重癥中暑腦損傷患者神經(jīng)元特異性烯醇化酶及腦活性肽100B蛋白的表達(dá)及意義

李冰，賈曄然，高偉，李惠萍，陶維華，張紅璇

1南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，深圳市呼吸疾病研究所，廣東深圳 518020；2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所老年醫(yī)學(xué)科，廣州 510080； 3廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所廣東省干部體檢中心，廣州 510080

重癥中暑(severe heatstroke)是機(jī)體暴露于高熱環(huán)境或強體力勞動條件下，出現(xiàn)核心溫度升高超過40 ℃及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受損癥狀(包括顱內(nèi)高壓、譫妄、驚厥甚至昏迷等)的重癥疾病[1-2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀出現(xiàn)早且重，其損傷程度決定著患者的病情及預(yù)后[3]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、腦活性肽100B蛋白(S100B)是反映腦組織損傷程度和腦細(xì)胞功能障礙的敏感指標(biāo)，可在多種腦功能損傷相關(guān)疾病中異常表達(dá)，并參與腦組織功能損傷相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-5]。目前關(guān)于NSE、S100B在重癥中暑腦損傷中的表達(dá)及其與中暑致腦功能損傷關(guān)系的研究較少。本研究探討了NSE、S100B在重癥中暑腦損傷臨床診治中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月－2019年7月于深圳市人民醫(yī)院確診并住院治療的重癥中暑腦損傷患者96例作為病例組，其中男48例，女48例，年齡17～75(41.4±3.2)歲。重癥中暑診斷標(biāo)準(zhǔn)及嚴(yán)重程度分級嚴(yán)格參照我國《熱射病規(guī)范化診斷與治療專家共識》[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①入院后行顱腦CT及MRI檢查排除腦出血、腦栓塞等器質(zhì)性病變；②發(fā)病8h內(nèi)入院；③既往無心、肺、肝、腎等臟器重大疾病史，無神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦外傷病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤16歲；②既往有腦血管病或癲病、惡性腫瘤、血液病、免疫系統(tǒng)疾病及內(nèi)分泌系疾病病史。

選取同期于深圳市人民醫(yī)院體檢且各項指標(biāo)均正常的健康志愿者96名作為對照組，其中男48名，女48名，年齡18～72(43.1±2.6)歲。對照組先行頭部CT及MRI檢查排除顱內(nèi)疾病，經(jīng)本人同意后留取外周靜脈血及腰穿腦脊液標(biāo)本。兩組均為無民族間遺傳干擾(與其他民族人通婚情況)、無血緣關(guān)系的漢族人，性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得受試對象的知情同意。

1.2 格拉斯哥昏迷量表(Glasgow coma scale，GCS)評分及分組 采用GCS評定量表從睜眼、語言、運動反應(yīng)等3個方面進(jìn)行評分。根據(jù)入院時GCS評分將病例組分為輕度損傷組(13～14分，傷后昏迷時間<20 min；n=32)、中度損傷組(9～12分，傷后昏迷時間20 min～6h；n=32)與重度損傷組(3～8分，傷后昏迷時間>6 h，或傷后24 h內(nèi)意識情況惡化，再次昏迷超過6 h；n=32)。GCS評分越低，患者昏迷、意識障礙程度越重。

1.3 標(biāo)本采集 病例組于入院時(0h)及入院后1、3、7 d采集EDTA抗凝空腹外周靜脈血4 ml及腦脊液2 ml(行腰椎穿刺術(shù)經(jīng)腰穿引流管采集)；對照組血液標(biāo)本為體檢時采集的空腹外周靜脈血(4 ml)，腦脊液標(biāo)本為經(jīng)過檢驗科檢測的正常腦脊液(2 ml)，離心分離預(yù)處理后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 ELISA法檢測血清、腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)說明書步驟進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平。

1.3.2 Western blotting檢測腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平 采用凱基全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)提取腦脊液總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)進(jìn)行定量；上樣后，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、漂洗封閉，加入兔抗鼠一抗(抗NSE、抗S100B，1:1000，武漢博士德生物工程有限公司)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:2000，碧云天生物技術(shù)研究所)，顯影，凝膠成像儀獲取圖像，用FluorChem 8900自動圖像分析軟件進(jìn)行分析，以NSE、S100B與β-actin蛋白帶的灰度峰比值為NSE、S100B蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用SNK-q檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)法及Pearson法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平 Western bloはing及ELISA檢測結(jié)果顯示，病例組血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著腦損傷加重，病例組血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平逐漸增高，中度損傷組高于輕度損傷組，重度損傷組高于中度損傷組和輕度損傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同等程度腦損傷患者腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平均高于血清(P<0.05，圖1、表1)。

