組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）對(duì)小麥基因編輯效率的影響及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

代文雙 劉會(huì)云 杜慶國(guó) 鄒棖 王軻

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

作為重要的糧食作物，小麥在世界各地被廣泛種植。我國(guó)作為世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，其生產(chǎn)對(duì)保障糧食安全有重要的現(xiàn)實(shí)和戰(zhàn)略意義。小麥的增產(chǎn)和品質(zhì)改良愈發(fā)重要，產(chǎn)量和品質(zhì)等重要性狀都是受多基因和環(huán)境互作的復(fù)雜性狀，單純靠常規(guī)育種技術(shù)很難滿(mǎn)足需求，基因編輯技術(shù)是改善這一現(xiàn)狀的有效手段?；蚪M編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為植物功能基因研究和作物遺傳改良提供了重要的技術(shù)支持。與其他基因組編輯技術(shù)相比，近年來(lái)誕生的CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas）系統(tǒng)（主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a）具有操作簡(jiǎn)單、效率高的優(yōu)點(diǎn)。自2013年CRISPR/Cas9首次應(yīng)用于真核生物［1-2］，即成為生命科學(xué)領(lǐng)域的革命性工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功地用于各種真核生物的基因組工程中，并為基因治療和植物育種提供了強(qiáng)大的工具［3］。目前，CRISPR/Cas9在植物基因組編輯中的應(yīng)用主要包括基因功能研究和作物遺傳改良。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率在不同物種間差異很大，而且對(duì)于單倍體和多倍體植物來(lái)說(shuō)該技術(shù)的難度也存在顯著差異［4-5］。比如二倍體植物水稻CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生突變的效率可達(dá)到80%以上［6］。多倍體植物尤其是小麥、馬鈴薯等，構(gòu)建有效的基因編輯系統(tǒng)仍然是當(dāng)前研究的難點(diǎn)［7-8］。小麥?zhǔn)怯葾，B和D三個(gè)基因組組成的六倍體，基因組約17 Gb，約為水稻的40倍［9-12］，且重復(fù)序列高達(dá)85%-90%［13-14］。利用CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)編輯小麥基因組中的多個(gè)拷貝依然非常困難，這是限制小麥基因編輯應(yīng)用的主要原因。雖然在小麥中TaWaxy基因編輯效率高達(dá)80%，但3個(gè)同源基因同時(shí)編輯的效率僅有30%左右［15］。因此，提高小麥尤其是3個(gè)基因組的編輯效率的研究工作至關(guān)重要。

真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)影響CRISPR/Cas9基因編輯效率。在真核細(xì)胞中細(xì)胞核DNA以約147 bp的DNA繞八聚結(jié)構(gòu)的組蛋白1.67圈，進(jìn)而形成核小體［16-17］。相鄰核小體的連接區(qū)由10-80 bp的游離DNA與組蛋白H1共同構(gòu)成，此串聯(lián)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊、凝聚形成染色質(zhì)［18］。核小體（染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位）的存在會(huì)阻礙Cas9蛋白對(duì)其纏繞DNA上的靶點(diǎn)的連接與切割，降低編輯效率［19-21］。染色質(zhì)主要以開(kāi)放和非開(kāi)放兩種狀態(tài)存在。核小體與DNA纏繞致密、染色質(zhì)緊實(shí)度高的區(qū)域?yàn)榉情_(kāi)放區(qū)，反之即為染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)。開(kāi)放區(qū)域染色質(zhì)狀態(tài)相對(duì)松散，該區(qū)域內(nèi)的基因組占總DNA序列的2%-3%，且超過(guò)90%的開(kāi)放區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合相關(guān)［22］。Wu等對(duì)哺乳動(dòng)物Cas9的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了全基因組作圖，發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白與靶基因的作用主要集中在染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域［23-24］。Chari等［25］在對(duì)人類(lèi)細(xì)胞研究中也發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的插入與缺失在染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域更多。除在動(dòng)物中，在植物的研究中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，結(jié)合已有的基因組數(shù)據(jù)信息在水稻開(kāi)放區(qū)域的CRISPR/Cas9編輯效率要高于非開(kāi)放區(qū)域［26］。

