數(shù)字PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉 可,李夢(mèng)霞,張 亮,康大成,扈曉杰,劉云國(guó),

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830046; 2.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東臨沂 276000; 3.東營(yíng)區(qū)科學(xué)技術(shù)局,山東東營(yíng) 257000; 4.臨沂小魯生物科技有限公司,山東臨沂 276000)

近年來,除食品中轉(zhuǎn)基因成分的安全性、產(chǎn)品標(biāo)示問題外,食品生產(chǎn)貯藏過程中微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病及食品成分摻假等食品安全事件也受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注,傳統(tǒng)方法難以滿足不斷提高的快速檢測(cè)要求,而精準(zhǔn)、快速、靈敏、穩(wěn)定的數(shù)字PCR技術(shù)則為食品相關(guān)檢測(cè)提供了新的思路和方法。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物鑒別定量[1-3]、肉制品中摻假種類及含量分析[4-6]、食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[7-8],建立高效可行的檢測(cè)方法并填補(bǔ)了相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的空白。本文回顧總結(jié)了數(shù)字PCR技術(shù)在食品轉(zhuǎn)基因成分、食品源性成分、微生物檢測(cè)中的應(yīng)用,并對(duì)其存在的問題進(jìn)行了分析。

1 數(shù)字PCR概述

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)是分子生物學(xué)研究中使用較多的方法,主要有普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)等。其中qPCR是目前常用的定性及定量基因分析技術(shù),但該方法需要使用標(biāo)準(zhǔn)品、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用循環(huán)閾值對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,不僅增大了工作量和檢測(cè)成本,在實(shí)際檢測(cè)過程也會(huì)造成一定誤差。

上世紀(jì)90年代Sykes等[9]將PCR技術(shù)、樣品稀釋、泊松分布計(jì)算方法結(jié)合,對(duì)白血病克隆的重排免疫球蛋白重鏈(IgH)基因進(jìn)行定量,這是數(shù)字PCR技術(shù)首次出現(xiàn)在大眾視野。1999年,Vogelstein等[10]稀釋分離單個(gè)分子后分別擴(kuò)增,然后使用熒光探針分析每種產(chǎn)物是否存在突變,檢測(cè)結(jié)腸直腸癌患者糞便中突變的ras基因來證明了其可行性,并首次提出了數(shù)字PCR的概念:數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR)是一種針對(duì)單分子目標(biāo) DNA 擴(kuò)增的絕對(duì)定量技術(shù)。

數(shù)字PCR工作原理在于將被標(biāo)記的樣品分割形成大量獨(dú)立的反應(yīng)體系,每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中不含或含有一個(gè)及以上待測(cè)靶標(biāo)序列,含有待測(cè)靶標(biāo)序列的為陽(yáng)性,不含待測(cè)靶標(biāo)序列的為陰性。在每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中對(duì)被標(biāo)記的樣品進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)后,含有待測(cè)基因靶標(biāo)的反應(yīng)體系中可檢測(cè)到熒光信號(hào),不含待測(cè)基因靶標(biāo)時(shí)沒有信號(hào)積累,讀取陰性、陽(yáng)性微滴的數(shù)量后傳至數(shù)據(jù)處理軟件得到最終結(jié)果[11]。與qPCR相比,數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)品也不借助循環(huán)閾值進(jìn)行分析,一定程度上彌補(bǔ)了qPCR的不足。

2011年后,數(shù)字PCR商業(yè)化迅速發(fā)展,其中兩種類型的數(shù)字PCR儀在研究中使用較多,一種是基于高密度微孔芯片的數(shù)字PCR(cdPCR),如Life Technologies品牌的QuantStudioTM3D Digital PCR System,每張芯片上含有20000個(gè)微孔,滿足檢測(cè)要求。另一種是利用油包水液滴作為載體的數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR),如Raindance公司的RaindropTM、Bio-Rad公司的QX200TM及QX100TM等。其中Bio-Rad公司的QX200TM是現(xiàn)階段最領(lǐng)先的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