2.2 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者不同時間點血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平 Western blotting及ELISA檢測結(jié)果顯示，同一時間點，病例組血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，中度損傷組明顯高于輕度損傷組，重度損傷組明顯高于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)；總體比較，中度損傷組血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平明顯高于輕度損傷組(P<0.05)，重度損傷組明顯高于中度損傷組和輕度損傷組(P<0.05)。

圖1 不同損傷程度組重癥中暑腦損傷患者腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)(入院后7 d，Western blotting)Fig.1 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with different damage degree (7 days after admission, Western blotting)

表1 不同損傷程度組重癥中暑腦損傷患者血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)(±s)Tab.1 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood and cerebrospinal fluid of subjects with diあerent damages degree (±s)

表1 不同損傷程度組重癥中暑腦損傷患者血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)(±s)Tab.1 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood and cerebrospinal fluid of subjects with diあerent damages degree (±s)

NSE. 神經(jīng)元特異性烯醇化酶；S100B. 腦活性肽100B蛋白；與對照組比較，(1)P<0.05；與輕度損傷組比較，(2)P<0.05；與中度損傷組比較，(3)P<0.05。

組別 NSE t P S100B t P血清 腦脊液 血清 腦脊液對照組(n=96) 3.12±0.15 5.36±1.45 3.63 <0.05 0.45±0.13 1.10±0.26 9.46 <0.05輕度損傷組(n=32) 15.46±4.72(1) 28.03±2.78(1) 2.52 <0.05 1.08±0.17(1) 1.66±0.25(1) 5.01 <0.05中度損傷組(n=32) 26.12±4.62(1)(2) 36.56±6.48(1)(2) 4.45 <0.05 1.39±0.56(1)(2) 1.97±0.13(1)(2) 13.03 <0.05重度損傷組(n=32) 41.87±5.59(1)(2)(3) 47.25±8.48(1)(2)(3) 7.16 <0.05 2.08±0.73(1)(2)(3) 2.87±0.57(1)(2)(3) 12.48 <0.05

不同時間點，病例組血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平均發(fā)生變化，NSE的表達(dá)呈升高趨勢，3 d達(dá)峰值，然后進(jìn)行性下降(P<0.05)；輕度損傷組S100B蛋白表達(dá)1 d達(dá)峰值，然后進(jìn)行性下降(P<0.05)，中、重度損傷組S100B蛋白表達(dá)3 d達(dá)峰值，然后進(jìn)行性下降(P<0.05，圖2，表2、3)。

2.3 血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白表達(dá)與重癥中暑腦損傷患者GCS評分的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清NSE與血清S100B呈正相關(guān)(r=0.883，P<0.01)，與腦脊液S100B呈正相關(guān)(r=0.797，P<0.01)，與腦脊液NSE呈極強正相關(guān)(r=0.998，P<0.01)；腦脊液NSE與腦脊液S100B呈正相關(guān)(r=0.886，P<0.01)，與血清S100B呈正相關(guān)(r=0.824，P<0.01)；血清S100B與腦脊液S100B呈極強正相關(guān)(r=0.996，P<0.01)。即重癥中暑腦損傷患者NSE與S100B蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，每個時間點的血清及腦脊液NSE、S100B蛋白表達(dá)與重癥中暑腦損傷患者GCS評分均呈負(fù)相關(guān)，即GCS評分越低，NSE、S100B蛋白表達(dá)水平越高(P<0.05，表4)。

3 討 論

圖2 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者不同時間點腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)情況Fig.2 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with different damages degree of severe heatstrokeinduced brain injury

表2 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者不同時間點血清中NSE、S100B蛋白的表達(dá)(±s)Tab.2 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

表2 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者不同時間點血清中NSE、S100B蛋白的表達(dá)(±s)Tab.2 Expressions of NSE and S100B protein in peripheral blood of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

GCS. 格拉斯哥昏迷量表；NSE. 神經(jīng)元特異性烯醇化酶；S100B. 腦活性肽100B蛋白；與對照組比較，(1)P<0.05；與輕度損傷組比較，(2)P<0.05；與中度損傷組比較，(3)P<0.05。