研究人員可以通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)局部結(jié)構(gòu)調(diào)控染色質(zhì)的開(kāi)放與非開(kāi)放狀態(tài)來(lái)提高CRISPR/Cas9對(duì)基因組的編輯效率。Isaac等［27］利用兩種染色質(zhì)重塑 因 子SNF 2h（Sucrose non-fementing 2h）和RSC（Remodels the structure of chromatin）增加開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域，進(jìn)而顯著提高了Cas9蛋白靶向DNA能力。HMGN（High mobility group proteins）、HMGB1（High mobility group box 1 protein）組蛋白H1和染色質(zhì)重塑復(fù)合物等是能與蛋白質(zhì)自然構(gòu)象相互作用的蛋白質(zhì)。其中HMGN蛋白是核小體連接蛋白，可以調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［28-30］；HMGB1具有DNA彎曲活性，并且與組蛋白H1競(jìng)爭(zhēng)核小體附近的染色質(zhì)［31-33］。一種名為CRISPR-chrom的方法［34］，通過(guò)將Cas9直系同源物與這些染色質(zhì)調(diào)節(jié)相關(guān)的多肽融合在一起，能顯著提高Cas9的編輯效率。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，這些方法都是通過(guò)重塑染色質(zhì)，即調(diào)整或移除核小體、調(diào)節(jié)組蛋白等來(lái)提高Cas9對(duì)靶點(diǎn)的編輯效率。

組蛋白乙?；诤诵◇w重塑中起主要作用［35-36］。它是研究最早，特征最多的翻譯后修飾［37］。組蛋白乙?；揎椏梢愿淖?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和修復(fù)［38-39］。組蛋白乙?；馁?lài)氨酸可被重塑因子SWI2/SNF2（Switching defective2/sucrose non-fermenting2）識(shí)別和結(jié)合進(jìn)行染色質(zhì)重塑［40］。其修飾水平受組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferases，HAT）和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶（Histone deacetylases，HDAC）的調(diào)節(jié)，其中組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)移酶在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和響應(yīng)脅迫方面發(fā)揮重要作用［41-44］。

丁酸鈉（Sodium butyrate）和尼克酰胺（Nicotinamide）是常見(jiàn)的用來(lái)研究組蛋白乙?；揎椝降膬煞N組蛋白去乙?；敢种苿℉istone deacetylase inhibitors，HDACi）。丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸，可抑制RPD3/HDA1 HDAC基因家族的同源物［45］。尼克酰胺是維生素B3的衍生物，屬于SIR2類(lèi)的 HDAC去乙?；敢种苿?dāng)過(guò)量加入會(huì)顯著抑制哺乳動(dòng)物和酵母中HDAC［46-47］。尼克酰胺處理會(huì)抑制擬南芥產(chǎn)生SIR2類(lèi)的HDAC（SRT1和SRT2），導(dǎo)致染色質(zhì)重塑蛋白VIN3（Vernalization Insensitive 3）位點(diǎn)的表達(dá)量升高［48-49］，進(jìn)而抑制FLC（Flowering Locus C）的表達(dá)。FLC水平的升高會(huì)抑制開(kāi)花，即尼克酰胺處理對(duì)FLC的抑制作用可促進(jìn)開(kāi)花［49-51］。在玉米中也有HDACi的應(yīng)用，Tiricz等［52］用丁酸鈉和尼克酰胺處理玉米細(xì)胞，可以促進(jìn)染色質(zhì)區(qū)域松散狀態(tài)，而且能夠提高寡核苷酸 定 向 誘 變（Oligonucleotide-directed mutagenesis，ODM）的效率，即提高ODM類(lèi)基因編輯效率。