數(shù)字PCR在定量分析過程中無需借助標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線,并且準(zhǔn)確度高,靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)方法及qPCR等方法,可達(dá)到qPCR方法的10倍甚至更高;在一定檢測(cè)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)偏差小,準(zhǔn)確度高,且不同實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)機(jī)構(gòu)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)小。其作為分子定量檢測(cè)中最可靠的方法之一,近年來在拷貝數(shù)定量、微生物檢測(cè)、檢驗(yàn)檢疫[12-14]、醫(yī)學(xué)診斷研究[15-19]、基因檢測(cè)[20]、資源環(huán)境科學(xué)[21-23]等領(lǐng)域均有研究,在食品相關(guān)檢測(cè)方面也有著巨大潛力。

2 食品轉(zhuǎn)基因成分分析

目前全球范圍內(nèi)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因食品中,以能夠滿足營(yíng)養(yǎng)要求且能夠更好適應(yīng)栽培條件的轉(zhuǎn)基因植物及以其為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品為主,市售轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類與數(shù)量快速增加,其安全性、標(biāo)識(shí)及市場(chǎng)管理問題等都亟需解決。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)主要采用基于外源核酸序列的qPCR技術(shù),為了更加快速準(zhǔn)確檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分,諸多研究者利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)不同植物轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法進(jìn)行研究。

Morisset等[1]最早建立了利用數(shù)字PCR同時(shí)檢測(cè)2種轉(zhuǎn)基因玉米基因拷貝的絕對(duì)數(shù)量的方法,得到測(cè)定的靈敏度及檢測(cè)范圍明顯優(yōu)于cdPCR及qPCR方法,證實(shí)了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中的可行性及優(yōu)勢(shì)。朱鵬宇、繆青梅等研究者分別建立了雙重ddPCR檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt汕優(yōu)63和抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻G6H1進(jìn)行研究,樣品中轉(zhuǎn)基因成分占總質(zhì)量0.5%時(shí)也可得到精確結(jié)果[24-25]。Deng等[2]對(duì)水稻的不同基因進(jìn)行了評(píng)估和對(duì)比,基于SPS、RBE4和ppi-PPF基因建立的ddPCR系統(tǒng)精確可靠,絕對(duì)定量檢測(cè)限(Limit of Quantitation,LOQ)為10～20拷貝/反應(yīng),可以重復(fù)定量并精確地在LOQ之上對(duì)水稻的三個(gè)內(nèi)源基因進(jìn)行定量,含量低至0.1%時(shí)比采用相同探針和引物進(jìn)行檢測(cè)的qPCR體系更為準(zhǔn)確。于曉帆等[3]用轉(zhuǎn)基因大豆DAS-44406-6的5′端邊界序列及l(fā)ectin基因,對(duì)其定量檢測(cè)(總DNA模板濃度為50 ng/反應(yīng)時(shí)),相對(duì)靈敏度檢測(cè)方法能對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的樣品準(zhǔn)確定量;絕對(duì)靈敏度檢測(cè)限可達(dá)到模板DNA質(zhì)量濃度0.01 ng/μL。此外還可利用特殊外源基因及內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物建立dPCR方法對(duì)油菜[26]、土豆[27]等轉(zhuǎn)基因作物及油類產(chǎn)品[28]進(jìn)行研究,最低檢測(cè)限可達(dá)到5個(gè)拷貝以下,絕對(duì)定量范圍均優(yōu)于qPCR方法。

