固定化微球降解土壤中PAEs效果及影響因素

張小紅 陶紅，3 王亞娟 李一春 張銳

（1. 寧夏大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，銀川 750021；3. 寧夏（中阿）旱區(qū)資源評價與環(huán)境調(diào)控重點實驗室，銀川 750021）

鄰苯二甲酸酯（Phthalates esters，PAEs）又稱酞酸酯，是鄰苯二甲酸與醇形成的酯類，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，主要作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于地膜、棚膜生產(chǎn)中［1-3］。PAEs與分子間以范德華力或氫鍵鏈接，彼此保留相對獨立的化學(xué)性質(zhì)，使其在生產(chǎn)或排放過程中極易析出，污染空氣［4］、水體［5-7］、土壤［8-12］、降塵［13-14］等。由于鄰苯二甲酸酯在土壤中難以降解，它往往通過食物鏈進(jìn)入到人體，在人體內(nèi)不斷積累，進(jìn)而危害人體健康。

PAEs降解途徑主要包括水解［15］、光解［16-18］、生物降解［19-21］等，由于生物修復(fù)具有高效、價廉、穩(wěn)定、安全等特點，從而被認(rèn)為是降解土壤環(huán)境中PAEs最佳途徑，也因此成為近年來眾多學(xué)者研究的熱點。目前已篩選出降解環(huán)境中PAEs的降解菌有80多種［22］，如梁浩花等［23］從土壤中篩選出一株同時降解鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl ortho-phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（Di-n-butyl orthophthalate，DnBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯［Bis（2-ethylhexyl）ortho-phthalate，DEHP］的節(jié)桿菌屬，在最優(yōu)條件下其降解率分別可達(dá)99.62%、99.65%和55.26%；范新會［24］從土壤中篩選出一株降解DEHP的Arthrobacter菌，在84 h后，降解率可達(dá)97%以上；楊婕等［25］從土壤中篩選出一株降解DnBP的寡養(yǎng)單胞菌，在最優(yōu)條件下，降解率可達(dá)95.8%；王嘉翼［26］從長期受污染的土壤中篩選出一株降解DnBP的黃色桿菌屬，在最優(yōu)條件下，5 d后可降解完全等。

游離狀態(tài)降解菌的活性易受外界環(huán)境中溫度、pH、重金屬、鹽等的影響，而微生物固定化技術(shù)能有效起到保護(hù)降解菌的作用，減少外界環(huán)境的影響。1959年，Hattori等［27］成為第一批將大腸桿菌成功固定化的人，自此微生物固定化技術(shù)發(fā)展速度日益加快，到目前為止已形成較完備的理論和方法。Karamanev等［28］提出了土壤微生物固定化概念，證明了固定化可以有效提高微生物降解土壤持久性污染物的效率。Kadakol等［29］對游離和固定化微生物的研究表明固定化細(xì)胞更具優(yōu)勢。Ramakrishna等［30］對枯草芽孢桿菌細(xì)胞采用了海藻酸鈣固定，研究顯示該固定化細(xì)胞在發(fā)酵產(chǎn)酶10次后的酶活都在250 U左右。在國內(nèi)，固定化微生物技術(shù)已經(jīng)在修復(fù)土壤農(nóng)藥、石油及多環(huán)芳烴污染等領(lǐng)域開展了部分研究工作。陸佳靚［31］用包埋后的蠟狀芽孢桿菌和芽胞桿菌降解土壤中的毒死蜱和克百威，發(fā)現(xiàn)固定化后的菌種對毒死蜱和克百威的降解率超過了80%，高于游離菌的降解率，在很大程度上縮短半衰期的時間。元妙新［32］利用聚乙烯醇和海藻酸鈉包埋芽孢桿菌和動膠桿菌，降解土壤中的多環(huán)芳烴，研究表明在96 h時對芘降解率達(dá)到61.8%。在石油污染方面，胡文穩(wěn)、呂吉利和孫國強(qiáng)［33-35］分別采用海藻酸鈉包埋法、納米多孔SiO2載體吸附法和松針碳載體吸附法，對棒狀桿菌等進(jìn)行包埋或吸附，研究表明固定化后的菌種降解效果更好。段淑偉［36］利用海藻酸鈉、膨潤土和殼聚糖對微生物進(jìn)行包埋固定降解土壤中的DnBP，在第14、28 天時土壤中的DnBP殘留量分別高于66%和低于20%。周震峰等［37］利用海藻酸鈉（Sodium alginate，SA）和聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）對微生物進(jìn)行包埋同樣發(fā)現(xiàn)固定化微生物對DnBP具有高效的降解能力。以上研究雖然表明固定化后微生物對于目標(biāo)污染物的降解效率提高，但均為在實驗室控制條件，而對于固定化后微生物是否適應(yīng)外界環(huán)境、能否在實際環(huán)境中保持高效降解能力涉及較少。