本研究主要利用組蛋白去乙?；敢种苿┨幚硇←溣酌?，通過(guò)對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶合成通路基因下調(diào)表達(dá)都與染色體開(kāi)放狀態(tài)相關(guān)，從而發(fā)現(xiàn)尼克酰胺處理會(huì)改變小麥染色質(zhì)狀態(tài)及基因表達(dá)；我們進(jìn)一步以對(duì)未發(fā)生編輯的TaAGO4a基因編輯轉(zhuǎn)基因小麥材料的T1代為材料，取其開(kāi)花14 d的幼胚進(jìn)行一步成苗并利用尼克酰胺處理T2代幼苗，結(jié)果顯示尼克酰胺確實(shí)可以增加小麥TaAGO4a基因編輯效率。這為提高小麥基因編輯效率提供一種新策略，為進(jìn)一步研究小麥CRISPR/Cas9系統(tǒng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所用材料為六倍體小麥春性品種Fielder，以含有SpCas9和針對(duì)TaAGO4a基因的sgRNA且未發(fā)生編輯的Fielder的T1代轉(zhuǎn)基因植株為材料研究尼克酰胺與編輯效率之間關(guān)系的實(shí)驗(yàn)。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因中心小麥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng) 選取大小一致、飽滿(mǎn)的小麥種子生長(zhǎng)于溫室中，日照16 h，24℃；黑暗8 h，18℃。培養(yǎng)條件為光強(qiáng)300 μmol/m2/s，濕度為45%，每周澆水一次。選取開(kāi)花授粉后14 d左右未成熟的小麥籽粒，用70%的乙醇洗1 min，然后用15%的次氯酸鈉震蕩洗滌10 min，最后用無(wú)菌水洗3次。于超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作分離小麥幼胚，將小麥幼胚的胚軸朝上放置于1/2 MS（2.215 g MS/L 粉末，20 g/L蔗糖，0.5 g/L MES，3 g/L 植物凝膠，pH 5.8）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別設(shè)置濃度為0 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L的尼克酰胺培養(yǎng)基和0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L的丁酸鈉6種培養(yǎng)基。長(zhǎng)日照培養(yǎng)（16 h光照/8 h 黑暗）室溫25℃，光強(qiáng)300 μmol/m2/s。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定及樣品選取 記錄尼克酰胺和丁酸鈉兩種試劑不同濃度處理的小麥幼苗長(zhǎng)勢(shì)，記錄生長(zhǎng)7 d、14 d時(shí)小麥幼苗的株高與生長(zhǎng)狀況。對(duì)3種濃度尼克酰胺處理的小麥幼苗，每種材料取3個(gè)重復(fù)，蒸餾水沖洗3-4次，吸干表面水分，液氮速凍，置于-80℃暫存。取T1代轉(zhuǎn)基因植株的幼苗葉組織約0.1 g提DNA，確認(rèn)這批材料是含未被編輯的TaAGO4a基因且Cas9/sgRNA編輯復(fù)合體仍然存在的植株。對(duì)上述材料繼續(xù)培養(yǎng)并摘取其幼胚進(jìn)行尼克酰胺處理，并對(duì)處理7 d和14 d的T2代幼苗葉組織取約0.1g提DNA，檢測(cè)植株編輯情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 利用TransZolUp（TransGen Biotech，USA）提取不同濃度的尼克酰胺（0 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L）處理7 d和14 d葉組織的總RNA，實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)重復(fù)共12個(gè)樣本，分別記做ctrl7d_1，ctrl7d_2，t7d-2.5_1，t7d-2.5_2，t7d-5_1，t7d-5_2，ctrl14d_1，ctrl14d_2，t14d-2.5_1，t14d-2.5_2，t14d-5_1，t14d-5_2。將這些RNA去除基因組DNA后，檢測(cè)RNA樣本的濃度與完整性，濃度均＞ 800 ng/μL，RIN ＞ 7（RNA完整性，大于7既滿(mǎn)足建庫(kù)要求，大于6.3可以獲得較高的mapping率），OD260/280＞ 1.8，RNA質(zhì)量檢測(cè)合格，即可送北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行RNA-seq高通量測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Trimmomatic軟件［53］對(duì)這24個(gè)文庫(kù)Raw Reads去除測(cè)序接頭、低質(zhì)量Reads、未知堿基比例大于5%的Reads以及接頭污染的Reads，得到Clean Reads。利用FastQC軟件對(duì)Clean Reads進(jìn)行質(zhì)控，通常Q30（堿基測(cè)序錯(cuò)誤率小于0.1%）的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的85%以上，才認(rèn)為數(shù)據(jù)符合分析要求。利用Hisat2 v2.1.0［54-55］將過(guò)濾合格的Clean Reads比對(duì)到小麥RefSeq v1.0［12］參考基因組上，雙端比對(duì)的最大片段長(zhǎng)度設(shè)為400 bp，其他參數(shù)選用默認(rèn)參數(shù)，比對(duì)結(jié)果存儲(chǔ)于Sam（Sequence alignment map）文件中。用Samtools軟件把Sam轉(zhuǎn)為Bam（Binary alignment map）格式文件，參數(shù)采用-sort -@ 8。然后利用Stringtie v1.3.3［55-56］軟件組裝、拼接轉(zhuǎn)錄本，參數(shù)使用-B -G。輸出文件用R語(yǔ)言中的Ballgown包來(lái)計(jì)算基因表達(dá)量，結(jié)果以FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，每千堿基外顯子百萬(wàn)片段數(shù)）表示基因的表達(dá)水平。Htseq-count v0.8.0［57］軟件用以計(jì)數(shù)bam文件中的reads數(shù)。差異表達(dá)分析選用R包DEseq2，輸入文件正是上述Htseq-count的輸出文件。其中FKPM ＞ 1被定義為“表達(dá)基因”，否則認(rèn)為基因非表達(dá)。矯正P值＜ 0.05及差異變化倍數(shù)（|Log2 Fold Change|，LFC）≥ 2被定義為差異表達(dá)基因。