在對(duì)dPCR方法檢測(cè)限、靈敏度的研究基礎(chǔ)上,Wang等[29]將轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1制成的米餅采用烘焙、油炸等不同方法處理后進(jìn)行分析,結(jié)果表明,ddPCR方法比qPCR方法更為靈敏,也不易受到加工過程中所產(chǎn)生的PCR抑制劑的影響,對(duì)深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定量更為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。Bogo?alec等[30]對(duì)不同復(fù)雜基質(zhì)飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè),得到的結(jié)果表明數(shù)字PCR技術(shù)可以檢測(cè)濃度較高的樣品,而使用qPCR方法則需稀釋180倍。當(dāng)樣品中有較高濃度色素、酸性物質(zhì)、重金屬等物質(zhì)及其他潛在抑制劑時(shí),數(shù)字PCR方法的檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確,避免了可能存在的“假陰性”現(xiàn)象,從而對(duì)深加工食品及復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行檢測(cè)與定量,對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物研究、市場(chǎng)監(jiān)督管理及轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)規(guī)范化進(jìn)程具有重要價(jià)值。此外,現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的已有的qPCR檢測(cè)方法中所采用的引物、探針可轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)中,具有較好的替代性[31],并且在cdPCR及ddPCR間的一致性及通用性較好[30,32]。

目前對(duì)轉(zhuǎn)基因作物成分進(jìn)行鑒定時(shí),雙重ddPCR及單重ddPCR方法的選擇存在一定爭(zhēng)議,兩種方法的穩(wěn)定性及檢測(cè)限均優(yōu)于qPCR,部分研究表明雙重PCR方法的檢測(cè)限略高于單重PCR[1,30],但其標(biāo)準(zhǔn)偏差較小且可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料和檢測(cè)時(shí)間,因此需要根據(jù)不同檢測(cè)靶標(biāo)及引物、探針進(jìn)行對(duì)比選擇。有研究者建立了多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)方法,同時(shí)檢測(cè)6、7、11個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因大豆,能夠節(jié)約大量成本及時(shí)間,為同一物種不同轉(zhuǎn)基因品系的快速檢測(cè)提供了新的思路[33]。此外,由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品安全性問題爭(zhēng)議較大,大部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要用于藥物生產(chǎn)或作為生物反應(yīng)器,僅2015年美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市了轉(zhuǎn)基因三文魚,國(guó)內(nèi)尚無轉(zhuǎn)基因動(dòng)物批準(zhǔn)上市[34]。有研究者對(duì)轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因山羊的數(shù)字PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了研究[35],證實(shí)了其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成分外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)中的可行性,但在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為原料的轉(zhuǎn)基因食品中尚無相關(guān)報(bào)道。對(duì)于轉(zhuǎn)基因微生物而言,有研究者利用數(shù)字PCR建立基因拷貝數(shù)與木聚糖酶活力的關(guān)系從而篩選高產(chǎn)木聚糖酶釀酒酵母[36],并無直接對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行的研究報(bào)道。轉(zhuǎn)基因微生物其在食品中的作用主要是生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物如酶制劑、食品添加劑等[37],近年來有發(fā)酵產(chǎn)物中出現(xiàn)未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因微生物的食品安全事件發(fā)生[38],已有研究者使用PCR方法及高通量測(cè)序方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行檢測(cè)[39-40],因此在未來檢測(cè)中可考慮使用數(shù)字PCR方法對(duì)產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行鑒別及定量,為轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)提供更多可能。

