miR-221/ 222 靶向抑制對三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞順鉑敏感性的影響

葉惠榮 袁惠玲 曹 茵 王西躍 吳麗華 陳桂林 陳麗娟 張玉娟

廣東省東莞市人民醫(yī)院乳腺科，廣東東莞 523000

微RNA（miR）-221/222 定位于人染色體Xp11.3[1]，兩者核心種子序列（68～72）完全同源，同時抑制miR-221/222 可抑制乳腺癌[2-3]、膠質(zhì)瘤[4-5]等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究顯示[6]，耐藥乳腺癌組織中miR-221/222 表達(dá)上調(diào)，但抑制miR-221/222 是否可增加三陰性乳腺癌（TNBC）的鉑類藥物敏感性目前較少見報道。鑒于此，本研究觀察了抑制miR-221/222 對TNBC MDA-MB-231 細(xì)胞順鉑（DDP）敏感性的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

細(xì)胞株：TNBC MDA-MB-231 細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心（ATCC）細(xì)胞庫，編號：TCHU202，第2 代細(xì)胞。

試劑：miR-221 抑制劑、miR-222 抑制劑和miR-221/222 抑制劑（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，貨號：B05001）；MTT 檢測試劑盒（美國Trevigen 公司，貨號：4890-25-01）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號：MA0220）；Caspase-9、Bax、Bcl-2 一抗（美國Imgenex 公司，IMG-5709）。

儀器：GENios 多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；7900HT 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI 公司）；E10001 電泳槽（美國Invitrogen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細(xì)胞，將其隨機(jī)分為對照組、miR-221 抑制組、miR-222 抑制組和miR-221/222 抑制組，分別轉(zhuǎn)染空白試劑、miR-221 抑制劑、miR-222 抑制劑和miR-221/222 抑制劑，轉(zhuǎn)染后均給予DDP 5 μg/mL 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[7]。

1.2.2 熒光定量PCR 檢測miR-221/222 mRNA 相對表達(dá)量 轉(zhuǎn)染后24 h 時用Trizol 提取各組細(xì)胞的總RNA，采用熒光定量PCR 法檢測各組MDA-MB-231細(xì)胞中miR-221/222 mRNA 的相對表達(dá)量，miR-221上 游：3’-ACACTCCAGCTGGGACCTTGGCATACA -ATGT-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCT-5’；miR-222 上游：3’-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTA-5’，下游：3’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCAG-5’；以U6 為內(nèi)參（上游：3’-CTCGCTTCGGCAGCACA-5’，下游：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作均按照Takara036A（mRNA）/037A（micro RNA）公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）5.0 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.2 μL，DNA 模板（上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）1.0 μL，dH2O 2.8 μL，Total 10.0 μL，反應(yīng)體系20.0 μL，擴(kuò)增條件37℃15 min，85℃5 s，4℃1 min，共40 個循環(huán)，反應(yīng)終止后，將樣本取出，-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采?-ΔΔCt法分析計算[8]。

1.2.3 MTT 法檢測細(xì)增殖抑制率 轉(zhuǎn)染后24、48 h 時取各組細(xì)胞，采用MTT 法檢測各組細(xì)胞吸光度（OD490）值，將孔板進(jìn)行染色，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），常規(guī)培養(yǎng)4 h 棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO 溶解，搖床10 min 混勻，490 nm 波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔的OD 值，實驗重復(fù)3 次，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=（1-處理組A/對照組A）×100%[9]。

1.2.4 Annexin V-FTTC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染后24、48 h 時取各組生長狀態(tài)良好、密度在85%以上、貼壁完好的細(xì)胞，常規(guī)6 孔板接種，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌，0.25%胰酶消化細(xì)胞后加完全培養(yǎng)基，離心棄上清，PBS 重懸計數(shù)，離心棄上清，加Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入V-FTTC 5 μL、PI 10 μL 避光5 min 以上后，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測[10]。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢查凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后48 h 時取各組細(xì)胞，裂解后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平：PBS清洗細(xì)胞，加RI-PA 進(jìn)行裂解，蛋白電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜，加Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌后孵育二抗，隨后化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。以GAPDH 為內(nèi)參，計算相對表達(dá)量[11]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-221/222 mRNA 相對表達(dá)量比較

各組間miR-221、miR-222 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；進(jìn)一步兩兩分析顯示，miR-221 抑制組miR-221 mRNA 表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；miR-222 抑制組miR-221 mRNA 表達(dá)水平高于miR-221 抑制組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；miR-221/222 抑制組miR-221 mRNA 表達(dá)水平低于miR-222 抑制組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。miR-221 抑制組與對照組miR-222 mRNA 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；miR-222 抑制組和miR-221/222 抑制組miR-222 mRNA 表達(dá)水平低于miR-221 抑制組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 各組miR-221/222 mRNA 相對表達(dá)量比較（，n=6）