1.2.5 GO富集與pathway分析 差異表達(dá)基因的GO富集分析利用R語(yǔ)言中的clusterProfiler包完成。小麥RefSeq v1.0參考基因組基因的GO注釋以及GO號(hào)的注釋下載自：EnsemblePlants（http：//plants.ensembl.org/index.html），pAdjustMethod：”BH”。獲得的主要基因利用Plant reactome（https：//plantreactome.gramene.org/index.php?lang=en）網(wǎng)站進(jìn)行pathway富集分析。

1.2.6 T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株鑒定 對(duì)T1代未發(fā)生編輯的QA147-1，QA167-2和QA167-7三個(gè)株系的TaAGO4a基因編輯材料幼苗進(jìn)行不同濃度的尼克酰胺處理，在處理7 d時(shí)取樣，然后處理14 d時(shí)再次進(jìn)行取樣，對(duì)取得的樣品用DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）從植株葉片中提取基因組DNA，并用barF（ACCATCGTCAACCACTACATCG）和barR（GCTGCCAGAAACCACGTCATG）引 物 對(duì)bar基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.7 T1代和T2代轉(zhuǎn)基因植株突變類(lèi)型檢測(cè) 首先利用TaAGO4a基因的通用引物AGO4a486F和AGO4a1404R對(duì)陽(yáng)性的TaAGO4a基因編輯轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析（PCR-RE）檢測(cè)突變類(lèi)型。PCR-RE具體步驟是首先利用普通2×Taq MasterMix，擴(kuò)增陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的靶點(diǎn)序列（GCACACGCAAGAAGCCATTC），然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶XmnI酶切2 h，最后用濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，根據(jù)酶切片段的大小和數(shù)目判斷轉(zhuǎn)基因植株的編輯類(lèi)型。然后對(duì)于編輯植株進(jìn)一步利用3A，3B和3D三個(gè)基因組的特異性引物進(jìn)行PCR-PE實(shí)驗(yàn)，其中3A基因組特異性引物為AGO4a486F和Ago4aA1629R；3B基因組為Ago4aB749F和AGO4a1404R；3D基因組為Ago4aD698F和AGO4a1404R，并對(duì)酶切后的PCR產(chǎn)物送由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行突變體測(cè)序，所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列表