3 食品源性成分的鑒定

由于市場(chǎng)需求擴(kuò)大和原料價(jià)格上漲,部分企業(yè)或商家為減少成本獲得高利潤(rùn),加工過程中在食品中加入成本低廉的原料以次充好[41],因此對(duì)于食品源性成分快速準(zhǔn)確鑒定的需求與日俱增。目前常用檢測(cè)方法主要為qPCR法,該方法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線且易被抑制劑影響。數(shù)字PCR技術(shù)可以彌補(bǔ)這些不足,在檢測(cè)過程中直接通過每個(gè)反應(yīng)單元中有無熒光信號(hào)進(jìn)行判讀,從而計(jì)算目標(biāo)含量,逐漸被應(yīng)用于食品源性成分鑒定的研究中。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中,利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)食品中動(dòng)、植物源性成分主要有兩種技術(shù)路線:一種是以DNA濃度為中間值,建立源性成分質(zhì)量M與DNA拷貝數(shù)C之間的線性關(guān)系M=AC+B(A、B為常數(shù)),再根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。該方法適用于大部分食品中源性成分的檢測(cè),可檢測(cè)原材料復(fù)雜的食品中多種目標(biāo)源性成分[4]。Cai等[4]所建立的雙重ddPCR方法可同時(shí)檢測(cè)食品中牛肉及豬肉原料,具有良好的特異性和敏感性,在復(fù)雜基質(zhì)的樣品中也未觀察到熒光干擾現(xiàn)象,與前文所提到深加工食品中轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)結(jié)果一致,驗(yàn)證了數(shù)字PCR方法不易受抑制劑及復(fù)雜基質(zhì)的影響。Shehata等[5]將微滴數(shù)字PCR分析與內(nèi)部控制相結(jié)合,可在沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況對(duì)含有0.05%～1.0%(w/w)牛肉、火雞肉、豬肉、雞肉等肉類的食品及飼料等進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)。李瑋琦等[42]利用火雞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3基因序列,建立了同時(shí)適用于cdPCR和ddPCR平臺(tái)的快速檢測(cè)方法,兩種方法均準(zhǔn)確檢測(cè)多種肉類混合產(chǎn)品中火雞肉質(zhì)量占5%及以上的產(chǎn)品,準(zhǔn)確性良好,也證實(shí)了同一方法在不同數(shù)字PCR平臺(tái)間的通用性?；谶@種路線,不僅可以檢測(cè)肉制品摻假情況，鑒別不同肉制品種類并對(duì)其定量[43-45],還能對(duì)植物源性成分進(jìn)行檢測(cè),并準(zhǔn)確定量及定性分析植物飲料中摻假情況[46-47]。

另一種路線則是根據(jù)兩種不同源性成分實(shí)際拷貝數(shù)來計(jì)算,不需要以DNA濃度為中間值。以任君安等[48]對(duì)羊肉和豬肉的檢測(cè)為例,通過ddPCR測(cè)定單位質(zhì)量下羊肉和豬肉的基因拷貝數(shù)之比k,得到豬肉與羊肉質(zhì)量之比Mp:Mm=k Qp:Qm,(Qp為豬基因拷貝數(shù),Mp為豬肉質(zhì)量,Qm為羊基因拷貝數(shù),Mm為羊肉質(zhì)量),最后用實(shí)際測(cè)得的拷貝數(shù)來計(jì)算羊肉和豬肉的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)證明數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)于羊肉中摻雜豬肉的含量檢測(cè)具有很好的檢測(cè)效率,可檢測(cè)到羊肉中豬肉含量1%的產(chǎn)品,在相對(duì)定量檢測(cè)范圍5%～80%(w/w)之間絕對(duì)誤差小。該團(tuán)隊(duì)還對(duì)綿羊及山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量進(jìn)行了定量,比qPCR方法更準(zhǔn)確;且在不同熱處理和高壓下均有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,不同部位的肉對(duì)ddPCR方法的定量準(zhǔn)確性也沒有影響[49]。劉立兵等[6]通過類似的方法對(duì)牛肉/豬肉人工混合樣本和市售牛肉制品中的豬肉成分進(jìn)行定量,結(jié)果良好,也證實(shí)了該方法的可行性。此外,數(shù)字PCR方法還可對(duì)食品成分的來源進(jìn)行鑒定,可用于地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。Scollo等[50]建立ddPCR方法鑒別橄欖油來源并定量DNA拷貝數(shù),最低測(cè)量值可達(dá)到稀釋度10-3,比原有的qRT-PCR方法低一個(gè)數(shù)量級(jí)。還有研究者在先前研究基礎(chǔ)上對(duì)銀鯧魚進(jìn)行鑒別及定量,可準(zhǔn)確分辨銀鯧魚及其他具有高度同源序列的魚類,實(shí)驗(yàn)得到ddPCR的絕對(duì)檢測(cè)限為2 copies/μL,與其他肉類檢測(cè)結(jié)果的1～5 copies/μL相近,對(duì)魚肉及DNA混合物的敏感性分別為0.1%和0.5%(w/w),且靈敏度是qPCR的156倍[51]。