指標(biāo) 對照組(n=96) 輕度損傷組(n=32) 中度損傷組(n=32) 重度損傷組(n=32)NSE 0 h 3.12±0.15 8.54±1.85(1) 20.32±5.37(1)(2) 32.50±4.16(1)(2)(3)1 d - 12.76±3.14(1) 23.56±3.34(1)(2) 40.64±7.40(1)(2)(3)3 d - 18.36±2.31(1) 30.48±4.36(1)(2) 46.54±7.16(1)(2)(3)7 d - 12.57±1.45(1) 25.86±5.24(1)(2) 42.14±8.05(1)(2)(3)S100B 0 h 0.45±0.13 0.98±0.16(1) 1.17±0.71(1)(2) 1.34±0.73(1)(2)(3)1 d - 1.38±0.25(1) 1.46±0.72(1)(2) 1.97±1.72(1)(2)(3)3 d - 1.21±0.42(1) 1.84±0.40(1)(2) 2.46±0.48(1)(2)(3)7 d - 1.01±0.14(1) 1.73±0.85(1)(2) 2.04±0.34(1)(2)(3)

表3 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者不同時間點腦脊液中NSE、S100B的表達(dá)(±s)Tab.3 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

表3 不同GCS評分重癥中暑腦損傷患者不同時間點腦脊液中NSE、S100B的表達(dá)(±s)Tab.3 Expressions of NSE and S100B protein in cerebrospinal fluid of subjects with severe heatstroke-induced brain injury of different GCS score at different time points after injury (±s)

GCS. 格拉斯哥昏迷量表；NSE. 神經(jīng)元特異性烯醇化酶；S100B. 腦活性肽100B蛋白；與對照組比較，(1)P<0.05；與輕度損傷組比較，(2)P<0.05；與中度損傷組比較，(3)P<0.05。

指標(biāo) 對照組(n=96) 輕度損傷組(n=32) 中度損傷組(n=32) 重度損傷組(n=32)NSE 0 h 5.36±1.45 24.23±5.17(1) 31.81±6.12(1)(2) 41.46±7.10(1)(2)(3)1 d - 27.64±5.66(1) 36.40±5.84(1)(2) 45.35±8.40(1)(2)(3)3 d - 35.43±7.12(1) 44.92±7.74(1)(2) 53.18±9.16(1)(2)(3)7 d - 30.31±6.78(1) 33.86±6.24(1)(2) 48.14±8.05(1)(2)(3)S100B 0 h 1.10±0.26 1.34±0.78(1) 1.65±0.56(1)(2) 1.89±0.73(1)(2)(3)1 d - 1.77±0.70(1) 1.82±0.30(1)(2) 2.26±0.37(1)(2)(3)3 d - 1.56±0.48(1) 2.38±0.94(1)(2) 2.94±0.40(1)(2)(3)7 d - 1.43±0.64(1) 2.06±0.57(1)(2) 2.58±0.19(1)(2)(3)

表4 重癥中暑腦損傷患者血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白表達(dá)與GCS評分的相關(guān)性Tab.4 The correlation between the expression levels of NSE and S100B protein and the GCS score in patients with severe heatstroke-induced brain injury

隨著全球氣候變暖、熱浪襲擊頻率和強度逐年增加，重癥中暑的發(fā)生率、病死率越來越高[7]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對高熱最敏感的器官，體內(nèi)高熱能迅速引起腦細(xì)胞發(fā)生損傷(腫脹、固縮、崩解甚至死亡)，從而出現(xiàn)不同程度的腦功能受損[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，NSE、S100B作為腦組織損傷的標(biāo)志物，正常情況下主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，但在腦損傷后透過血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)，在外周血和腦脊液中表達(dá)量增加，其水平越高，表明腦損傷程度越重，是評估腦功能損傷嚴(yán)重程度和預(yù)后的特異性和敏感性指標(biāo)[10-12]。既往動物實驗結(jié)果顯示，重癥中暑熱打擊可造成腦組織細(xì)胞水腫、細(xì)胞核破裂碎解以及發(fā)生炎性改變，從而造成不同程度的腦組織損傷[13]，且熱打擊后腦組織的缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、氧化損傷，以及腦細(xì)胞凋亡、自噬等是導(dǎo)致繼發(fā)性腦功能惡化的關(guān)鍵因素：①缺血缺氧。嚴(yán)重?zé)岽驌艨杉纯桃鸷ｑR、下丘腦等部位的缺血缺氧性損 傷[14]，且其繼發(fā)的腦血管功能障礙、顱內(nèi)高壓會加重缺血缺氧，形成惡性循環(huán)[9]。②炎癥反應(yīng)。熱打擊早期即可使血液內(nèi)高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)水平迅速增高，促使炎性因子大量表達(dá)，而腸黏膜屏障破壞使炎性因子入血進(jìn)入顱內(nèi)，加重腦組織損傷[15-16]。 ③氧化損傷。熱打擊可明顯增加海馬內(nèi)氧化損傷因子[14]及細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的釋放，大量ROS不僅介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能直接損傷溶酶體膜[17]。④腦細(xì)胞凋亡、自噬。嚴(yán)重?zé)岽驌艨芍率股窠?jīng)元DNA裂解；重癥中暑所致的腦缺血缺氧還可繼發(fā)腦細(xì)胞凋亡、自噬[18]。在上述因素的作用下，重癥中暑患者會快速出現(xiàn)海馬等部位的缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、神經(jīng)元壞死及凋亡等，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，從而引起重癥中暑腦損傷。因此，測定重癥中暑腦損傷后NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平，可在一定程度上反映熱打擊后繼發(fā)性腦損傷的嚴(yán)重程度；且NSE和S100B在腦內(nèi)的分布存在差異，出現(xiàn)時間及高峰時間均不同，兩者聯(lián)合檢測可更全面地反映腦組織損害的情況。