2 結(jié)果

2.1 組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

丁酸鈉處理的小麥幼苗在7 d和14 d時(shí)幾乎都不能生長(zhǎng)（圖1-A），丁酸鈉嚴(yán)重抑制小麥的生長(zhǎng)，因此不適合用于小麥幼苗的處理。尼克酰胺處理在初期（7 d內(nèi)），小麥幼苗生長(zhǎng)落后于野生型對(duì)照組，但差異不顯著。而且2.5 mmol/L和5 mmol/L兩個(gè)濃度處理之間的差異也不顯著（圖1-B和1-D）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組與對(duì)照組在14 d時(shí)無(wú)顯著差異（圖1-C和1-D）。因此尼克酰胺處理對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響較小。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與比對(duì)情況評(píng)估

RNA-seq的建庫(kù)質(zhì)量及測(cè)序質(zhì)量會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析產(chǎn)生較大影響，因此對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控與評(píng)估十分重要。尼克酰胺（0 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L）處理7 d和14 d每個(gè)處理設(shè)置兩個(gè)重復(fù)共12組樣本，共95 Gb下機(jī)數(shù)據(jù)。利用Trimmomatic數(shù)據(jù)過(guò)濾共獲得約5000萬(wàn)個(gè)Clean reads；FastQC軟質(zhì)控結(jié)果顯示Q30大于92%；將Clean reads比對(duì)到小麥RefSeq v1.0參考基因組，樣本完全比率均在90%以上（表2）。質(zhì)控及比對(duì)結(jié)果顯示下機(jī)數(shù)據(jù)可以很好的滿(mǎn)足后續(xù)分析的需求。

圖1 不同的組蛋白乙?；种苿?duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與比對(duì)情況統(tǒng)計(jì)

2.3 相關(guān)性分析

利用R語(yǔ)言繪制PCA圖展示各樣本間以及同一處理不同重復(fù)的相關(guān)性（圖2）。第一個(gè)主成分PC1占投影特征的方差比例為60%，第二個(gè)主成分PC2占了23%的方差比例，兩者一起可以滿(mǎn)足我們的閾值。而且可以直觀的看到同一處理不同重復(fù)聚類(lèi)在一起，說(shuō)明重復(fù)間相關(guān)性較高，相同的時(shí)間處理也存在相關(guān)性。

圖2 主成分分析圖

2.4 基因差異表達(dá)分析

利用R語(yǔ)言的DEseq2包研究不同尼克酰胺處理的差異表達(dá)基因，依據(jù)校正后的P-value ＜ 0.05和差異變化倍數(shù)≥ 2，即2倍的差異變化的規(guī)則來(lái)定義差異表達(dá)基因。其中LFC ＞ 0表示基因表達(dá)上調(diào)，LFC ＜ 0表示基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)果顯示，t7d-2.5和t7d-5分別與ctrl7d相比時(shí)差異表達(dá)基因有997和863個(gè)，其中有791和662個(gè)上調(diào)基因；另外，t14d-2.5和t14d-5與ctrl14d相比有144和318個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因的數(shù)目分別是88和148個(gè)（圖3-A），t7d-2.5組中差異表達(dá)基因數(shù)目最多，t14d-2.5組最少。相同濃度下（2.5 mmol/L或5 mmol/L），尼克酰胺處理7 d的差異表達(dá)基因數(shù)目遠(yuǎn)多于處理14 d，說(shuō)明處理前期對(duì)小麥幼苗影響更大，這個(gè)結(jié)果與尼克酰胺處理14 d時(shí)小麥幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)基本恢復(fù)到對(duì)照組一樣完全一致，因此與尼克酰胺處理相關(guān)的基因應(yīng)該可以限定在處理7 d的差異基因中。處理時(shí)間相同情況下，t7d-2.5與t7d-5差異表達(dá)基因在數(shù)目上相差較少，且兩組有700個(gè)基因是相同的；而處理14 d，t14d-5組中差異基因數(shù)目比t14d-2.5多一倍，其中113個(gè)基因是相同的（圖3-B）。