以上研究表明,在食品源性成分的定性及定量過程中,數(shù)字PCR方法可對(duì)較低含量成分進(jìn)行鑒別、定量,靈敏度及穩(wěn)定性優(yōu)于qPCR;抑制劑、加工條件及采樣部位對(duì)其重復(fù)性和穩(wěn)定性影響較小,能夠大幅提高食品摻假及食品成分來源鑒別的準(zhǔn)確性,為食品抽檢及大規(guī)模檢測(cè)提供更高效的方法,進(jìn)一步推動(dòng)食品質(zhì)量與安全管理。但食品加工過程中,長(zhǎng)時(shí)間高溫(超過15 min)或超聲波處理(超過10 min)及分析過程中限制性內(nèi)切酶的作用會(huì)使部分目標(biāo)DNA降解,影響擴(kuò)增效率導(dǎo)致最終讀數(shù)低于實(shí)際值,因此在分析過程中需要將DNA降解率降到最低[5,49]。

4 食源性致病微生物快速檢測(cè)

可引起食源性疾病的微生物是影響食品安全的主要因素之一,如沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等。這些微生物廣泛存在于肉制品、奶制品、水產(chǎn)品、蔬菜等多種食品中,是引起食物中毒的主要致病微生物。盡管食品加工過程中對(duì)微生物污染嚴(yán)格控制,但仍無法完全避免食品污染引起的疾病或食品腐敗,甚至影響公眾健康,同時(shí)也為企業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。因此,對(duì)食品原料、加工環(huán)境及最終產(chǎn)品中可能存在的微生物進(jìn)行有效檢測(cè)至關(guān)重要,對(duì)確保食品安全性及保障食品品質(zhì)具有重要意義。

趙麗青等[7]基于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌hly A基因建立了ddPCR檢測(cè)方法,得到計(jì)算公式為:初始濃度(CFU/g)=檢測(cè)數(shù)據(jù)(copies/μL)×25,檢出限可以達(dá)到90 CFU/mL,靈敏度非常高且重復(fù)性好,可高效、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中核細(xì)胞增生李斯特氏菌。此后,程逸宇等[8]針對(duì)乳制品建立了單增李斯特氏菌的檢測(cè)方法,LOD為5×102CFU/mL。趙新等[52]根據(jù)沙門氏菌invA 毒力基因序列對(duì)沙門氏菌進(jìn)行快速檢測(cè)并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,檢測(cè)靈敏度可達(dá)到102CFU/mL,模擬污染沙門氏菌的金針菇樣品實(shí)測(cè)與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法對(duì)比符合率100%,可以在保障準(zhǔn)確性的同時(shí)節(jié)省大量時(shí)間。Wang等[53]在其研究中也證明了數(shù)字PCR比qPCR節(jié)約2 h左右預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,且最低檢出限可達(dá)到102CFU/mL。周巍等[54]根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)體系,利用ddPCR方法對(duì)發(fā)酵乳中金黃色葡萄球菌nuc基因的檢測(cè)特異性和靈敏度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),檢測(cè)限可達(dá)到3.3×101CFU/g,定量檢測(cè)結(jié)果精確,特異性好。魏詠新等[55]建立的大腸桿菌O157∶H7的ddPCR檢測(cè)技術(shù)的最低定量限為4.2拷貝/反應(yīng),人工污染食品樣品的檢測(cè)限為110 CFU/g,適用于食品中高污染大腸桿菌O157∶H7的定量檢測(cè)應(yīng)用,為大腸桿菌O157∶H7的防控和監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。除致病微生物外,酸奶、玫瑰醬等發(fā)酵食品中含有大量益生菌,采用數(shù)字PCR技術(shù)可對(duì)其亞種進(jìn)行鑒別并測(cè)定含量[56-57]。