本研究以海藻酸鈉為載體，對課題組前期篩選出能同時降解DMP、DnBP和DEHP的優(yōu)勢菌株（微小桿菌）采用包埋法進(jìn)行固定，形成固定化微球，比較固定化微球和游離菌降解土壤中DMP、DnBP和DEHP的效果及外界環(huán)境對其降解效果的影響，以期為本區(qū)域土壤鄰苯二甲酸酯污染修復(fù)及降解菌固定化的實際應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為課題組前期分離鑒定保存的DMP、DnBP、DEHP高效降解菌：微小桿菌（Microbacteriumsp.），登錄號為：MG569788。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）配制：5.0 g氯化鈉，10.0 g蛋白胨，3.0 g牛肉膏于燒杯中，加水定容至1000 mL，分裝于5個250 mL錐形瓶中，用錫箔紙封口，1×105Pa滅菌30 min后使用。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基）配制：在5個250 mL的錐形瓶中均加入3.0-4.0 g的瓊脂，倒入200 mL LB液體培養(yǎng)基溶液，搖勻后用錫箔紙封口于1×105Pa滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃時倒平板。平板時培養(yǎng)基溫度盡量不要太高以免冷卻后上蓋凝結(jié)的冷凝水污染平板。

1.2 方法

1.2.1 游離菌的制備方法 在無菌操作臺上，挑取適量活化后的菌株到LB液體培養(yǎng)基，在175 r/min、30℃恒溫震蕩24-48 h，待肉眼觀看到培養(yǎng)液渾濁（即游離菌處于對數(shù)生長期）取出，然后將培養(yǎng)液分裝于50 mL已滅菌的離心管中，在室溫條件下以4000 r/min的速度離15 min后，丟棄上清液，用滅菌后的0.9%的生理鹽水洗滌濕菌體表面3次，收集該濕菌體。用生理鹽水將其調(diào)成菌懸液，在波長λ為600 nm條件下吸光度值達(dá)到1.003，制得菌懸液，用鋁箔紙封口后置于冰箱4℃保存?zhèn)溆茫▓D1-A）。

1.2.2 固定化微球的制備方法 稱取海藻酸鈉30 g于1000 mL燒杯中，加入750 mL蒸餾水?dāng)嚢柚梁Ｔ逅徕c徹底溶解后，加入20 g活性炭，混勻封口。另稱取25 g氯化鈣溶于1000 mL水中并封口。將以上兩個混合液放入高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌處理（121℃，30 min）［38］，滅菌完成后，取出以上兩個混合液，等其冷卻后，向海藻酸鈉混合液中加入200 mL菌懸液（1.2.1）。混合均勻后，將滅菌橡膠管插入到該混合液中，在蠕動泵作用下將其緩緩滴入CaCl2溶液中，調(diào)整合適的高度使滴出的球盡量圓滑，得到固定化微球。將固定化微球在CaCl2溶液中放置18-24 h后，用滅菌過的蒸餾水沖洗干凈，保存在錐形瓶中封口后置于冰箱備用（圖1-B）。

圖1 鄰苯二甲酸酯菌懸液及固定化微球

1.2.3 游離菌和固定化微球降解土壤中DMP、DnBP和DEHP的效果 原土采自寧夏大學(xué)校園綠化土壤，去除石頭和草根等雜物，攪拌均勻后利用四分法得到1/4土壤原樣，在避光陰涼干燥處自然風(fēng)干。風(fēng)干后的土壤研磨后過20目篩，混合均勻。將經(jīng)過以上處理得到的土樣高壓蒸汽滅菌（121℃，1×105Pa，30 min），添加DMP、DBP和DEHP母液，使得最終污染后的土壤中DMP、DnBP和DEHP的濃度分別達(dá)到100 mg/kg、100 mg/kg和20 mg/kg。