圖3 差異表達(dá)基因分析

2.5 GO富集與pathway富集分析

GO（Gene ontology）即基因功能富集分析，是對(duì)基因在不同維度和不同層次上的描述。對(duì)基因的描述一般從3個(gè)層面進(jìn)行：Cellular component（CC，細(xì)胞成分）、Biological process（BP，生物學(xué)過(guò)程）、Molecular function（MF，分子生物功能）。為了進(jìn)一步研究不同處理時(shí)間對(duì)小麥轉(zhuǎn)錄組的影響，我們對(duì)7 d（t7d-2.5和t7d-5）和14 d（t14d-2.5和t14d-5）的所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析（圖4，表3）。

對(duì)GO富集分析圖中主要terms進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)（表3）。尼克酰胺直接相關(guān)的“nicotianamine synthase activity term”、“nicotianamine biosynthetic process term” 集中出現(xiàn)在幼苗處理7 d，處理14 d未富集到這兩條terms，且上述兩terms內(nèi)基因均下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明處理7 d以?xún)?nèi)的幼苗對(duì)尼克酰胺更加敏感。相比于7 d，14 d富集到的GO term主要為小麥生長(zhǎng)常見(jiàn)term。尼克酰胺處理7 d的細(xì)胞分裂“cell division term”基因相對(duì)于對(duì)照組均表達(dá)上調(diào)，而處理7 d的甲基轉(zhuǎn)移酶“O-methyltransferase activity term”的基因則表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)?！皌ransaminase activity term”氨基轉(zhuǎn)移通路基因也在7 d處理后相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)上調(diào)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，上述主要terms中所含基因共25個(gè)（不含重復(fù)）。

我們對(duì)上述中的terms中所涉及的基因使用Plant Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行pathway富集分析。通過(guò)整合基因組、生化系統(tǒng)和化學(xué)分子等方面的數(shù)據(jù)，系統(tǒng)的分析基因產(chǎn)物功能，根據(jù)功能將這些注釋的pathway分為細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理、環(huán)境信息通路、新陳代謝和生物有機(jī)系統(tǒng)5個(gè)類(lèi)別（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)“transaminase activity term”內(nèi)基因關(guān)聯(lián)到多條與氨基酸代謝相關(guān)的pathway，其中賴(lài)氨酸合成VI通路包含在內(nèi)（圖5）。

2.6 T1代TaAGO4a基因編輯材料陽(yáng)性檢測(cè)及突變類(lèi)型檢測(cè)

對(duì)T1代 分 別 來(lái) 自QA147-1，QA167-2和QA167-7三個(gè)株系的TaAGO4a基因編輯材料幼苗取樣提DNA，并進(jìn)行PCR和PCR-RE檢測(cè)。共檢測(cè)47株材料，PCR擴(kuò)增bar基因發(fā)現(xiàn)39株轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性（圖6-A）。利用通用引物對(duì)AGO486F和AGO1404R擴(kuò)增這些陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的靶點(diǎn)序列并用限制性?xún)?nèi)切酶XmnI酶切對(duì)PCR產(chǎn)物酶切（PCRRE），檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，39株植株TaAGO4a基因均未發(fā)生編輯（圖6-B）。

圖4 差異表達(dá)基因（DEGs）GO富集分析

表3 主要GO trems統(tǒng)計(jì)表

2.7 尼克酰胺處理后T2代TaAGO4a基因編輯材料的陽(yáng)性檢測(cè)和突變類(lèi)型檢測(cè)

我們對(duì)上述T1代TaAGO4a基因編輯材料的陽(yáng)性植株的幼胚接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行尼克酰胺處理實(shí)驗(yàn)，總共接種了69個(gè)幼胚并全部成苗，0 mmol/L，2.5 mmol/L和5 mmol/L培養(yǎng)基上分別有19、32、18株苗。上述材料培養(yǎng)至7和14 d時(shí)分別進(jìn)行兩次取樣檢測(cè)，根據(jù)尼克酰胺處理時(shí)間與濃度共分為6組樣品（7-CK，7-2.5，7-5，14-CK，14-2.5，14-5）。首先對(duì)這些T2代植株檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)42株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株（圖7-A），0 mmol/L，2.5 mmol/L和5 mmol/L培養(yǎng)基上分別有12、18和12株陽(yáng)性。利用TaAGO4a基因通用引物（AGO4a486F和AGO4a1404R）對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR-RE檢測(cè)，結(jié)果顯示0 mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L處理7 d時(shí)都沒(méi)有檢測(cè)到編輯植株，0 mmol/L和2.5 mmol/L處理14 d時(shí)也沒(méi)有檢測(cè)到編輯植株，只有5 mmol/L濃度處理14 d檢測(cè)到1株雜合編輯植株（圖7-B），編輯效率為8.3%（表4）。

