通過(guò)氣孔入侵是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，未發(fā)現(xiàn)芽管對(duì)氣孔的趨向性； 并且氣孔直徑一般為20 μm左右遠(yuǎn)大于芽管的直徑(2～6 μm)，均可以保證芽管的順利侵入(Hochetal., 1987; Haworthetal., 2018; Yangetal., 2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，除69楊與青楊的雜種一代(F1)外，葉片氣孔密度和大小與抗銹病能力并不具備穩(wěn)定可靠的相關(guān)性，但在所有試驗(yàn)楊樹(shù)中葉片下表皮細(xì)胞壁厚度及葉表蠟質(zhì)厚度與抗銹性間均顯示穩(wěn)定可靠的正相關(guān)性，可在生產(chǎn)實(shí)踐中用做快速篩選抗銹病楊樹(shù)的指標(biāo)。芽管還可以通過(guò)直接穿透蠟質(zhì)方式侵入葉肉組織，而蠟質(zhì)作為抵御侵染的第一道防線，其厚度的增加可直接增強(qiáng)葉表蠟質(zhì)硬度，使葉片抵御芽管侵入(Yuetal., 2011; Wanetal., 2015)。蠟質(zhì)除可作為物理屏障也是一種復(fù)雜的化合物，其化學(xué)組成成分在抑制病原菌侵染方面也具有重要的影響，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)蠟質(zhì)對(duì)灰霉病(Botrytiscinerea)和葡萄(Vitisvinifera)藤蠟質(zhì)對(duì)白粉病都具良好的防御效果(Bessireetal., 2007; ?zeretal., 2017)； 玉米(Zeamays)粒的果皮蠟質(zhì)具有抑制黃曲霉菌(Aspergillusflavus)生長(zhǎng)的作用(Gembehetal., 2001)。但楊樹(shù)葉片蠟質(zhì)抵御松楊柵銹菌侵染的作用機(jī)制目前仍不清楚，并且研究發(fā)現(xiàn)在銹菌的吸器母細(xì)胞形成過(guò)程中，表皮細(xì)胞壁會(huì)積累大量超氧自由基、過(guò)氧化氫、苯酚及三萜等抑菌物質(zhì)(Heath, 2000； 2002)，因此，蠟質(zhì)厚度與抑菌物積累在楊樹(shù)抗銹性調(diào)控作用中的地位和關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)29種不同楊樹(shù)無(wú)性系對(duì)松楊柵銹菌的感病程度調(diào)查分析得到： 青楊派楊樹(shù)為易感病寄主，黑楊派楊樹(shù)雖也為松楊柵銹菌寄主但具有較強(qiáng)抗性，白楊派楊樹(shù)不受松楊柵銹菌的侵染為非寄主類； 69楊與青楊的雜種一代(F1)半同胞家系楊樹(shù)感病性與青楊相似，69楊與歐美楊雜種一代(F1)半同胞家系感病程度與歐美楊相似，說(shuō)明雜交楊樹(shù)抗銹病能力受父本影響更為顯著。楊樹(shù)葉片結(jié)構(gòu)差異性分析中，寄主楊樹(shù)海綿組織細(xì)胞密度、相鄰氣孔距離及柵欄組織厚度則顯著小于非寄主楊樹(shù)； 而下表皮厚度、葉片總厚度、海綿組織厚度顯著大于非寄主楊樹(shù)。在寄主楊樹(shù)中易感病組上表皮厚度顯著小于抗病組。在所有試驗(yàn)楊樹(shù)綜合分析中發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)下表皮細(xì)胞壁厚度及葉表蠟質(zhì)厚度與楊樹(shù)抗銹病性具有一個(gè)穩(wěn)定可靠的正相關(guān)性，因此在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中可通過(guò)這2個(gè)形態(tài)指標(biāo)快速篩選抗銹病楊樹(shù)。