NSE是神經(jīng)元的標(biāo)志酶，S100B是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，在絕大多數(shù)腦損傷疾病中，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均會有不同程度的損傷，NSE、S100B動態(tài)聯(lián)合檢測對顱腦損傷患者的診斷及預(yù)后判斷有著重要意義。S?rensen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，外周循環(huán)血中NSE、S100B水平增高的時間滯后于腦脊液，表達(dá)水平也明顯低于腦脊液；牛莉莉等[20]研究缺血性腦卒中動物發(fā)現(xiàn)，血清及腦脊液中S100B及NSE在不同時間段呈趨勢性變化，腦脊液中S100B及NSE水平增高的時間均早于外周血，且腦脊液中增高的水平是外周血的幾十倍甚至幾百倍。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組血清及腦脊液中NSE及S100B蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組，同等程度腦損傷患者腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平高于外周血(P<0.05)，提示重癥中暑熱打擊可導(dǎo)致腦組織神經(jīng)元及血腦屏障受損，NSE、S100B在大腦中的特異性及腦脊液檢測中的靈敏度均高于外周血，可作為重癥中暑腦組織損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。Zaheer等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，患者血清NSE水平與腦缺血嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分呈負(fù)相關(guān)，即GCS評分低的患者卻具有較高的NSE水平；Ye等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，血清S100B水平與腦梗死患者的診斷、預(yù)后具有相關(guān)性，梗死后S100B水平越高，預(yù)后越差。本研究結(jié)果表明，隨著腦損傷程度加重，血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平增高，NSE與S100B的表達(dá)呈正相關(guān)，且NSE、S100B均與GCS評分呈顯著負(fù)相關(guān)，提示NSE、S100B亦可作為重癥中暑腦損傷嚴(yán)重程度的客觀反映指標(biāo)，為重癥中暑致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能性損害提供了新的理論依據(jù)。相關(guān)研究指出，腦損傷患者血清及腦脊液中S100B、NSE水平在不同時間點呈趨勢性變化，達(dá)到峰值后隨著時間延長以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)，可逐漸恢復(fù)至正常水平[20,23]。本研究結(jié)果顯示，不同時間點重癥中暑腦損傷患者血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平不同，隨時間改變呈差異性變化(P<0.05)，提示血清及腦脊液中S100B、NSE的連續(xù)監(jiān)測可用于評估腦損傷傷情和預(yù)測臨床結(jié)果。

本研究尚存在一定的缺陷和不足：①由于研究時間短、入組對象少等綜合因素導(dǎo)致研究規(guī)模較小，以及重癥中暑腦損傷患者腦組織標(biāo)本難以獲取而不能檢測腦組織中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平并進(jìn)行病理學(xué)檢測觀察中暑腦組織顯微結(jié)構(gòu)變化等，影響了研究結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性；②由于中暑患者發(fā)病至入院就診間隔時間長短不一且難以把握，重癥中暑腦損傷患者入院后不同時間點血清及腦脊液中NSE、S100B蛋白的表達(dá)水平不能代表發(fā)病后不同時間的表達(dá)水平，且病例組和對照組人群未做到完全匹配，研究方案需要進(jìn)一步改進(jìn)與細(xì)化以提高研究結(jié)果的精確性及準(zhǔn)確性；③由于重癥中暑腦損傷患者病情危重，治療過程中未能及時動態(tài)完善頭顱CT及MRI等影像學(xué)檢查，從而未能聯(lián)合NSE、S100B指標(biāo)進(jìn)一步佐證重癥中暑致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能性損傷；④本研究結(jié)果仍需要大量更加完備的研究設(shè)計深入探討及驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，NSE、S100B水平在重癥中暑腦損傷患者的血清及腦脊液中異常增高，與疾病嚴(yán)重程度及GCS評分顯著相關(guān)，推測其可作為判斷重癥中暑腦損傷嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一。