圖5 主要基因的Pathway分布圖

為了進(jìn)一步檢測(cè)這株突變體材料的的編輯類(lèi)型，我們分別利用3A，3B和3D三對(duì)特異性引物擴(kuò)增靶點(diǎn)序列（圖8），PCR-RE結(jié)果顯示該材料發(fā)生編輯的是3A和3B基因組，3D基因組未發(fā)生編輯（圖8-A），突變體測(cè)序顯示3A和3B基因組編輯類(lèi)型均為靶點(diǎn)處存在16 bp堿基缺失（圖8-B）。

圖6 T1代轉(zhuǎn)基因植株bar基因及突變類(lèi)型檢測(cè)情況

圖7 14 d T2代轉(zhuǎn)基因植株bar基因及突變類(lèi)型檢測(cè)情況

表4 各處理編輯情況統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 HDACi對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

Tiricz等［52］通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉和尼克酰胺處理后的玉米細(xì)胞生長(zhǎng)活力均未受到阻礙。而B(niǎo)ond等［49］利用丁酸鈉、TSA（Trichostatin A）和尼克酰胺3種HDACi處理擬南芥時(shí)發(fā)現(xiàn)尼克酰胺對(duì)擬南芥幼苗生長(zhǎng)的影響較小，丁酸鈉和TSA相對(duì)會(huì)抑制擬南芥生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)不同的組蛋白去乙?；种苿?duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響不同。不同濃度的丁酸鈉處理都嚴(yán)重抑了小麥幼苗的生長(zhǎng)。這說(shuō)明小麥幼苗對(duì)丁酸鈉反應(yīng)敏感并不適合用來(lái)處理小麥。不同濃度的尼克酰胺處理小麥幼苗，前期（約7 d）幼苗生長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢，但處理至14 d，處理與對(duì)照生長(zhǎng)并無(wú)明顯差異。雖然尼克酰胺處理前期會(huì)相對(duì)影響小麥苗的生長(zhǎng)，但隨生長(zhǎng)發(fā)育及小麥幼苗自身的調(diào)控作用適應(yīng)了尼克酰胺處理，即尼克酰胺處理不會(huì)阻礙幼苗后續(xù)生長(zhǎng)。因此用尼克酰胺處理小麥更合適。