取3份500 g污染土開展對照試驗。游離菌組：一份土樣中加入50 mL（1.2.1）菌懸液（接種量10%）。固定化微球組：一份土樣加入250 g固定化微球（1.2.2），以確保二者最終菌量一樣；空白對照組：兩者都不加入。用玻璃棒分別將3組土樣混勻后，置于不銹鋼托盤中并鋪平，加入一定量滅菌蒸餾水，30℃下于恒溫生化培養(yǎng)，保持3組對照土壤的水分含量符合田間最大持水量60%的要求。分別在第0、3、5、7、10、15和20 d時，將土樣均勻混合后四分法取部分土樣待處理。

1.2.4 環(huán)境條件對游離菌和固定化微球降解效果影響 配制DMP、DnBP和DEHP濃度均為50 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)液，分別設(shè)置不同環(huán)境條件，每個環(huán)境條件下分別添加游離菌和固定化微球（菌液接種量均為10%），同時設(shè)置未投加菌液和微球的空白對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在30℃、175 r/min避光條件下振蕩培養(yǎng)5 d，測定DMP、DnBP和DEHP殘留量并計算降解率。

（1）pH設(shè)置5、7、9、11；（2）溫度設(shè)置4、10、20、30、40℃；（3）重金屬實驗組加入250 mg/L Cr、50 mg/L Pb、100 mg/L Cu、0.4 mg/L Cd，對照組不加重金屬；（4）無機(jī)鹽對照組為正常處理，不加任何鹽類，中性鹽加入濃度為0.2%的NaCl∶MgSO4=2∶1（m/m），堿性鹽濃度為0.2%的NaHCO3∶Na2CO3=1∶1（m/m），混合鹽濃度為0.2%的NaCl∶MgSO4∶NaHCO3∶Na2CO3=4∶2∶1∶1（m/m/m/m）。

1.2.5 樣品處理

1.2.5.1 土樣處理 稱取過60目篩的干土，放入50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入2.0 mL濃度為50 mg/L的指示物苯甲酸芐酯和20 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，靜置30 min，然后200 W超聲20 min，以4000 r/min離心3 min，將離心管全部上清液倒入50 mL試管中，氮吹至凈干，最后用乙酸乙酯定容至2 mL，過0.22有機(jī)濾膜至進(jìn)樣瓶待測。

1.2.5.2 無機(jī)鹽處理 向100 mL的DMP、DnBP和DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2 mL的50 mg/L苯甲酸芐酯，加入乙酸乙酯30 mL，超聲30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中再超聲5 min，分液。取出凈化柱，依次加入2 g無水硫酸鈉，4 g弗羅里硅土，2 g無水硫酸鈉。先用10 mL乙酸乙酯預(yù)洗柱子，再將分液后的液體用50 mL乙酸乙酯洗脫。收集全部洗脫液至試管中，氮吹至凈干，最后用乙酸乙酯定容至2 mL，過0.22有機(jī)濾膜至進(jìn)樣瓶待測。

1.2.6 氣相色譜條件 采用氣相色譜進(jìn)行樣品定量分 析，色 譜 柱 為（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm）毛細(xì)管，F(xiàn)ID檢測器溫度為290℃，進(jìn)樣口溫度為260℃，載氣為氮氣，流速為1.3 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，升溫程序60℃保持1 min，以20℃/min的速率升溫到220℃保持1 min，最后以5℃/min速率升溫到290℃，保持1 min。

1.2.7 計算方法

其中，A0為含降解菌培養(yǎng)液或微球中PAEs的殘留濃度，ACK為無菌對照處理PAEs 的殘留濃度。

1.2.8 質(zhì)量控制 為避免外界環(huán)境對實驗結(jié)果的影響，所有的玻璃儀器均用鉻酸洗液浸泡12 h后使用，有機(jī)溶劑均通過全玻璃系統(tǒng)二次旋蒸后使用。在實驗過程中均設(shè)置3個平行實驗和空白實驗，并且所有樣品在處理時利用苯甲酸芐酯（50 mg/L）作為回收率指示物，回收率均保持在72%-115.4%內(nèi)，實驗方法符合要求。采用5點繪制DMP、DnBP和DEHP標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)在0.992-0.995范圍之內(nèi)，滿足實驗要求。