與食品行業(yè)傳統(tǒng)培養(yǎng)法及qPCR方法相比,數(shù)字PCR從提取微生物DNA到檢測(cè)完成僅需1 d,且靈敏度、精準(zhǔn)性及重復(fù)性優(yōu)于qPCR;數(shù)字PCR可使用雙重引物對(duì)微生物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別,也與RT-PCR方法[13-14]或疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)等預(yù)處理方式結(jié)合[58],提高檢測(cè)靈敏度,實(shí)現(xiàn)對(duì)較少數(shù)量活細(xì)胞的定量。數(shù)字PCR方法具有通過不同熒光信號(hào)、分區(qū)及信號(hào)通道改進(jìn)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)準(zhǔn)確量化的可能性[30,59],在對(duì)致病微生物單獨(dú)檢測(cè)的研究基礎(chǔ)上,可以設(shè)計(jì)針對(duì)不同探針或特異性基因片段的體系實(shí)現(xiàn)樣品中不同致病微生物的同時(shí)檢測(cè),提升食品安全檢測(cè)的效率,對(duì)食品原料及加工過程中微生物的檢測(cè)、利用及標(biāo)準(zhǔn)化控制提供有益參考。采用數(shù)字PCR方法僅能對(duì)食品中已知致病微生物進(jìn)行鑒別及定量,對(duì)于其他可能存在的未知微生物仍需采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行篩選鑒別。此外,有研究者發(fā)現(xiàn),數(shù)字PCR準(zhǔn)確定量的檢測(cè)限優(yōu)于qPCR一個(gè)數(shù)量級(jí),但當(dāng)樣品濃度過低時(shí)檢測(cè)結(jié)果偏差較大,這可能是由于當(dāng)樣品濃度過低時(shí)在體系中過于分散,以致添加模板吸液時(shí)各平行樣中核酸量有差異。因此在檢測(cè)前可能需要對(duì)樣品濃度進(jìn)行估計(jì),必要時(shí)要對(duì)樣品進(jìn)行富集。

5 前景與展望

與傳統(tǒng)方法相比,數(shù)字PCR技術(shù)在檢出限、穩(wěn)定性等方面具有較大優(yōu)勢(shì),但目前仍存在一些不足:商業(yè)化數(shù)字PCR儀器設(shè)備價(jià)格高,且需要芯片、微滴生成油等價(jià)格較高的特殊裝置來保證大量獨(dú)立反應(yīng)單元的形成,提高了檢測(cè)成本,這也是目前限制數(shù)字PCR技術(shù)大范圍應(yīng)用的主要因素;數(shù)字PCR也是基于普通擴(kuò)增的原理,無法避免常規(guī)PCR過程中也會(huì)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”結(jié)果;在操作過程中,生成微滴數(shù)量不達(dá)標(biāo)、產(chǎn)生氣泡、微滴破裂、引物保存不當(dāng)、污染等均會(huì)影響最終檢測(cè)結(jié)果,對(duì)操作人員及檢測(cè)過程有更高要求。因此,要優(yōu)化儀器來降低檢測(cè)成本、對(duì)操作人員進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)以避免操作誤差,從而提高數(shù)字PCR可用性。

總體而言,數(shù)字PCR方法在食品定量及定性分析方面具有巨大潛力,雖然存在一些問題,但隨著制造技術(shù)的發(fā)展、數(shù)字PCR儀的優(yōu)化以及檢測(cè)人員的專業(yè)化系統(tǒng)化培訓(xùn),數(shù)字PCR技術(shù)能夠在未來為科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用提供更多可能的方法,解決更多難題。數(shù)字PCR儀也將逐漸在基層檢測(cè)及研究機(jī)構(gòu)中投入使用,為食品安全檢測(cè)、食品質(zhì)量控制提供高效可行的手段,對(duì)于食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)制定及食源性疾病預(yù)防具有重要意義。