3.2 尼克酰胺改變?nèi)旧w狀態(tài)候選基因的篩選

組蛋白乙?；馁?lài)氨酸是SWI2/SNF2亞家族染色質(zhì)重塑因子結(jié)構(gòu)域識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，組蛋白H3上甲基化的賴(lài)氨酸是ISWI亞家族染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合和識(shí)別的位點(diǎn)［58］，即賴(lài)氨酸與染色質(zhì)重塑因子作用相關(guān)。組蛋白尾部賴(lài)氨酸殘基的α-氨基乙?；且环N動(dòng)態(tài)的染色質(zhì)修飾。我們通過(guò)對(duì)主要GO富集轉(zhuǎn)氨基活性terms中差異表達(dá)基因的pathway富集分析發(fā)現(xiàn)這些參與轉(zhuǎn)氨基作用的基因與賴(lài)氨酸合成（Lysine biosynthesis VI）通路關(guān)聯(lián)密切，這說(shuō)明尼克酰胺處理可能與染色質(zhì)狀態(tài)有關(guān)。組蛋白修飾相關(guān)因子與甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt）相互作用是組蛋白修飾調(diào)控基因表達(dá)的重要手段。研究表明Dnmt可與組蛋白去乙?；福℉DAC）、共抑制因子（Co-repressor）和ATP依賴(lài)的染色質(zhì)重塑蛋白等結(jié)合形成抑制復(fù)合物，與組蛋白乙?；腿旧|(zhì)重塑共同作用，從而抑制基因表達(dá)［59-61］。抑制Dnmt的基因表達(dá)與組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑相關(guān)［62］，比如Dnmt3a可與HP1（Heterochromatin protein 1）相互作用，而HP1具有識(shí)別甲基化的組蛋白、穩(wěn)定異染色質(zhì)濃縮結(jié)構(gòu)的作用。因此，抑制Dnmt3a表達(dá)有利于促進(jìn)染色質(zhì)開(kāi)放［63］。本研究的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，尼克酰胺處理導(dǎo)致6個(gè)Dnmt基因下調(diào)表達(dá)，而Dnmt基因下調(diào)有利于染色質(zhì)開(kāi)放，因此尼克酰胺處理可能促進(jìn)染色質(zhì)開(kāi)放。開(kāi)放區(qū)域染色質(zhì)狀態(tài)相對(duì)松散，超過(guò)90%的開(kāi)放區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合相關(guān)且該區(qū)域細(xì)胞分裂活躍［22］。細(xì)胞分裂增強(qiáng)說(shuō)明DNA復(fù)制活動(dòng)增強(qiáng)，一般來(lái)說(shuō)染色質(zhì)的開(kāi)放性在復(fù)制后會(huì)得到不同程度的恢復(fù)［64］。本研究中處理7 d有4個(gè)細(xì)胞分裂基因表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明尼克酰胺處理有利于染色質(zhì)開(kāi)放，進(jìn)而有利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等表達(dá)活動(dòng)。綜上所述，尼克酰胺處理對(duì)染色質(zhì)開(kāi)放具有促進(jìn)作用。

圖8 突變體材料編輯類(lèi)型檢測(cè)

3.3 尼克酰胺處理和CRISPR/Cas9編輯效率的關(guān)系

Tiricz等［52］利用DNase I酶的敏感性發(fā)現(xiàn)5 mmol/L尼克酰胺和10 mmol/L丁酸鈉處理后染色質(zhì)狀態(tài)更加開(kāi)放，靶基因mGFP與ZmMEK1編輯效率更高。Bond等［49］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)5 mmol/L尼克酰胺處理14 d誘導(dǎo)VIN3基因表達(dá)水平最高。本實(shí)驗(yàn)利用尼克酰胺處理TaAGO4a基因的未發(fā)生編輯的基因編輯材料，結(jié)果顯示0 mmol/L，2.5 mmol/L和5 mmol/L處理7 d時(shí)都沒(méi)有檢測(cè)到編輯植株，而0 mmol/L和2.5 mmol/L處理14 d時(shí)也沒(méi)有檢測(cè)到編輯植株，只有5 mmol/L濃度處理14 d下檢測(cè)到1株A和B基因組均雜合編輯的植株，編輯效率從0提高到了8.3%。其中經(jīng)過(guò)對(duì)PCR-RE產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)3A基因組缺失了16 bp，而3B基因組則是在靶點(diǎn)處出現(xiàn)套峰，這說(shuō)明酶切還不夠徹底，然后利用DSDecodeM（http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/）分析發(fā)現(xiàn)3B基因組也缺失了16 bp［65］。因此5 mmol/L處理14 d是尼克酰胺處理小麥的最佳條件，這與之前在玉米和擬南芥中報(bào)道的最佳條件基本一致。這是首次在小麥中明確報(bào)道尼克酰胺可以促進(jìn)編輯效率，進(jìn)一步明確了尼克酰胺提高小麥基因編輯效率的可行性，也為提高小麥編輯效率提供了一種可行的新方法。

4 結(jié)論

相較于丁酸鈉，尼克酰胺對(duì)小麥生長(zhǎng)影響較小。尼克酰胺處理有利于小麥染色質(zhì)趨于開(kāi)放狀態(tài)，第一次明確尼克酰胺可以提高小麥基因編輯效率，且5 mmol/L尼克酰胺處理14 d是最佳條件，編輯效率從0提高到了8.3%，而且實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)基因組靶點(diǎn)的編輯。