2 結(jié)果

2.1 游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP和DEHP效率比較

游離菌、固定化微球降解土壤中DMP、DnBP和DEHP效率如圖2所示。在整個培養(yǎng)期內(nèi)，對于DMP、DnBP和DEHP的降解效率，固定化微球均高于游離菌和空白對照組，對于DMP和DnBP，固定化微球在第7、10天降解完全，而游離菌在第15、20天降解完全；對于DEHP，固定化微球在第20天的降解率達(dá)到63.37%，而游離菌為48.77%；DMP相比于DnBP、DEHP降解效果更快，更容易被降解完全。

2.2 pH值對游離菌、固定化微球降解效率的影響

溶液中pH值通常會影響微生物降解酶的活性，進(jìn)而影響菌株對污染物降解作用。pH對于游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響如圖3所示。不同pH條件下，固定化微球?qū)?種PAEs降解效率均高于游離菌；當(dāng)pH 9時，3種PAEs降解效率均達(dá)到最高，固定化微球的降解效率仍大于其他兩種，說明本實驗所用微小桿菌更適應(yīng)堿性環(huán)境。

圖2 游離菌和固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP效率

圖3 pH值對降解效率的影響

2.3 溫度對游離菌、固定化微球降解效率的影響

溫度對于游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響如圖4所示。對于不同溫度而言，固定化微球降解效率均高于游離菌，表明固定化微球比游離菌對外界溫度環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。當(dāng)溫度為30℃時固定化微球和游離菌對于DMP、DnBP、DEHP的降解效率均達(dá)到最佳。

圖4 溫度對游離菌、固定化微球降解效率的影響

2.4 重金屬對游離菌、固定化微球降解效率的影響

重金屬對于游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響見圖5。從圖5可以看出，重金屬對空白組的影響很??；對游離菌，添加重金屬的實驗組和對照組相比，DMP、DnBP和DEHP的降解效率分別降低了68.07%、74.94%和33.91%，說明重金屬對游離菌的降解效率有很強(qiáng)的抑制作用；而對固定化微球，添加重金屬的實驗組與對照組相比，DMP、DnBP的降解效率僅降低16.35%、9.95%，DEHP不僅沒有降低，反而增加2.49%，說明在受到重金屬污染的培養(yǎng)液中，固定化微球相比游離菌有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。

圖5 重金屬對游離菌、固定化微球降解效率的影響

2.5 無機(jī)鹽對游離菌、固定化微球降解效率的影響

無機(jī)鹽對游離菌、固定化微球降解DMP、DnBP、DEHP的影響如圖6所示，無機(jī)鹽對未添加降解菌的對照組影響較小，3種PAEs的降解率變化不大；中性鹽、堿性鹽和混合鹽3種無機(jī)鹽中，中性鹽對游離菌和固定化微球降解菌的影響較大。對游離菌，添加中性鹽的實驗組與對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了21.65%、22.53%和5.43%，而添加堿性鹽或混合鹽的實驗組與對照組相比，PAEs的降解效率下降不明顯。對于固定化微球，添加中性鹽的實驗組和對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了11.78%、1.90%和增加了1.01%，變化程度遠(yuǎn)小于游離菌實驗組；添加堿性鹽的實驗組與對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了3.28%、增加了3.53%和4.76%；添加混合鹽的實驗組和對照組相比，DMP、DnBP和DEHP降解率分別降低了8.38%、增加了5.49%和7.98%。

圖6 無機(jī)鹽對游離菌、固定化微球降解效率的影響

3 討論

近年來，我國土壤普遍受到鄰苯二甲酸酯污染［39-40］，微生物降解土壤環(huán)境中的鄰苯二甲酸酯也作為熱點之一，并被眾多學(xué)者研究［41］。目前發(fā)現(xiàn)的可以降解土壤環(huán)境中的菌種包括芽孢桿菌屬、變形假單胞菌、節(jié)桿菌屬、類芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、紅球菌屬、假單胞菌屬、乙酸鈣不動桿菌屬、鹽懶惰菌屬和普羅維登氏菌等［42-43］，由于游離的菌株易受外界環(huán)境的影響，將游離狀態(tài)的菌株進(jìn)行包裹，對外界環(huán)境有一定的抵御能力。