表1 各組miR-221/222 mRNA 相對表達(dá)量比較（，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

2.2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

各組轉(zhuǎn)染后24、48 h 的細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-221 抑制組與對照組轉(zhuǎn)染后24、48 h 的細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞增殖抑制率高于其余三組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較（%，，n=6）

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較（%，，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較

各組轉(zhuǎn)染后24、48 h 的細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）；miR-221 抑制組與對照組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞凋亡率高于其余三組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表3。

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)染后48 h，各組間Caspase-9、Bcl-2 和Bax 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，miR-221 抑制組與對照組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉(zhuǎn)染后48 h 的細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉(zhuǎn)染后48 h 的Caspase-9 和Bax 水平高于其余三組，Bcl-2水平低于其余三組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表4、圖1。

表3 各組細(xì)胞凋亡情況比較（%，，n=6）

表3 各組細(xì)胞凋亡情況比較（%，，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

表4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較（，n=6）

表4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較（，n=6）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與miR-221 抑制組比較，#P ＜0.05；與miR-222 抑制組比較，ΔP ＜0.05

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢查凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平

3 討論

乳腺癌是導(dǎo)致全球女性癌癥相關(guān)死亡的重要因素，雖然手術(shù)為主的綜合治療方式取得了進(jìn)展，患者5 年和10 年生存率不斷提高，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是影響乳腺癌患者10 年生存率不高的重大挑戰(zhàn)，癌細(xì)胞對化療的耐藥性是導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因之一。TNBC 是雌激素受體（ER）陰性、孕激素受體陰性和人類表皮生長因子受體2 陰性為免疫組化特征的乳腺癌亞型，占乳腺癌總數(shù)的10%～20%。與其他亞型比較，TNBC 惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后較差，因為缺乏激素治療的典型靶向受體，鉑類藥物是治療TNBC 的常用化療藥物。DDP 是治療TNBC 的常用化療藥物，DDP 耐藥是導(dǎo)致TNBC 化療失敗的重要因素[12-15]。DDP 誘發(fā)腫瘤細(xì)胞DNA 損傷和細(xì)胞凋亡的同時，能激活DNA 修復(fù)系統(tǒng)，誘導(dǎo)核苷酸的切除修復(fù)和同源重組，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對DDP 產(chǎn)生耐藥性，降低DNA 修復(fù)能力可增加腫瘤細(xì)胞的DDP 敏感性[16-19]。

TNBC 對鉑類化療的敏感性與基因組不穩(wěn)定性之間存在相關(guān)性。miRNAs 是一類非編碼的小RNA，參與包括腫瘤在內(nèi)的多種生物學(xué)過程，通過3’非翻譯區(qū)（3’UTR）堿基配對抑制靶基因mRNAs 的基因翻譯和/或切割調(diào)控靶基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和耐藥。miR-221/222 是位于X 染色體的miRNA 簇，既往研究顯示[20]，miR-221/222 在前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)，并發(fā)揮癌基因的作用。近年來的研究顯示[21]，miR-221/222 除扮演癌基因角色外，還可影響腫瘤的耐藥性。有研究顯示，在腦膠質(zhì)瘤中單純抑制miR-221 可增加卡莫司汀的耐藥性[22-24]，乳腺癌MCF7 細(xì)胞單純轉(zhuǎn)染miR-221 后導(dǎo)致對選擇性ER 下調(diào)劑氟維司群的耐藥性增加[25]。但miR-221/222 與TNBC DDP 耐藥的研究鮮見報道，尚需要進(jìn)一步研究探討。為了探討miR-221/222 與TNBC DDP 耐藥的關(guān)系，本研究采用熒光定量PCR 法檢測了miR-221/222轉(zhuǎn)染后DDP 培養(yǎng)的MDA-MB-231 細(xì)胞中miR-221和miR-222 的表達(dá)，結(jié)果顯示，通過抑制miR-221、miR-222 及共抑制miR-221/22 后，MDA-MB-231 細(xì)胞中相應(yīng)的miR-221/222 mRNA 表達(dá)減少，但單純抑制miR-221 和miR-222 并未明顯改變MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖率和凋亡率，而共抑制miR-221/222可明顯降低細(xì)胞的增殖率和凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)一步證實了上述結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，miR-221/222 可促進(jìn)TNBC MDA-MB-231 細(xì)胞對DDP 的耐藥性，抑制miR-221/222 可增加MDAMB-231 細(xì)胞對DDP 的敏感性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-221/222 可調(diào)控TNBC 細(xì)胞的DDP 耐藥性，為DDP 聯(lián)合小分子非編碼RNA 治療TNBC 提供了新的研究方向。