本實驗中，固定化微球在土壤中對PAEs的降解效果明顯高于游離菌，是因為固定化載體可為微生物提供增殖空間，降低土著菌或噬菌體的惡性競爭和侵害［44］，對降解菌的活性保存高［45］，同時，載體還可為外源微生物提供營養(yǎng)，提高土壤微生物的密度和活性，富集微生物及其分泌的胞外酶，使其具有穩(wěn)定和較高的降解性能。DMP相比于DnBP、DEHP降解效果更快，這可能是因為DMP屬于短鏈結(jié)構(gòu)，易被土壤中微生物降解，而DnBP、DEHP屬于PAEs長鏈化合物，相比于DMP，較難降解所致［46］。

然而，每種微生物均會受到外界環(huán)境pH、溫度等因素的影響，本研究中降解菌降解PAEs的最佳pH為9，最佳溫度為30℃，與潘琪等研究結(jié)論一致［47］。在不同pH和溫度下，固定化微球的降解效果均好于游離菌，與固定化微球?qū)?nèi)部包埋的微小桿菌起到一定的保護(hù)作用，為菌體創(chuàng)造了緩沖的微環(huán)境有關(guān)［48］；當(dāng)溫度為40℃時，固定化微球和游離菌對PAEs的降解效率均下降，推測認(rèn)為是因為微生物對有機(jī)物的降解是一種酶促反應(yīng)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高酶促反應(yīng)增強(qiáng)，超過一定溫度，繼續(xù)升溫逐漸使酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶的活性降低，因此表現(xiàn)出對PAEs的降解效率下降?？傮w來說，本實驗中固定化微球相較于游離菌對外界pH、溫度環(huán)境變化表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性。

考慮到寧夏地域部分土壤重金屬污染嚴(yán)重，且鹽堿土壤較多，本實驗設(shè)計了重金屬與無機(jī)鹽對降解菌降解PAEs效果的影響實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在重金屬污染環(huán)境中，游離菌降解PAEs降解率下降明顯，重金屬對游離降解菌的降解效率有很強(qiáng)的抑制作用，特別是對DMP、DnBP的降解效率影響最大。在無機(jī)鹽污染條件下，中性鹽環(huán)境與堿性鹽與混合鹽環(huán)境相比，游離菌降解PAEs下降更加明顯。已有研究表明，鹽堿脅迫對微生物的影響趨勢并不一致，鹽脅迫的影響比堿脅迫更為明顯［49］，本實驗中，中性鹽對游離菌影響較大，與已有研究結(jié)論一致，這可能是因為中性鹽產(chǎn)生的滲透脅迫及離子毒害會抑制降解酶的活性［50］，PAEs降解率下降明顯；堿性鹽和混合鹽對游離菌影響較小，推測認(rèn)為一方面是由堿性鹽和混合鹽溶液pH值較大，降解環(huán)境有利于降解菌降解PAEs；另一方面是因為Nacl濃度較低，輕度的鹽堿脅迫處理可提高微生物數(shù)量及活性［51］，進(jìn)而對PAEs的降解有促進(jìn)作用。無論在重金屬或無機(jī)鹽污染環(huán)境中，固定化微球降解PAEs的能力均明顯優(yōu)于游離菌，相比游離菌具有更強(qiáng)的抵御能力，這可能得益于固定化載體為微環(huán)境提供的緩沖體系，減少了不利因素的侵害，保證被接種高效降解微生物的健康生長［52］，從而對重金屬或鹽堿脅迫表現(xiàn)出較好的抗性。因此，在實際受重金屬污染或鹽堿土壤中，固定化微球可為PAEs降解率的提高提供潛在的可能。

雖然固定化微球相比游離菌，對于DMP、DnBP和DEHP降解效率更高，且更能抵御外界環(huán)境的影響，但是實際土壤環(huán)境更加復(fù)雜，對實際土壤中外界影響因素效果還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

在土壤環(huán)境、降解時間相同條件下，固定化微球?qū)MP、DnBP和DEHP的降解效果均高于游離菌，在更短的時間內(nèi)可將DMP、DnBP和DEHP降解完全；在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中探索固定化微球與游離菌降解DMP、DnBP和DEHP的區(qū)別及影響降解的外界因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同pH、溫度、重金屬、無機(jī)鹽環(huán)境下，相同時間內(nèi)，固定化微球比游離菌DMP、DnBP、DEHP降解率更高，適應(yīng)能力更好；固定化微球最佳降解條件pH為9，最適溫度為30℃；對重金屬、無機(jī)鹽外界污染環(huán)境，固定化微球比游離菌有更強(qiáng)的抵御能力。